http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/es/66969Evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia

Summary

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Presentamos protocolos para la evaluación de la competencia de la vía de reparación de roturas de doble cadena en células utilizando un conjunto de sustratos reporteros extracromosómicos basados en luminiscencia.

Abstract

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La reparación de las roturas de doble cadena (DSB) del ADN es crucial para el mantenimiento de la estabilidad del genoma y la viabilidad celular. La reparación de DSB (DSBR) en las células está mediada por varios mecanismos: recombinación homóloga (HR), unión de extremos no homólogos (NHEJ), unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ) y recocido de cadena única (SSA). Los ensayos celulares son esenciales para medir la competencia y la modulación de estas vías en respuesta a diversos estímulos.

Aquí, presentamos un conjunto de ensayos reporteros extracromosómicos que miden la reconstitución de un gen reportero de nanoluciferasa por una de las cuatro vías principales de DSBR en las células. Tras la transfección transitoria en las células de interés, la reparación de los sustratos reporteros específicos de la vía se puede medir en menos de 24 h mediante la detección de la luminiscencia de la nanoluciferasa (NanoLuc).

Estos ensayos robustos son cuantitativos, sensibles, titulables y susceptibles a un formato de cribado de alto rendimiento. Estas propiedades proporcionan amplias aplicaciones en la investigación de la reparación del ADN y el descubrimiento de fármacos, complementando el conjunto de herramientas actualmente disponible de ensayos DSBR celulares.

Introduction

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Las roturas de doble cadena (DSB) del ADN representan una clase particularmente tóxica de daño en el ADN¹, debido a que las células han desarrollado múltiples vías de reparación de DSB (DSBR) para reparar estas lesiones. Los cuatro principales mecanismos DSBR son la recombinación homóloga (HR), la unión de extremos no homólogos (NHEJ), la unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ) y el recocido de cadena simple (SSA)^2,3. Las vías DSBR contribuyen al mantenimiento del desarrollo y la fisiología de los tejidos sanos y protegen contra enfermedades como el cáncer. Además, estos mecanismos de reparación tienen potencial terapéutico para el desarrollo de moduladores de moléculas pequeñas en oncología de precisión. Por ejemplo, dirigirse a la ADN polimerasa θ (Polθ), una enzima fundamental en la vía de reparación de MMEJ, ha atraído el interés debido a su letalidad sintética con la deficiencia de HR en el cáncer⁴.

Por lo tanto, la comprensión de la DSBR tiene amplias implicaciones clínicas y se necesitan ensayos celulares funcionales capaces de medir la actividad de todas las principales vías de la DSBR⁵. Los ensayos deben ser adecuados tanto para la interrogación genética como para la farmacológica y desplegarse en todos los modelos celulares de interés. Para respaldar los esfuerzos de descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas, los ensayos deben ser altamente sensibles, titulables, tener una respuesta rápida y ser escalables a formatos de alto rendimiento adecuados para el cribado de compuestos.

En general, DSBR se ha medido previamente utilizando sistemas de ensayo reportero basados en fluorescencia integrados de manera estable en el genoma celular⁶. Sin embargo, si bien la recapitulación fisiológica de la DSBR cromosómica es una ventaja distintiva, dichos ensayos se restringen a un modelo huésped en el que el reportero está integrado, utilizan una preparación de muestras y un análisis intensivos en mano de obra mediante citometría de flujo, y tienen un rendimiento, tiempo de respuesta, robustez y sensibilidad limitados, todas características esenciales necesarias para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.

Aquí describimos un conjunto de ensayos reporteros de DSBR que permiten la evaluación de las cuatro vías principales de DSBR. El conjunto de sustratos de ensayo reportero se describe en la Figura 1 y se describe con más detalle en una publicación reciente⁷. Son extracromosómicas, lo que permite su introducción en las células por transfección transitoria simple, y la incorporación de un gen reportero de nanoluciferasa⁸, que debe reconstituirse mediante la interacción con mecanismos específicos de DSBR, genera sensibilidad, robustez y escalabilidad. En el protocolo se incluyen las siguientes variantes de sustrato reportero DSBR (Figura 1):

MMEJ independiente de la resección: Este sustrato lineal está compuesto por una región central de ADN bicatenario (dsDNA) con salientes de ADN monocatenario (ssDNA), que imitan los extremos del ADN resecado⁹. Cuatro microhomologías de nucleótidos en el extremo de las regiones de ADNss codifican el codón de inicio para el gen reportero. La reparación de este sustrato a través de MMEJ restaura el marco de lectura abierto (ORF) del gen reportero.

MMEJ dependiente de la resección: El exón del gen reportero N-terminal está interrumpido por un segmento que contiene un codón de parada, que está flanqueado por 8 microhomologías de pares de bases (pb). La resección del extremo nucleolítico es necesaria antes de la reparación mediada por MMEJ para restaurar el gen reportero intacto.

Contundente NHEJ: El gen reportero se divide en secciones N-terminal y C-terminal, de las cuales esta última se coloca aguas arriba del promotor. El DSB se produce utilizando EcoRV y requiere una ligadura directa (sin procesamiento final) por NHEJ para que ambas porciones del gen reportero se vuelvan a unir y el ORF reportero se restaure.

NHEJ no contundente: El DSB se encuentra dentro de un intrón y tendrá extremos cohesivos o no cohesivos dependiendo de la elección de la enzima de restricción. La reparación de este sustrato por NHEJ requiere que la ligadura esté precedida por un procesamiento final.

Plantilla larga HR: El exón N-terminal del gen reportero es interrumpido por un segmento de ADN que contiene sitios de restricción, que reemplazan 22 pb de la secuencia original del gen reportero. Para restaurar esta secuencia, la reparación por HR utiliza la plantilla de homología de 2,5 kilobases (kb) colocada aguas abajo del exón C-terminal.

Plantilla corta de RRHH: El sitio de restricción necesario para generar el DSB reemplaza parte de la secuencia del gen reportero nativo e introduce un codón de parada en el marco. Al igual que la versión de plantilla larga, este sustrato HR requiere la plantilla de homología posterior (360 bp) para una reparación y restauración precisas del ORF informador.

SSA: Este sustrato contiene un codón de parada prematuro ubicado dentro del exón N-terminal del gen reportero. La eliminación de este codón de parada y el restablecimiento de la secuencia intacta del gen reportero requiere reparación por SSA, que implica la resección bidireccional de largo alcance antes de la alineación de las homologías.

Para la generación de la DSB, algunos de los sustratos reporteros se pueden digerir con I-SceI (Figura 1). Esto generará un sustrato lineal con extremos no cohesivos en los reporteros MMEJ dependiente de la resección, NHEJ no romo, HR de plantilla larga y SSA, que tienen sitios I-SceI en tándem en orientaciones invertidas. En el sustrato reportero de HR de plantilla corta, la digestión del sitio único I-SceI generará extremos cohesivos. Los plásmidos NHEJ no romos, MMEJ dependiente de resección, HR de plantilla larga y SSA también se pueden digerir con HindIII, lo que producirá extremos cohesivos complementarios.

Proporcionamos protocolos para la generación de los sustratos del ensayo reportero y describimos cómo se pueden realizar los ensayos, proporcionando detalles sobre cómo se pueden usar para cuantificar DSBR, incluidas las respuestas titulables a moléculas pequeñas, la evaluación de la potencia celular, la actividad en el objetivo y la selectividad de la vía.

Protocol

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1. Preparación y control de calidad (QC) de sustratos reporteros

NOTA: Los plásmidos que codifican los sustratos reporteros pueden propagarse en cepas estándar de Escherichia coli (por ejemplo, DH5α y derivados) y recuperarse mediante aislamiento de plásmidos. Los detalles del plásmido (tamaño y resistencia a los antibióticos) se describen en la Tabla 1 y la Figura 1.

Figura 1: Esquemas de ensayos reporteros DSBR extracromosómicos basados en NanoLuc. Representación esquemática de los sustratos reporteros de DSBR, incluida su ubicación dentro de cada plásmido fuente, las características de la secuencia principal y el diseño final después de la reparación específica de la vía. El núcleo del sustrato MMEJ independiente de la resección se extirpa del plásmido fuente mediante digestión con XhoI / HindIII, después de lo cual las tapas deben ligarse a ambos extremos para producir el sustrato para MMEJ. El sustrato indicador de NHEJ romo se genera por escisión del plásmido fuente con EcoRV. Los sustratos MMEJ dependientes de la resección, NHEJ no romo, HR de plantilla larga y SSA reporteros se generan mediante la linealización de los plásmidos fuente utilizando I-SceI (que produce extremos no cohesivos) o HindIII (que produce extremos cohesivos). El sustrato reportero HR de plantilla corta se genera mediante la linealización del plásmido fuente utilizando I-SceI (que produce extremos cohesivos). La reparación de cada sustrato reportero por la vía DSBR diana reconstituye un ORF nanoluciferasa intacto que codifica NanoLuc funcional. Esta figura fue adaptada de Rajendra et ^al.7. Abreviaturas: DSBR = reparación de rotura de doble cadena; NanoLuc = Nanoluciferasa; MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; NHEJ = unión de extremos no homólogos; HR = recombinación homóloga; SSA = recocido de una sola hebra; ORF = marco de lectura abierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de sustrato reportero MMEJ independiente de la resección (Figura 1 y Figura 2A-C)
   1. Preparación de los tapones de ssDNA/dsDNA (Figura 2A)
      1. Vuelva a suspender los cuatro oligonucleótidos enumerados en la Tabla 2 individualmente en un tampón de recocido (20 mM de Tris pH 7,5, 50 mM de NaCl en agua de grado de biología molecular) para generar una solución madre a 100 μM.
      2. Recocido de tapones de ss/dsDNA
         1. Mezclar 50 μL de cada uno de los oligonucleótidos largos y cortos (100 μM de solución madre) para el tapón izquierdo del paso 1.1.1.1 en un tubo de 0,2 mL.
         2. Repita para los oligonucleótidos de la tapa derecha.
         3. Con un termociclador, incube cada mezcla de oligonucleótidos a 99 °C durante 5 min y luego baje a 10 °C a 1 °C/min.
            NOTA: Esto producirá las tapas izquierda y derecha recocidas.
      3. (Control de calidad, opcional) Verificación del recocido de oligonucleótidos por electroforesis
         1. Electroforese 100 ng de cada producto del paso 1.1.1.2 junto con oligonucleótidos individuales del paso 1.1.1.1 y una escalera de ADN de bajo peso molecular en un gel de acrilamida-Tris-Borato-EDTA (TBE) al 20% a 200 V durante 80 min.
         2. Tiñir el gel con tampón de funcionamiento TBE que contenga un tinte de ADN fluorescente adecuado para la visualización de ssDNA y dsDNA durante al menos 10-15 min.
         3. Visualice la fluorescencia en un sistema de documentación de gel (Figura 2A).
            NOTA: Los pasos 1.1.1.3.1 a 1.1.1.3.3 se utilizan para verificar que las tapas se hayan recocido correctamente. Los tamaños aparentes para la tapa izquierda y la tapa derecha deben ser ~120 pb y ~175 pb, respectivamente.
   2. Purificación del núcleo del sustrato reportero (Figura 2B)
      1. Mezclar 100 μg del plásmido del núcleo reportero con 4 μL de HindIII y 4 μL de XhoI (4 U/μg de plásmido para cada enzima) y 20 μL de tampón 10x. Llevar el volumen total a 200 μL con agua bidestilada (ddH₂O) e incubar a 37 °C durante 2 h hasta toda la noche para digerir el plásmido.
         NOTA: Para la digestión de cantidades mayores o menores, escale la reacción proporcionalmente.
      2. Incubar la reacción de digestión a 80 °C durante 20 min para inactivar el calor de las enzimas de restricción.
      3. Añadir 40 μL de fosfatasa alcalina (2 U/μg de plásmido) y 27 μL de tampón 10x a la mezcla de reacción del paso 1.1.2.2. Incubar a 37 °C durante 2 h para desfosforilar el plásmido.
         NOTA: Escale la reacción hacia arriba o hacia abajo según sea necesario.
      4. Añadir 60 μL de colorante de carga 6x a la reacción del paso 1.1.2.3. Electroforesa junto a una escalera de ADN de alto peso molecular en un gel de agarosa-Tris-acetato-EDTA (TAE) al 1,5 % (p/v) que contiene una tinción fluorescente de dsDNA a 120 V durante 2,5 h o hasta que las bandas se resuelvan suficientemente.
      5. Visualice la fluorescencia en un sistema de documentación de gel (Figura 2B).
      6. Retire el fragmento de núcleo reportero (~1,5 kb) del gel con un bisturí limpio, teniendo cuidado de no contaminar con la columna vertebral del vector (~2,5 kb).
      7. Extraiga el fragmento de núcleo reportero utilizando un kit de extracción en gel, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      8. Medir la concentración y calidad del ADN (A_260/280) por espectrofotometría.
   3. Ligadura del núcleo del sustrato reportero con tapas de ssDNA/dsDNA y purificación del sustrato reportero final (Figura 2C)
      1. Mezclar 30 μg del fragmento de núcleo reportero del paso 1.1.2.7 con 3,85 μL de cada tapón recocido izquierdo y derecho del paso 1.1.2 (aprox. 6:1 relación molar de ADN tapón:núcleo), 30 μL de tampón ligasa 10x y 1,5 μL de ADN ligasa T4 (20 U/μg de ADN). Llevar el volumen total de la reacción a 300 μL con ddH₂O e incubar durante la noche a 16 °C para ligar los tapones al fragmento del núcleo reportero.
         NOTA: Aumente o reduzca la reacción según sea necesario.
      2. (Control de calidad, opcional) Electroforesar 200 ng del producto resultante del paso 1.1.3.1 junto con el núcleo del sustrato reportero y una escalera de ADN de alto peso molecular en un gel de agarosa-TAE al 0,7% (p/v) que contiene una tinción fluorescente de dsDNA a 120 V durante al menos 1,5 h. Verifique que la banda correspondiente al producto ligado migra a una velocidad ligeramente más lenta que el núcleo del sustrato reportero no ligado (Figura 2C).
         NOTA: Este paso de control de calidad es para verificar que la ligadura de las mayúsculas al fragmento del núcleo reportero se haya realizado correctamente.
      3. Purifique el ADN de la reacción de digestión en el paso 1.3.1. utilizando el método preferido (por ejemplo, un método basado en cordones o en columnas), siguiendo las instrucciones del fabricante.
         NOTA: El paso de purificación 1.1.3.3 reduce sustancialmente la presencia de tapas no ligadas.
   4. Medir la concentración y la calidad del ADN (A_260/280) mediante espectrofotometría.
2. Preparación del sustrato indicador de NHEJ romo (Figura 1 y Figura 2D,E)
   1. Mezcle 100 μg del plásmido del núcleo reportero con 5 μL de EcoRV (5 U/μg de plásmido) y 20 μL de tampón 10x. Llevar el volumen total a 200 μL con ddH₂O e incubar a 37 °C durante 2 h hasta toda la noche para digerir el plásmido.
      NOTA: Para la digestión de cantidades mayores o menores, escale la reacción proporcionalmente.
   2. Incubar la reacción de digestión a 65 °C durante 20 min para calentar la enzima de restricción inactiva.
   3. Añadir 50 μL de colorante de carga 6x a la reacción del paso 1.2.2. Electroforesa junto a una escalera de ADN de alto peso molecular en un gel de agarosa-TAE al 1,5% (p/v) que contiene una tinción fluorescente de dsDNA a 120 V durante 2 h o hasta que las bandas se resuelvan lo suficiente.
   4. Visualice la fluorescencia en un sistema de documentación de gel (Figura 2D).
   5. Elimine el sustrato reportero (~1,7 kb) del gel con un bisturí limpio, teniendo cuidado de no contaminar con la columna vertebral del vector (~2,6 kb).
   6. Extraiga el fragmento de núcleo reportero utilizando un kit de extracción en gel, siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 2E).
   7. Medir la concentración y calidad del ADN (A_260/280) por espectrofotometría.
3. Preparación de sustratos reporteros basados en I-SceI (Figura 1)
   NOTA: Estos sustratos incluyen MMEJ dependiente de la resección (Figura 2F), NHEJ no romo (Figura 2G), HR de plantilla larga (Figura 2H), HR de plantilla corta (Figura 2I) y SSA (Figura 2J).
   1. Mezclar 100 μg del plásmido del núcleo reportero con 50 μL de I-SceI (5 U/μg de plásmido) y 60 μL de tampón 10x. Llevar el volumen total a 600 μL con ddH₂O e incubar a 37 °C durante 2 h hasta toda la noche para digerir el plásmido.
      NOTA: Para la digestión de cantidades mayores o menores, escale la reacción proporcionalmente. Los plásmidos NHEJ no romos, MMEJ dependiente de la resección, HR de plantilla larga y SSA también se pueden digerir con HindIII, lo que generará extremos cohesivos complementarios.
   2. Incubar la reacción de digestión a 65 °C durante 20 min para inactivar el calor I-SceI. Ajuste la temperatura a 80 °C durante este paso si en su lugar se utilizó HindIII para la digestión.
   3. Purifique el ADN de la reacción de digestión inactivada en el paso 1.3.2 utilizando el método preferido (por ejemplo, un método basado en perlas o en columnas), siguiendo las instrucciones del fabricante.
   4. Medir la concentración y pureza del ADN A_260/280) por espectrofotometría.
4. Control de calidad de sustratos reporteros
   1. Electroforese 200 ng del sustrato reportero junto con una escalera de ADN de alto peso molecular en un gel de agarosa-TAE al 0,7% (p/v) que contiene una tinción fluorescente de dsDNA a 120 V durante 2 h o hasta que las bandas se resuelvan lo suficiente. Cargue el plásmido reportero original sin cortar al lado como control.
   2. Verifique que se observen las bandas definidas del tamaño correcto para cada sustrato reportero (consulte la Tabla 1 y la Figura 2F-J).

Figura 2: Análisis electroforéticos en gel de la generación de sustrato reportero DSBR. (A-C) Imágenes representativas del análisis electroforético en gel de los intermedios y la construcción final necesaria para la generación del sustrato reportero MMEJ independiente de la resección. Las imágenes adyacentes en los paneles (A) y (C) son de los mismos geles; Se han omitido carriles irrelevantes. (D,E) Imágenes representativas del análisis electroforético en gel para el plásmido fuente, los productos digeridos por EcoRV y la construcción final extraída en gel necesaria para la generación del sustrato indicador NHEJ contundente. (De F a J) Imágenes representativas del análisis electroforético en gel de plásmidos fuente y construcciones DSBR linealizadas para los sustratos reporteros digeridos por I-Sce: MMEJ dependiente de resección, NHEJ no romo, HR de plantilla larga, HR de plantilla corta, SSA. Abreviaturas: DSBR = reparación de rotura de doble cadena; MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; NHEJ = unión de extremos no homólogos; HR = recombinación homóloga; SSA = recocido de una sola hebra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Transfección transitoria de sustratos reporteros DSBR

NOTA: En la Figura 3 se describe una descripción general del flujo de trabajo experimental de los ensayos y algunas posibles permutaciones. El protocolo a continuación describe un experimento con células HEK-293, donde estas se transfectan inversamente con el sustrato reportero. Los números a continuación se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo de acuerdo con el número de pocillos que se utilizarán por placa. Los siguientes pasos se calculan para un ensayo realizado en una placa de 96 pocillos; consulte Discusión para obtener consideraciones adicionales.

Figura 3: Flujo de trabajo experimental para ensayos reporteros DSBR. Las células de interés se transfectan con el sustrato DSBR linealizado (que codifica un ORF de NanoLuc que necesita ser reparado a través de un evento específico de reparación del ADN) y un plásmido de luciérnaga (control de transfección). A continuación, 6-24 h después de la transfección, la luminiscencia Firefly y la luminiscencia NanoLuc se pueden leer secuencialmente tras la adición de los reactivos Nano-Glo Dual-Luciferasa. Se pueden utilizar ejemplos de permutaciones de los pasos principales (que se muestran en cuadros de color azul claro) para probar cómo la modulación genética (knockout, knockdown o sobreexpresión) o el tratamiento farmacológico afectan la competencia de la vía DSBR en las células. Abreviaturas: DSBR = reparación de rotura de doble cadena; NanoLuc = Nanoluciferasa; WT = tipo salvaje; KO = nocaut. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. (Opcional) Si se evalúa el impacto de los compuestos en el ensayo reportero, dispense los compuestos disueltos en el vehículo (por ejemplo, dimetilsulfóxido [DMSO]) en pocillos de una placa de 96 pocillos de acuerdo con un diseño experimental predefinido. Normalizar la concentración de vehículos en todos los pozos.
   NOTA: Se recomiendan réplicas técnicas. Incluya pozos de control (por ejemplo, solo para vehículos).
2. En un tubo de 1,5 mL, diluir el plásmido de control Firefly (luciferasa de control) y el sustrato reportero NanoLuc DSBR (luciferasa reportera) generados en los pasos 1.1, 1.2 o 1.3, en 500 μL de tampón de transfección. Utilice 0,66 μg de plásmido de luciferasa control por 1 × 10⁶ células. Consulte la Tabla 3 para conocer las cantidades de sustrato reportero NanoLuc DSBR a utilizar.
   NOTA: Un plásmido de control positivo que expresa constitutivamente la luciferasa reportera se puede utilizar para validar la configuración del instrumento y las condiciones de transfección o para comprobar efectos no específicos en la luciferasa reportera en sí. Como punto de partida, recomendamos 0,1 μg de plásmido luciferasa reportero y 0,66 μg de plásmido luciferasa control por 1 × 10⁶ células.
3. Añada un reactivo de transfección a base de lípidos al ADN diluido del paso 2.2 en la proporción recomendada por el fabricante (por ejemplo, 1:2, μg de reactivo de ADN:μL para el reactivo descrito en la Tabla de materiales), mezcle bien mediante vórtice brevemente e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Recolectar células por tripsinización, resuspenderlas en un medio fresco que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) y contarlas.
5. Transfiera 3 × 10⁶ células a un tubo de 15 mL y vuelva a suspender en 8,5 mL de medio.
6. Agregue la mezcla de transfección de ADN del paso 2.3 en la suspensión celular y mezcle varias veces por inversión.
7. Placa de 80 μL de suspensión celular (aproximadamente 2,7 × 10⁴ celdas) por pocillo.
   NOTA: La suspensión que contiene células y la mezcla de transfección de ADN se pueden dispensar en la placa pipeteando manualmente o utilizando un manipulador de líquidos automatizado para experimentos de mayor rendimiento.
8. Incubar a 37 °C/5% CO₂ durante 24 h.

3. Detección de luminiscencia

1. Preparación de reactivos
   1. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación y adición de reactivos de luciferasa reportero (NanoLuc) y control (Firefly), que proporcionan los sustratos para ambas luciferasas (Furimazina y 5′-Fluoroluciferina, respectivamente):
   2. Prepare el reactivo de luciferasa de control. Reconstituya de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezcle por inversión hasta que el sustrato de luciferasa se disuelva completamente.
   3. Prepare el reactivo de luciferasa reportero fresco de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Calcule la cantidad de reactivo necesaria para añadir 80 μL/pocillo y añadir sustrato a un volumen adecuado de tampón de ensayo en una proporción de 1:100 (sustrato de luciferasa:tampón). Para una placa de 96 pocillos, diluya 88 μL de sustrato de luciferasa en 8.800 μL de tampón y mezcle por inversión.
      NOTA: Estas cantidades incluyen un exceso aproximado del 10%. Una vez reconstituido, el reactivo de luciferasa de control puede almacenarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante para su uso futuro. El reactivo de luciferasa reportera debe prepararse fresco para cada uso.
2. Detección en serie de luminiscencia de luciferasas de control y reporteras (placa de 96 pocillos)
   1. Deje que la placa y los reactivos de luciferasa alcancen la temperatura ambiente.
   2. Añadir 80 μL de reactivo de luciferasa control por pocillo.
   3. Agite la placa durante 3 minutos en un agitador orbital a 450 rpm.
   4. Mida la señal de luminiscencia de luciferasa de control con un lector de placas de luminiscencia.
      NOTA: Lea la emisión a 580 nm (filtro de paso de banda de 80 nm) o la luminiscencia total por pocillo. Esta luminiscencia se utiliza como medida de la eficiencia de la transfección y la densidad celular y también puede informar sobre la toxicidad celular causada por los tratamientos de prueba.
   5. Añadir 80 μL de reactivo luciferasa reportera por pocillo.
      NOTA: Este reactivo inhibirá el control de la luciferasa; También contiene el sustrato para la luciferasa reportera.
   6. Agite la placa durante 3 minutos en un agitador orbital a 450 rpm.
   7. Deje reposar el plato durante 7 min a temperatura ambiente.
   8. Mida la señal de luminiscencia de luciferasa reportera con un lector de placas de luminiscencia.
      NOTA: Emisión de lectura a 470 nm (filtro de paso de banda de 80 nm) o, alternativamente, luminiscencia total por pocillo. Esta luminiscencia proporciona información sobre la cantidad de sustrato reportero que ha sido reparado por la vía DSBR de interés.
   9. Exporte lecturas de luminiscencia para análisis posteriores.

4. Análisis de datos

1. Divida la señal de luminiscencia de la luciferasa reportera (NanoLuc) por la señal de luminiscencia de la luciferasa de control (Firefly) que se origina en el mismo pocillo para calcular la señal del ensayo. Aplique ese cálculo a todos los pozos como se muestra en la ecuación (1).
   (1)
2. Calcule el promedio de las señales de ensayo para los pozos de control (por ejemplo, solo para vehículos).
3. Normalice las señales de ensayo para los pozos de prueba con el promedio del pozo de control utilizando la ecuación (2) para calcular la reparación (%) por pozo.
   (2)
4. (Opcional, ajuste de curva) Si prueba varias dosis de compuestos, trace la reparación calculada (%) contra la concentración del compuesto y ajuste una curva de dosis-respuesta utilizando un modelo de regresión no lineal. Utilice esta curva para la interpolación EC₅₀ posterior.

Representative Results

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La reparación de cada uno de los ensayos reporteros se puede detectar y cuantificar utilizando el mismo procedimiento. La reparación correcta de un sustrato por su vía de reparación afín en las células reconstituirá un ORF intacto y funcional que codifica NanoLuc. Esta señal de luminiscencia se puede detectar mediante un lector de placas.

La co-transfección con un plásmido intacto que codifica luciferasa Firefly sirve como control de transfección. Este control tiene dos propósitos. En primer lugar, proporciona un estándar para normalizar la señal de NanoLuc, ya que no debe ser perturbada por la modulación de DSBR por medios genéticos o farmacológicos. En segundo lugar, puede proporcionar una indicación de perturbaciones celulares fuera del objetivo que afectan a la señal de luciferasa, como la modulación del ciclo celular, los efectos sobre la transcripción/traducción o la toxicidad general.

La proporción de NanoLuc a Firefly sirve como una lectura sustitutiva de la reparación. Los valores de luminiscencia se pueden exportar y analizar normalizando las dos señales de luciferasa desde el mismo pocillo. En el caso de los estudios de perturbaciones genéticas (por ejemplo, comparando el tipo salvaje y el KO o el ARNip no objetivo y el objetivo), la reparación suele normalizarse a la muestra parental (células de tipo salvaje o células tratadas con siRNA de control no objetivo). En el caso de la modulación farmacológica, los valores de una muestra tratada con un compuesto se normalizan al valor producido por el tratamiento del vehículo.

Recientemente se ha publicado la validación completa del conjunto de reporteros descrito⁷. En la Figura 4 (adaptada ^{de 7}) se muestran los datos que ejemplifican la caracterización de la modulación genética y farmacológica de la DSBR. Polθ es el mediador clave de MMEJ y se predice que la pérdida o inhibición de esta enzima ablaciona específicamente MMEJ^{celular 3,10}. Utilizando una línea celular en la que POLQ, el gen que codifica Polθ, ha sido eliminado¹¹, el ensayo reportero de MMEJ independiente de la resección demuestra que MMEJ está de hecho casi completamente suprimido. La evaluación de las señales de luminiscencia de los componentes NanoLuc y Firefly muestra que el defecto de reparación observado es impulsado por una reducción en la señal de NanoLuc (codificada por el sustrato reportero) mientras que la señal de Firefly (control) no se altera (Figura 4A-C). Por el contrario, la evaluación de la competencia de NHEJ utilizando el reportero NHEJ de extremo romo demuestra que el knockout de POLQ no inhibe la reparación del sustrato reportero (Figura 4D-F). En conjunto, estos datos genéticos respaldan el papel específico de Polθ en la reparación mediada por MMEJ. Estas observaciones se recapitulan farmacológicamente con ART558^12,13, un inhibidor altamente potente y específico del dominio polimerasa de Polθ recientemente reportado (Figura 4G), donde se observa una inhibición titulable de MMEJ, que se deriva de una disminución específica en la señal de NanoLuc y no de la Firefly (Figura 4H). Además, y de acuerdo con los datos genéticos, no hay ningún efecto sobre la NHEJ (Figura 4I,J). En conjunto, estos datos ponen de manifiesto cómo se pueden utilizar estos reporteros para caracterizar la modulación genética de las vías DSBR y mostrar la potencia celular y la especificidad de la diana/vía de las moléculas pequeñas.

Figura 4: Efectos del knockout genético y la inhibición farmacológica de Polθ en las señales reporteras de MMEJ y NHEJ. Las células WT y POLQ^(-) de eHAP1 se transfectaron con un plásmido de control Firefly y con (A-C) el reportero MMEJ independiente de la resección o el reportero NHEJ de extremo romo (D-F). El porcentaje de reparación de MMEJ o NHEJ es la relación entre la luminiscencia de NanoLuc y la luminiscencia de Firefly, normalizada al control tratado con DMSO, 24 h después de la transfección. Los datos representan la media ± SEM de tres réplicas biológicas, cada una con un promedio de 8 réplicas técnicas. Las células HEK-293 se transfectaron con un plásmido de control Firefly y (G,H) el reportero MMEJ independiente de la resección o el reportero NHEJ de extremo romo (I,J) y se trataron con el inhibidor de la polimerasa Polθ ART558. El porcentaje de reparación es la relación entre la luminiscencia de NanoLuc y la luminiscencia de Firefly, normalizada al control tratado con DMSO, 24 h después de la transfección. El porcentaje de inhibición de las señales de luminiscencia individuales en (G) y (I) se calculó en relación con el control tratado con DMSO y se mostró respectivamente en (H) y (J). Los datos representan la media ± SEM de 2 réplicas biológicas, cada una con un promedio de 4 réplicas técnicas. Esta figura fue adaptada de Rajendra et ^al.7. Abreviaturas: NanoLuc = Nanoluciferasa; MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; NHEJ = unión de extremos no homólogos; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Inhibición de la señal reportera de HR por el inhibidor de RAD51 CAM833. (A) Las células HEK-293 se transfectaron con el sustrato reportero de HR de plantilla larga, un plásmido de control de luciferasa Firefly, y se trataron con el inhibidor de RAD51 CAM833¹⁴. La luminiscencia de NanoLuc y Firefly se leyó 16 h después de la transfección. El porcentaje de reparación de HR es la relación entre la luminiscencia de NanoLuc y la luminiscencia de Firefly, normalizada al control tratado con DMSO. Las líneas discontinuas resaltan el porcentaje de inhibición de HR y la concentración de CAM833 en la curva EC₅₀. Los datos representan la media ± SEM de 2 réplicas biológicas, cada una con un promedio de 4 réplicas técnicas. (B) Se calculó el porcentaje de inhibición de las señales de luminiscencia individuales en (A) en relación con el control tratado con DMSO. Las líneas discontinuas resaltan el porcentaje de inhibición de NanoLuc y Firefly a 3,33 μM CAM833 (EC₅₀). La disminución de la señal de luciérnaga a concentraciones de CAM833 ≥ 10 μM es indicativa de toxicidad del compuesto a dosis altas; sin embargo, la reducción de la señal de NanoLuc se observa en concentraciones en las que la señal de Firefly no se ve afectada, lo que sugiere que CAM833 induce la inhibición de HR en el objetivo. Esta figura fue adaptada de Rajendra et ^al.7. Abreviaturas: NanoLuc = Nanoluciferasa; HR = recombinación homóloga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sustrato reportero		Plásmido de origen (tamaño en kb, resistencia)	Generación de DSB			Tamaño esperado del sustrato reportero final (kb)
MMEJ independiente de la resección		4.0, Kan	Colas resecadas de 3′ a través de la ligadura de sombreros			1.6
MMEJ dependiente de la resección		6.5, Kan	I-SceI (no cohesivo), HindIII (cohesivo)			6.5
Contundente NHEJ		4.3, Kan	Extremos contundentes tras la escisión del plásmido por EcoRV			1.7
NHEJ no contundente		6.7, Kan	I-SceI (no cohesivo), HindIII (cohesivo)			6.5
Plantilla larga HR		9.2, Kan	I-SceI (no cohesivo), HindIII (cohesivo)			9.2
Plantilla corta HR		9.3, amperios	I-SceI (cohesivo)			9.3
SSA		9.5, Kan	I-SceI (no cohesivo), HindIII (cohesivo)			9.5

Tabla 1: Plásmidos de sustrato reportero. Abreviaturas: DSB = rotura de doble hebra; MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; NHEJ = unión de extremos no homólogos; HR = recombinación homóloga; SSA = recocido de una sola hebra; Kan = kanamicina; Amperio = ampicilina.

Secuencia (5′-3′)			Proveedor	Purificación	Función
5′[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTCTCTCTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT			Sigma	PÁGINA	Sombrero izquierdo, oligonucleótido largo
5′[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC			Sigma	PÁGINA	Tapa izquierda, oligonucleótido corto
5′[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG			Sigma	PÁGINA	Tapa derecha, oligonucleótido largo
5′[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA			Sigma	PÁGINA	Tapa derecha, oligonucleótido corto

Tabla 2: Oligonucleótidos para tapones para la generación de sustrato reportero MMEJ independiente de la resección. Abreviaturas: ssDNA = ADN monocatenario; dsDNA = ADN bicatenario; MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida. Se subrayan las microhomologías.

Ensayo reportero	ADN del sustrato reportero NanoLuc (μg de ADN/1×106 células)	Plásmido luciferasa de control de luciérnagas (μg de ADN/1×106 células)
MMEJ independiente de la resección	0.5	0.66
MMEJ dependiente de la resección	1	0.66
Contundente NHEJ	0.5	0.66
NHEJ no contundente	0.5	0.66
Plantilla larga HR	1	0.66
Plantilla corta HR	2	0.66
SSA	1	0.66

Tabla 3: Cantidades de ADN para la transfección transitoria de sustratos reporteros de NanoLuc y plásmido luciferasa de control Firefly (HEK-293, formato de placa de 96 pocillos). Abreviaturas: MMEJ = unión de extremos mediada por microhomología; NHEJ = unión de extremos no homólogos; HR = recombinación homóloga; SSA = recocido de una sola hebra.

Discussion

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/es/66969

Aquí, hemos descrito protocolos para la generación e implementación de un conjunto de reporteros basados en luminiscencia extracromosómica para medir la competencia celular de las cuatro vías principales de DSBR (HR, NHEJ, MMEJ y SSA)⁷. Los sustratos reporteros pueden introducirse en las células mediante transfección transitoria y utilizarse para evaluar la actividad de DSBR utilizando una lectura sensible y robusta basada en placas de la luminiscencia de NanoLuc, que se reconstituye al interactuar con las vías celulares afines de DSBR.

Varias etapas de generación de sustratos reporteros, transfección de los sustratos en células e interpretación de datos son críticas para la ejecución exitosa de estos ensayos. Aunque se utilizan técnicas estándar de biología molecular para generar los sustratos reporteros, la visualización del proceso mediante electroforesis en gel garantiza la máxima calidad y pureza de los sustratos antes de la transfección. Dado que estos ensayos dependen de la transfección transitoria, se aplican consideraciones comunes para estos métodos. Estos incluyen la optimización de la densidad de siembra, las condiciones de transfección (incluidos los reactivos y las cantidades de ADN) y la evaluación de la idoneidad en formatos de transfección directa e inversa. Estos ensayos reporteros se han realizado con éxito con una variedad de protocolos de electroporación y lipofección, y las opciones deben explorarse completamente antes de realizar estos ensayos. También se debe tener cuidado de inspeccionar las señales de los componentes NanoLuc y Firefly en lugar de solo la señal de reparación compuesta derivada de la normalización de la señal NanoLuc (sustrato reportero) a la señal Firefly (control). Los artefactos pueden surgir de la relación impulsada por los cambios en la señal de Firefly. Por ejemplo, la evaluación de la inhibición en el modo dosis-respuesta utilizando un compuesto altamente específico debería suprimir la señal de NanoLuc de una manera titulable sin perturbar la señal de Firefly, que debería permanecer estable (Figura 4G, H). Sin embargo, en los casos en que las señales de Firefly están perturbadas, los impactos útiles en la reparación aún se pueden determinar identificando una ventana de dosis en la que la señal de Firefly no se vea afectada (Figura 5).

En comparación con los ensayos indicadores DSBR más utilizados, estos ensayos indicadores basados en luminiscencia extracromosómica tienen algunas ventajas distintivas. Dado que las vías de DSBR están muy conservadas, incluso si la maquinaria celular varía entre los modelos celulares, los ensayos aún pueden informar sobre la competencia de DSBR y la elección de la vía. Esto abre la evaluación de DSBR a cualquier modelo de interés para el usuario, siempre que se establezcan de antemano las condiciones óptimas de transfección transitoria.

El uso de la nanoluciferasa como gen reportero también ofrece ventajas sobre las opciones fluorescentes, que se han utilizado tradicionalmente en los ensayos reporteros DSBR. NanoLuc es de maduración rápida y la luminiscencia se detecta con alta sensibilidad utilizando un lector de placas⁸. Junto con la velocidad de reparación del sustrato (a medida que los sustratos reporteros se transfectan en células con extremos DSB listos para reparar), este formato de ensayo indicador DSBR es ideal para la rápida respuesta y la robustez cuantitativa requerida para el cribado de moléculas pequeñas como parte de una cascada de descubrimiento de fármacos industriales. De hecho, recientemente hemos descrito la implementación del ensayo reportero MMEJ independiente de la resección en la cascada de descubrimiento utilizada para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas del dominio Polθ polimerasa¹³.

También hay flexibilidad en la implementación de los ensayos reporteros para abordar preguntas específicas sobre las perturbaciones genéticas y farmacológicas de DSBR (Figura 3). Por ejemplo, antes de la transfección de los sustratos reporteros, las células se pueden transfectar con siRNA contra un gen de interés durante 48-72 h. Alternativamente, los efectos de la sobreexpresión génica en las vías DSBR se pueden probar realizando la transfección de plásmidos 24-48 h antes de la transfección de los sustratos reporteros. Para los estudios farmacológicos, el presente protocolo ya describe cómo el uso de moléculas pequeñas puede incorporarse al flujo de trabajo estándar, pero los formatos alternativos pueden incluir alteraciones en los regímenes de tratamiento de los compuestos, como preincubaciones o lavados.

La escalabilidad de la transfección transitoria también podría respaldar enfoques de cribado a gran escala en los que se realiza la transfección por lotes de sustratos indicadores antes del cribado. Además, la duración del ensayo desde la transfección hasta la lectura también puede variar. Aunque las duraciones estándar pueden ser de 16 a 24 h, algunos ensayos pueden leerse en tan solo 6 h⁷. Las preocupaciones sobre la toxicidad de moléculas pequeñas o siRNA que pueden comprometer la viabilidad celular también deben tenerse en cuenta para determinar la duración del ensayo.

En resumen, los ensayos descritos en este estudio y descritos en detalle en una publicación reciente⁷ proporcionan una evaluación rápida y robusta de la competencia celular de DSBR. Son altamente sensibles y titulables, lo que los hace susceptibles de estudios genéticos y farmacológicos. De manera crucial, dado que los sustratos reporteros pueden introducirse en las células por transfección transitoria, tienen el potencial de ser utilizados en cualquier modelo celular transfectable de interés, en lugar de estar restringidos a líneas celulares específicas por integración estable como es el caso de los reporteros cromosómicos DSBR. Sin embargo, una limitación distintiva de estos ensayos extracromosómicos reporteros es que la falta de integración en el genoma puede no recapitular completamente el contexto fisiológico y cromatinizado de la reparación del ADN y sus señales reguladoras y^{orquestación} asociadas. Con este fin, los ensayos reporteros extracromosómicos son complementarios a los métodos existentes de evaluación de DSBR y amplían el conjunto de recursos adecuados tanto para la investigación básica como para el descubrimiento de fármacos.

Materials

10x TBE buffer	Thermo Fisher	AM9863
20% TBE-acrylamide gel	Invitrogen	EC6315BOX
50x TAE buffer	Fisher Scientific	BP13321
6x Gel Loading Dye, Purple	NEB	B7024S
96-well white plate (with transparent bottom and lid)	Porvair	204012
Agarose	Cleaver Scientific	CSL-AG500
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	For bead-based purification of DNA
Antarctic phosphatase and 10X buffer	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101	Plate reader
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Cell counter
Custom oligonucleotides	Sigma-Aldrich	Custom order	For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2.
D300e	Tecan	30100152	DMSO-based compound dispenser
D300e D4+ cassette	Tecan	30097371	High volume cassette for D300e compound dispenser
D300e T8+ cassette	Tecan	30097370	Low volume cassette for D300e compound dispenser
Dimethyl sulfoxide, cell culture grade	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5
DSBR reporter source plasmids	Artios		Available to the academic community upon request
EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer	NEB	R3195M
Ethanol absolute	VWR	20821.365
Foetal Bovine Serum	PAN-Biotech	P30-3031
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder	Thermo Fisher	SM1211	Low molecular weight DNA ladder
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573	Example cell line used in protocol
HindIII-HF and 10x CutSmart buffer	NEB	R3104M
HyClone Molecular Biology grade water	Fisher Scientific	10275262
I-SceI and 10x Tango Buffer	Invitrogen	ER1771
Isopropanol	VWR	20842.33
JetPRIME reagent and buffer	PolyPlus	114-15	Lipid-based transfection reagent
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	Centrifuge for 15 or 50 mL tubes
MEM Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	Culture medium for HEK-293 cells
Microplate shaker	Fisherbrand	15504070	Microplate orbital shaker
MicroStar 17R	VWR	521-1647	Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes
MultiDrop	Thermo Fisher	5840300	Cell or water-based reagent dispenser
MultiDrop Standard Cassette	Thermo Fisher	24072670	Cassette for MultiDrop reagent dispenser
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate	Promega	N1630 or N1650	Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate	Promega	N1630 or N1650	Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
PBS (without calcium or magnesium)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 Firefly plasmid (or similar)	Promega	E1310 (or equivalent)	Firefly control plasmid
pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar)	Promega	N1091 (or equivalent)	NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28706
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder	NEB	N0552S	High molecular weight DNA ladder
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5	Thermo Fisher	AM9740	For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit
SYBR Gold (10,000x)	Invitrogen	S11494	For visualisation of ssDNA and dsDNA
SYBR Safe (10,000x)	Invitrogen	S33102	For visualisation of dsDNA only
T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer	NEB	M0202L
Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	For measurement of viability during cell counting
Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoI and 10x CutSmart buffer	NEB	R0146M