La eliminación parcial inmediata de los complejos cúmulo-ovocito: un enfoque refinado para la observación rápida de la fertilización in vitro

Resumen

Aquí, presentamos un método optimizado para eliminar rápidamente una porción de complejos cúmulo-ovocito después de la extracción de óvulos para acelerar el proceso de observación de FIV, reduciendo el tiempo requerido para la extracción de células de la granulosa, minimizando la exposición de ovocitos a elementos externos y no obstaculiza el desarrollo embrionario, mejorando en última instancia la eficiencia de los procedimientos de laboratorio de FIV.

Resumen

A pesar de los rápidos avances en las tecnologías clínicas y de laboratorio para la fertilización in vitro (FIV), una proporción significativa (10%-15%) de los pacientes continúan experimentando trastornos de la fertilización, lo que lleva a bajas tasas de fertilización y a la producción de embriones no viables. La fertilización a corto plazo implica la extracción temprana de las células de la granulosa para observar la extrusión del segundo cuerpo polar, lo que permite la evaluación de la fertilización y las medidas correctivas tempranas para abordar las bajas tasas de fertilización y el fracaso completo de la fertilización. Sin embargo, la observación de la fertilización a corto plazo en la FIV se ve obstaculizada por desafíos como los grupos excesivamente grandes de complejos cúmulo-ovocito sin procesar y la adhesión entre óvulos, lo que requiere procedimientos externos complejos para la eliminación de células de la granulosa y una duración prolongada de la observación. Para abordar este problema, este estudio propone un método de eliminación parcial inmediata de las células de la granulosa después de la extracción de óvulos. Este enfoque agiliza las etapas posteriores de la fertilización a corto plazo y el monitoreo tradicional de la fertilización, reduce el tiempo necesario para la extrusión de ovocitos, minimiza la probabilidad de impactos ambientales externos en los ovocitos y disminuye el riesgo de perder la ventana crítica de observación de la fertilización. En consecuencia, el estudio arroja nuevas evidencias clínicas destinadas a mejorar la eficiencia operativa de los laboratorios embrionarios en FIV.

Introducción

En el campo de la fecundación in vitro-transferencia de embriones (FIV-ET), la tasa típica de fecundación se sitúa entre el 60% y el 80%¹. Sin embargo, aproximadamente entre el 4% y el 16% de los casos presentan un fracaso completo de la fertilización o bajas tasas de fertilización, lo que presenta desafíos en la predicción ^2,3. Para mejorar los resultados clínicos del embarazo y disminuir la ocurrencia de no fertilización completa y baja fertilización, la utilización de la fertilización a corto plazo en los procedimientos de FIV está en aumento⁴. Este enfoque implica la extracción inmediata de las células de la granulosa para monitorear la extrusión del segundo cuerpo polar, evaluar el estado de fertilización y, potencialmente, realizar una inyección intracitoplasmática correctiva de espermatozoides (ICSI). La unión entre el complejo celular del cúmulo del ovocito (OCCC) y el ovocito es más fuerte durante la fertilización a corto plazo en comparación con la fertilización tradicional durante la noche, lo que aumenta el desafío de la eliminación de OCCC⁵. Factores como un exceso de número de ovocitos, grandes complejos OCCC o adherencias entre ovocitos pueden llevar a tiempos prolongados de eliminación de células de la granulosa durante la fertilización a corto plazo, extendiendo así el período que los óvulos permanecen fuera de la incubadora⁴. Para optimizar el período de observación de la fertilización, se ha diseñado un enfoque modificado después de la extracción de óvulos, que implica la extirpación parcial de las células de la granulosa de ovocitos con complejos OCCC significativos. Esta técnica ayuda a retener las células de la granulosa que rodean a los ovocitos, preservando la integridad de la estructura temprana del ovocito⁶ y permitiendo que estas células continúen suministrando factores vitales para la maduración del ovocito y la posterior unión de la fertilización al embrión⁷.

En consecuencia, este estudio se centra en los pacientes que se someten a un tratamiento de FIV-ET en un centro de medicina reproductiva como participantes en la investigación, con el objetivo de investigar el impacto de un método de escisión mecánica parcial inmediata de las células de la granulosa en la duración de los procedimientos para la fertilización a corto plazo y el monitoreo de la fertilización nocturna, al tiempo que evalúa los resultados de la fertilización normal y el desarrollo en etapa tardía. Esta investigación pretende ofrecer información valiosa para mejorar los procedimientos de laboratorio de embriones en la FIV.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos operativos estándar del Departamento de Medicina Reproductiva del Hospital Popular de Meizhou y estuvieron sujetos a revisión por parte del Comité de Ética del mismo departamento. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada pareja participante. El estudio incluyó participantes que se sometieron a su primer ciclo de FIV con escisión o transferencia de embriones en etapa de blastocisto, así como mujeres de entre 20 y 45 años de edad. Los criterios de exclusión incluyeron el uso de óvulos/esperma de donante y condiciones específicas como anomalías uterinas congénitas o secundarias (p. ej., útero tabicado, útero unicornio, didelfia uterina), adenomiosis, fibromas submucosos uterinos o grosor endometrial inferior a 7 mm el día de la transferencia embrionaria. Un total de 115 pacientes inscritos entre diciembre de 2023 y febrero de 2024 se estratificaron en dos grupos en función de si se realizó la retirada parcial inmediata de OCCC.

1. Preparación antes de la extracción de ovocitos

1. Coloque las placas de recogida de ovocitos (Tabla de materiales) en la incubadora a 37 °C durante la noche.
2. Incubar 12 mL de medio manipulador de folículos (Tabla de Materiales) en tubos de ensayo de fondo redondo de 14 mL a 37 °C durante la noche. Transfiera los tubos a la gradilla de tubos de ensayo precalentada 30 minutos antes de la extracción de ovocitos.
3. Preparación del medio de manipulación de folículos: Añadir 9 mL de medio de manipulación de folículos a un tubo de ensayo de fondo redondo de 14 mL (Tabla de Materiales) e incubar a 37 °C durante la noche. El día de la extracción de ovocitos, transfiera 4,5 mL del medio a una placa de recogida de ovocitos preincubada (Tabla de Materiales) cubierta con 2 mL de aceite de parafina 100%.
4. Preparar la solución de lavado OCCC: Añadir 4,5 mL de medio fertilizante (Tabla de Materiales) a una placa de recogida de ovocitos e incubar a 37 °C durante la noche.
5. Preparar el medio de fertilización: Agregar 1 mL de medio de fertilización a un plato de 6 cm cubierto con aceite de parafina 100% (Tabla de Materiales) e incubar a 37 °C durante la noche.
6. Preparar las pipetas Pasteur de vidrio (Tabla de Materiales): Desafilar suavemente y redondear las puntas quemándolas en una lámpara de alcohol durante unos 5 s (Figura 1). Coloque un cabezal de succión en la punta de las pipetas Pasteur, asegurándose de que pueda tocar el fondo del plato sin rayarse. Enjuague el vidrio, las pipetas Pasteur y los platos de 10 cm con un medio de manipulación de folículos.

2. Extracción de ovocitos y extirpación parcial inmediata de OCCC

NOTA: Utilice un microscopio estereoscópico durante el aislamiento de ovocitos y los procedimientos de extracción de OCCC. Para obtener resultados óptimos, todos los procedimientos deben realizarse en una mesa de calentamiento con control de temperatura (37 °C), y todo el equipo debe precalentarse 30 minutos antes de la extracción de ovocitos.

1. Recoger líquido folicular preovulatorio durante la extracción de ovocitos de acuerdo con las recomendaciones de la ESHRE⁸.
   1. En resumen, utilice una aguja de 17 G para extraer los ovocitos bajo la guía de una ecografía transvaginal. La presión negativa adecuada oscila entre 120 y 140 mmHg.
   2. Vierta el líquido folicular recogido en el tubo de ensayo de fondo redondo de 14 mL en un plato de 10 cm (Tabla de Materiales), manteniendo una profundidad de líquido inferior a 0,5 cm. Coloque el plato en una plataforma de temperatura constante (37 °C).
2. Observar el OCCC bajo un microscopio estereoscópico para confirmar la presencia de ovocitos y evaluar su madurez.
   NOTA: La madurez de la OOOC se evalúa en función de la morfología de las células del cúmulo y de la visibilidad de determinadas estructuras ovocitarias⁹.
3. Aspire el OCCC con una pipeta Pasteur de punta roma. Incline el plato de 10 cm unos 15 grados y extienda todos los OCCC grandes. Evite aspirar el ovocito y las células granulosas circundantes dentro de un radio de 2500 μm. Cortar el exceso de células de la granulosa con la pipeta Pasteur a lo largo del eje longitudinal (Figura 2). Los pasos detallados son los siguientes:
   1. Observe a simple vista si hay una masa mucoide translúcida grisácea en el líquido folicular. Si no se encuentra, busque rápidamente la masa mucoide translúcida grisácea girando en el sentido de las agujas del reloj desde el exterior hacia el interior bajo un microscopio estereoscópico, el OCCC.
   2. Confirmar si hay ovocitos en el OCCC y hacer una evaluación preliminar de la madurez de los ovocitos.
   3. A continuación, prepare previamente una pipeta de aspiración de silicona con una pipeta Pasteur redonda pulida a la llama, aspire el OCCC y, al mismo tiempo, levante suavemente la placa de cultivo en la posición de las 9-10 en punto con el dedo anular izquierdo de la mano que sujeta la placa de 10 cm, inclinando la placa de cultivo ligeramente unos 15° hacia la izquierda (colocar el dedo anular debajo de la placa es aproximadamente el ángulo requerido).
   4. Mientras escupe el OCCC aspirado en la posición de las 11 en punto del plato, alargénelo suavemente horizontalmente hacia la derecha. Luego, observe el tamaño de las células de la granulosa alrededor del OCCC expandido. A continuación, en la posición adecuada del OCCC alargado horizontalmente, utilice la pipeta Pasteur para realizar un corte descendente rápido y suave sobre el exceso de células de la granulosa de arriba a abajo.
4. Transfiera el OCCC cortado a un plato de recolección que contenga una solución de lavado de OCCC. Vierta el líquido folicular restante en un recipiente de muestra estéril (Tabla de materiales). Repita estos pasos hasta que se recojan todos los complejos.

3. Preparación del semen e inseminación in vitro

1. Recoger las muestras de semen por eyaculación en la mañana de la extracción de ovocitos. Evaluar la concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides bajo un microscopio óptico siguiendo los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2010)¹⁰. A continuación, transfiera el pellet de esperma a un nuevo tubo de centrífuga y lávelo dos veces en el medio de fertilización¹¹. Incubarlos al 6% de CO₂ y a 37 °C hasta que se necesiten.
2. Inseminar OCCCs con espermatozoides móviles de 1 x 10⁵ a 3 x 10^{5 5} por mililitro en una sola gota aproximadamente 2-3 h después de la recuperación en la placa de fertilización (Tabla de Materiales). Agregue 6-8 OCCC y 1 mL del medio de fertilización a la placa de fertilización.
   NOTA: Después de lavar los OCCC pegajosos, se transfieren a la placa de fertilización con una pipeta Pasteur. Suelte un OCCC a la vez, levantando la pipeta suavemente de la superficie líquida antes de soltar el siguiente, asegurándose de que cada OCCC se coloque individualmente en el plato para evitar que se agrupe.

4. Eliminación de células de cúmulos

1. Para la fertilización a corto plazo, siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Co-incubar los OCCC con espermatozoides durante 4-6 h. Después de la incubación, se extraen mecánicamente los cúmulos que rodean los ovocitos.
   2. Aspire los ovocitos con una pipeta con un diámetro interior ligeramente menor que el de los ovocitos para garantizar la eliminación completa de las células del cúmulo.
   3. Confirme la fertilización observando la presencia de dos cuerpos polares. Los ovocitos que muestran un segundo cuerpo polar se consideran fecundados.
   4. Identificar aquellos casos que no muestran el segundo cuerpo polar como fallos de fecundación, requiriendo ICSI de rescate.
2. Para una fertilización regular, después de 18-20 h de co-incubación, retire las células del cúmulo utilizando las pipetas para la evaluación de la fertilización.

5. Cultivo de embriones

1. Cultivo y seguimiento de los ovocitos fecundados durante 3-5 días después de la extracción de los ovocitos. Evaluar la fecundación a las 20 h post-inseminación para determinar el número de pronúcleos. Posteriormente, se cultiva cada cigoto individualmente en una gota mediana y se transfieren los embriones post-fertilización a un medio de escisión.
   NOTA: Un embrión ideal al tercer día debe constar de seis o más blastómeros del mismo tamaño y presentar una tasa de fragmentación menor o igual al 10%¹².
2. La decisión de proceder con el cultivo de blastocisto depende de las preferencias del paciente y de las circunstancias específicas, como la cantidad y calidad de los embriones obtenidos en el día 3. Transfiera los embriones del día 3 al medio blastocisto y evalúe el día 5. Utilice el sistema de puntuación de Gardner para evaluar los blastocistos, con blastocistos de alta calidad que tienen puntuaciones de ≥ 4 BB¹³.

6. Medición de resultados y análisis estadístico

1. Indique los datos continuos como la media ± la desviación estándar y exprese los datos ordinales como proporciones. Realizar análisis estadísticos utilizando la prueba t de Student o la prueba de chi cuadrado en un software de análisis de datos adecuado (en este caso, IBM SPSS Statistics). Considerar un nivel de significación de P < 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados

En el grupo sometido a procedimientos cortos de co-incubación, se excluyeron los pacientes que recibieron rescate. De las 47 pacientes que recibieron inseminación a corto plazo, no se observaron diferencias significativas en cuanto a la edad de las pacientes y el número de ovocitos recuperados (Tabla 1). La eliminación parcial inmediata de OCCC resultó en un aflojamiento de la OCCC restante alrededor de los ovocitos (Figura 3), lo que facilitó la detección de un segundo cuerpo polar. El tiempo promedio del procedimiento fue significativamente más corto en el grupo de extracción parcial de OCCC (4,42 ± 1,68 min vs. 9,29 ± 5,04 min, P < 0,001) en comparación con el grupo control, a pesar de que no se encontraron diferencias significativas en la tasa de escisión, la tasa embrionaria óptima y la tasa óptima de blastocisto.

En otra cohorte de 68 pacientes sometidas a fecundación in vitro (FIV) tradicional, en la que se realizaron controles de fecundación 18-20 h después de la inseminación, se observaron similitudes en la edad de las pacientes y en el número de ovocitos recuperados entre los dos grupos (Tabla 2). Se observó un aumento de la laxitud de la estructura de las células de la granulosa que rodea al ovocito en las pacientes que se sometieron a una retirada parcial inmediata de OCCC durante la extracción de óvulos (Figura 4). Aunque se observó un tiempo promedio de operación ligeramente más corto en la eliminación parcial del grupo OCCC (4,93 ± 0,80 min vs. 6,54 ± 7,77 min, P = 0,207), no se evidenció diferencia estadísticamente significativa. Si bien las adherencias estrechas en algunos casos podrían conducir a procedimientos de observación prolongados que superen los 40 minutos, las adherencias generalmente laxas de OCCC en la mayoría de los casos después del almacenamiento nocturno podrían explicar la falta de variación estadística en los tiempos de operación entre los dos grupos. Al igual que en el grupo anterior, no se identificaron discrepancias significativas en la tasa de escisión, la tasa óptima de embriones y la tasa óptima de blastocisto.

En general, los resultados representativos indican que la extirpación parcial inmediata de la OCCC acorta significativamente los tiempos de operación en los procedimientos de inseminación a corto plazo sin comprometer los resultados clave de la FIV, como la tasa de escisión, la tasa óptima de embriones y la tasa óptima de blastocisto. Esta técnica facilita la detección del segundo cuerpo polar al aflojar el OCCC restante alrededor de los ovocitos, lo que probablemente contribuye a reducir los tiempos de operación. En el contexto de los procedimientos tradicionales de FIV, aunque se observó una tendencia hacia tiempos de operación más cortos con la eliminación parcial inmediata de OCCC, la diferencia no fue estadísticamente significativa, posiblemente debido a la variabilidad inherente en la adhesión de las células del cúmulo después del almacenamiento durante la noche. Estos hallazgos sugieren que, si bien la extirpación parcial inmediata de OCCC puede mejorar la eficiencia del procedimiento, particularmente en contextos de inseminación a corto plazo, su impacto en los plazos tradicionales de FIV podría ser menos pronunciado.

Figura 1: Preparación de la pipeta Pasteur con un quemador de alcohol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imagen típica de OCCC que necesita ser procesada. Los ovocitos típicos con un diámetro superior a 2,5 mm de (A y B) dos pacientes se sometieron a una extirpación parcial a lo largo de la línea discontinua roja delineada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Micrografías típicas que muestran las características morfológicas de la fertilización 4-6 h después de la co-incubación con espermatozoides. Ovocito típico (A) con o (B) sin extirpación parcial de OCCC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Micrografías típicas que muestran las características morfológicas de la evaluación de los pronúcleos 18-20 h después de la co-incubación con espermatozoides. Ovocito típico (A) con o (B) sin extirpación parcial de OCCC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	Eliminación parcial del grupo OCCC	Grupo de control	Valor p
Pacientes (n)	26	21
Edad (y)	32.04 ± 4.11	33,33 ± 3,41	0.193
No. de ovocitos recuperados	12.85 ± 9.02	11.38 ± 5.32	0.493
Tiempo de procedimiento de 4 h (min)	4,42 ± 1,68	9.29 ± 5.04	<0,001
Tasa de escisión, n (%)	98.89 ± 0.04, 24	100.00 ± 0.00, 19	0.221
Tasa embrionaria óptima, n (%)	71.38 ± 35.46, 24	72.14 ± 35.72, 19	0.945
Tasa óptima de blastocitos, n (%)	58.13 ± 28.29, 19	65.18 ± 28.09, 12	0.504

Tabla 1: Comparación de los resultados de la fertilización entre los dos grupos con o sin la eliminación parcial inmediata de OCCC sometidos a procedimientos cortos de co-incubación.

	Eliminación parcial del grupo OCCC	Grupo de control	Valor p
Pacientes (n)	29	39
Edad (y)	32,21 ± 4,11	32,72 ± 4,25	0.619
No. de ovocitos recuperados	12.93 ± 7.00	12.44 ± 7.26	0.777
Tiempo de funcionamiento de 20 h (min)	4,93 ± 0,80	6,54 ± 7,77	0.207
Tasa de escisión, n (%)	98.81 ± 0.04, 28	95,93 ± 0,17,37	0.39
Tasa embrionaria óptima, n (%)	72.07 ± 36.75, 28	72.62 ± 30.01,36	0.948
Tasa óptima de blastocitos, n (%)	62.93 ± 28.30, 21	63.36 ± 24.61, 28	0.955

Tabla 2: Comparación de los resultados de la fertilización entre los dos grupos con o sin la extirpación parcial inmediata de OCCC sometida a la fertilización in vitro (FIV) tradicional.

Discusión

La extirpación parcial inmediata de las células de la granulosa puede acelerar el proceso de desintegración temprana de la fertilización a corto plazo, reducir el tiempo de observación del segundo cuerpo polar tanto en la fertilización a corto plazo como en la FIV convencional y no comprometer el desarrollo embrionario posterior. En la actualidad, los laboratorios de todo el mundo emplean diversas estrategias para mitigar los trastornos de la fecundación y las bajas tasas de éxito. El método preferido consiste en la extracción de las células de la granulosa para observar el segundo cuerpo polar 4-6 h después de la fertilización a corto plazo¹⁴. Los desafíos surgen debido a la estrecha adherencia entre los ovocitos y las células cúmulos circundantes, lo que dificulta la extracción mecánica con una pipeta. La recolección y el corte inmediatos de los ovocitos pueden mitigar este problema al reducir la adherencia y el volumen de OCCC, lo que acorta el tiempo de observación. Un paso crítico en el protocolo es la eliminación parcial inmediata de OCCC después de la extracción de óvulos, lo que ayuda a aflojar las células del cúmulo restante alrededor de los ovocitos para facilitar la detección del segundo cuerpo polar, que es crucial para evaluar el éxito de la fertilización. La pronta extracción reduce significativamente el tiempo de operación sin comprometer la tasa de escisión, la tasa óptima de embriones o la tasa óptima de blastocisto.

Las modificaciones sugeridas y la solución de problemas de la técnica de corte son las siguientes: (i) La fijación de la aguja se considera innecesaria, ya que conduciría a un tiempo extracorpóreo prolongado. En la práctica, representa un enfoque de corte conveniente. (ii) Centrándonos en el OCCC, se aconseja retener 3-4 células de la granulosa a cada lado que coincidan con el diámetro del ovocito. En el caso de la OCCC bilateral, es necesario cortar ambos lados; para OCCC unilateral, corte el lado con el OCCC. Uno puede aspirar a la simetría, aunque no necesariamente perfecta. (iii) Para evitar que los folículos se enrosquen e interrumpan el estado de dispersión, el líquido folicular en la parte superior de la placa debe ser lo suficientemente delgado durante el corte para evitar la flotación OCCC. (iv) El líquido folicular a menudo contiene componentes sanguíneos durante la extracción de ovocitos. Después del corte, se deben transferir rápidamente los folículos a un plato de lavado para mitigar el impacto de la contaminación de la sangre y continuar lavándolos después de la extracción de ovocitos.

La retención de las células del cúmulo después de la extracción parcial garantiza que los ovocitos reciban sustancias esenciales para el desarrollo embrionario temprano, como factores de crecimiento y aminoácidos, lo que promueve el desarrollo del^{embrión 15}. Estudios anteriores han demostrado que el cocultivo a largo plazo puede generar una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que conduce al endurecimiento de la zona pelúcida embrionaria y perjudica el potencial de los embriones. La eliminación parcial inmediata de las células de la granulosa, al tiempo que se retienen las células del cúmulo granuloso necesario, reduce la ROS por las células de la granulosa y el consumo de energía en los medios de cultivo¹⁶. Actualmente, no existe un consenso unificado sobre el momento y la proporción de la extracción de las células de la granulosa para la fertilización a corto plazo en la FIV. Los datos obtenidos en este estudio sugieren que la extracción inmediata de los ovocitos seleccionados a un diámetro OCCC de aproximadamente 2500 μm no obstaculiza el desarrollo embrionario posterior ni el proceso de observación para la fertilización FIV convencional y a corto plazo.

Una limitación importante de esta técnica es la posibilidad de variabilidad en el grado de adhesión entre los ovocitos y las células cúmulos, lo que puede afectar a la consistencia de los resultados. Además, si bien el enfoque de extirpación parcial inmediata reduce los tiempos de observación, requiere una ejecución precisa para evitar daños en los ovocitos o comprometer el desarrollo embrionario posterior. Se necesitan más experimentos para determinar la cantidad óptima de OCCC restante después del corte. Por ejemplo, investigar si contener alrededor de 2000 μm de OCCC y premarcar una escala en el plato de recolección podría mejorar la evaluación uniforme del tamaño y el rango de corte de OCCC.

En conclusión, esta técnica refinada no muestra efectos adversos significativos sobre la fertilización o el desarrollo embrionario, lo que la convierte en un método valioso para respaldar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
G-IVFT PLUS	Vitrolife	10136
OVOIL	Vitrolife	10029
G-MOPS PLUS	Vitrolife	10130
Antena parabólica Falcon 3003	Corning	353003
Antena parabólica Falcon 3001	Corning	353001
Falcon 2001 tubo	Corning	352001
Falcon 4013 taza	plato Corning	354013
Falcon 3037	Corning	351058
pipeta Pasteur	Darwin	D1150-5P