Artículo de método

Cirugía de Transferencia Embrionaria por Laparotomía en Primerizas

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DOI:

10.3791/66984

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18 de octubre de 2024

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1Centro de Estudos sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, 2Instituto do Coração (Incor), Hospital das Clínicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 3Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la aplicación de la técnica quirúrgica utilizada para transferir embriones de cerdo clonados mediante laparotomía en primerizas.

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo demostrar la técnica quirúrgica para transferir embriones de cerdo clonados al oviducto, un método ampliamente utilizado en la producción de cerdos modificados genéticamente para investigación biomédica. Nueve primerizas se sometieron a sincronización hormonal y laparotomía para la transferencia de embriones clonados producidos por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) en etapas de hasta 4 células en el día 2 al oviducto. El diagnóstico gestacional se realizó mediante ecografía a los 30 días de la cirugía de transferencia. Seis de las nueve cerdas jóvenes operadas mostraron signos de embarazo en el examen de ultrasonido. Sin embargo, como no hubo progresión en el desarrollo fetal evaluado por ecografía, las primerizas se sometieron a una necropsia a los 60 días para la recolección de material biológico y la evaluación del sistema reproductivo. Se observaron adherencias en los cuernos uterinos, los ovarios y los oviductos. A partir de la luz uterina de dos de las primerizas sacrificadas, se obtuvieron una y cuatro estructuras embrionarias con edades gestacionales que oscilaron entre los 12 y los 20 días. A pesar de la ausencia de lechones vivos, probablemente atribuida a la baja tasa de eficiencia de la transferencia de embriones de cerdo clonados, que está influenciada por varios factores, incluido el número y la calidad de los embriones transferidos, la técnica quirúrgica presentada demostró ser rápida y segura.

Introducción

Los cerdos son un excelente modelo experimental para la investigación biomédica debido a sus similitudes anatómicas, fisiológicas y genéticas con los humanos1. Estos animales se han utilizado a menudo en investigaciones relacionadas con los xenotrasplantes, con la intención de producir órganos, células o tejidos que promuevan un bajo riesgo de rechazo cuando se trasplantan a humanos. La investigación en xenotrasplantes tiene como objetivo aumentar la oferta de órganos para trasplante humano, reduciendo así la lista de espera de pacientes2.

La producción de cerdos para xenotrasplantes implica varias etapas, incluida la producción de clones a partir de células porcinas editadas genéticamente. Después de la producción in vitro de embriones clonados genéticamente modificados, los embriones se transfieren al sistema reproductivo de una cerda con un ciclo estral sincronizado para preparar la fisiología uterina para la recepción y gestación del nuevo conceptus3.

La transferencia de embriones en cerdos puede realizarse por métodos no invasivos o invasivos4. Entre los métodos no invasivos se encuentra la transferencia transcervical, que no requiere ninguna intervención quirúrgica. Sin embargo, este método se limita a la transferencia de embriones en etapas posteriores de desarrollo (es decir, etapas de mórula o blastocisto) y no permite la determinación precisa del sitio de inserción del catéter o la deposición embrionaria5. La laparoscopia y la laparotomía se consideran métodos invasivos de transferencia embrionaria. La laparoscopia es menos invasiva, pero requiere equipos específicos y costosos, y su eficacia varía considerablemente (de menos del 20% a más del 80%) debido a diversos factores, como la dificultad en la manipulación de las estructuras reproductivas y el tipo de catéter utilizado 4,6. Por lo tanto, la transferencia por laparoscopia sigue siendo menos eficiente en comparación con los métodos quirúrgicos de transferencia por laparotomía4.

La cirugía de transferencia de embriones en cerdas mediante laparotomía es un procedimiento relativamente sencillo y rápido, que suele durar unos 30 minutos. Sin embargo, debe realizarse en un centro quirúrgico equipado con aparatos de anestesia inhalatoria y un equipo especializado. En el caso de las cepas de cerdos comerciales (como las autóctonas, las blancas grandes o sus cruces), se necesitan equipos especiales como polipastos para levantar cerdas jóvenes y una mesa quirúrgica ancha y robusta debido al considerable peso de los animales (alrededor de 130-150 kg).

Para que la cirugía sea exitosa, los embriones deben ser evaluados previamente por su etapa de desarrollo. Se recomienda transferir embriones de hasta 4 células a la trompa uterina. Los embriones en estadios superiores a 4 células, como las mórulas y los blastocistos, deben transferirse al asta uterina 7,8.

Aunque grupos de investigación de todo el mundo están realizando la producción y transferencia quirúrgica de embriones de cerdo clonados genéticamente modificados, todavía no existen protocolos bien definidos que demuestren este procedimiento a través de vídeos. Este enfoque es crucial para el éxito de la gestación, ya que la técnica requiere la deposición precisa de los embriones en la ubicación exacta del oviducto, lo que implica la localización del ostium tubárico y la introducción de la pipeta que contiene los embriones. Esta técnica se puede entender mejor a través de videos explicativos de todo el procedimiento. Por lo tanto, este artículo tiene como objetivo demostrar la cirugía de laparotomía para transferir embriones clonados al oviducto de primerizas, un requisito previo esencial para la futura producción de cerdos modificados genéticamente para ser utilizados para xenotrasplantes u otros fines relacionados.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Uso de Animales en Investigación de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de São Paulo, número de protocolo 6088030523. Nueve cerdas jóvenes de siete meses de edad de la granja porcina núcleo de Água Branca, ubicada en la ciudad de Itu, estado de São Paulo, Brasil, se utilizaron justo después de la segunda detección de celo9. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación animal

  1. Ayunar a los animales durante 12 horas y restringir el acceso al agua durante 4 horas antes del procedimiento quirúrgico.
  2. Con una aguja de 40 mm x 12 mm, extraiga 10 mg/kg de ketamina y 0,2 mg/kg de midazolam en la misma jeringa de 50 ml. Conecte la jeringa a un equipo de administración intravenosa para facilitar la administración de medicamentos, manteniendo una distancia segura del animal y permitiéndole moverse libremente.
  3. Administrar la medicación preanestésica mediante inyección intramuscular en el músculo trapecio, caudal hasta el conducto auditivo externo.
  4. Cánula de la vena auricular con un catéter de 20 G y conectarla a un equipo de administración de macrogoteo para fluidoterapia intraoperatoria con solución de NaCl al 0,9% a una tasa de 10 mL/kg/h.
  5. Inducir la anestesia con 4 mg/kg de propofol por vía intravenosa (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
  6. Realizar la intubación orotraqueal del animal utilizando un laringoscopio y un tubo orotraqueal de tamaño 9 con un manguito10.
  7. Mantener la anestesia con inhalación de isoflurano al 1,5% a 2%. Además, monitoree la anestesia evaluando parámetros fisiológicos como la frecuencia cardíaca, que debe mantenerse entre 100 y 120 latidos por minuto, la saturación de oxígeno, que debe mantenerse entre el 99% y el 100%, la relajación muscular, la ausencia de movimiento y la evaluación de los reflejos.
    NOTA: La temperatura corporal también debe ser monitoreada y controlada, manteniéndose entre 37.5-38.5 °C. Cuando sea necesario, además del isoflurano, se puede utilizar propofol para mantener el control de los parámetros. El clorhidrato de fentanilo debe administrarse como analgésico a una dosis de 0,02 mg/kg cada 20 min. Todos los parámetros deben registrarse cada 5 minutos.
  8. Administrar analgesia perioperatoria con una dosis única de 0,002 mg/kg de fentanilo por vía intravenosa y 4 mg/kg de clorhidrato de tramadol por vía intramuscular en el músculo glúteo o trapecio.
  9. Colocar electrodos cardíacos en la región torácica para la monitorización intraoperatoria de la frecuencia cardíaca. Registre la frecuencia cardíaca, la temperatura rectal y la saturación de oxígeno cada 5 minutos.

2. Procedimiento quirúrgico

  1. Coloque la primeriza en la mesa quirúrgica en decúbito dorsal.
  2. Cubra las patas del animal con guantes de procedimiento para minimizar la contaminación del campo quirúrgico.
  3. Realizar la depilación abdominal caudal ventral entre el penúltimo par de glándulas mamarias mediante una maquinilla quirúrgica.
  4. Realizar la antisepsia cutánea preoperatoria con un cepillo antiséptico impregnado de clorhexidina, realizando movimientos circulares desde la región de la cicatriz umbilical hasta el último par de glándulas mamarias. Retire la clorhexidina con una compresa limpia y humedecida.
  5. Asegúrese de que el cirujano y el asistente realicen la antisepsia quirúrgica y usen batas quirúrgicas estériles y guantes para la cirugía.
    NOTA: El animal debe estar preparado para la cirugía en un área de preparación separada del sitio quirúrgico.
  6. Preparar la mesa quirúrgica con el instrumental adecuado y previamente esterilizado que se indica en la Tabla de Materiales.
  7. Realizar la antisepsia final del campo quirúrgico utilizando gasa estéril y antiséptico de clorhexidina, limpiando la región en un patrón de espina de pescado, comenzando en el sitio de la incisión y expandiéndose lateralmente.
  8. Repita este procedimiento tres veces con clorhexidina antiséptico y luego repita el procedimiento con clorhexidina alcohólica.
  9. Cubra completamente al animal con un paño quirúrgico estéril y, con unas tijeras, cree una abertura rectangular en el paño quirúrgico, de aproximadamente 10 x 20 cm², si el paño no está fenestrado.
  10. Coloque el paño quirúrgico sobre el penúltimo par de glándulas mamarias inguinales. Coloque 4 pinzas Backhaus para asegurar el paño quirúrgico sobre la piel del animal.
  11. Incidir la piel con un bisturí, creando una incisión de aproximadamente 10 cm de longitud.
  12. Lograr la hemostasia de los vasos subcutáneos con pinzas hemostáticas y/o sutura reabsorbible tamaño 2.
  13. Diseccionar el tejido subcutáneo con los dedos o con la ayuda de tijeras de punta fina, profundizando la incisión para llegar a la línea alba en la musculatura abdominal.
    NOTA: Palpar la línea media del abdomen para sentir la línea alba como una zona más rígida y fibrosa; Observe la separación de los músculos rectos abdominales y observe el cambio en la consistencia del tejido durante la disección para identificar la línea alba con precisión 11.
  14. Con las pinzas Allis, agarre la musculatura y levántela para hacer una incisión punzante en la línea alba con un bisturí.
  15. Inserte el dedo índice en la incisión para evaluar la presencia de adherencias. Extienda la incisión sobre la línea alba caudal y cranealmente con unas tijeras romas/romas o finas/romas con cuidado para evitar lesionar otros órganos y estructuras subyacentes.
  16. Realice una incisión de longitud suficiente para que la mano del cirujano pueda introducirse en la cavidad abdominal para localizar y exteriorizar los cuernos uterinos y/o los ovarios. Se puede utilizar un retractor Gosset para facilitar la entrada en la cavidad abdominal y la sutura de la musculatura en una sola capa al final del procedimiento.
  17. Si uno de los cuernos uterinos se encuentra antes de los ovarios, sígalo suavemente hasta llegar a la punta del cuerno uterino y al ovario ipsilateral. Durante este procedimiento, evalúe la presencia de líquido dentro del útero, que puede comprometer la gestación.
  18. Después de localizar el ovario, tire suavemente de él y expóngalo con cuidado. Evaluar la presencia de folículos preovulatorios, cuerpos lúteos hemorrágicos, cuerpos lúteos cíclicos y cuerpos albicans para evaluar si la sincronización de la primeriza es la esperada.
  19. Retire suavemente las fimbrias de la trompa uterina que cubre el ovario, everta su mucosa y localice el ostium de la trompa uterina.
    NOTA: Si al cirujano le resulta difícil identificar el ostium de las fimbrias, se puede hacer una bolsa en la ampolla del oviducto con una aguja de sutura de cuerpo redondo, evitando perforar los vasos sanguíneos, para insertar el catéter Tomcat que contiene los embriones.
  20. Insertar con cuidado un catéter Tomcat que contiene los embriones en el ostium de las fimbrias hasta llegar a la región de la ampolla de la trompa uterina.
  21. Conecte una jeringa de 1 ml al catéter Tomcat para empujar el líquido que contiene el embrión hacia la trompa uterina. Cubra el ovario con las fimbrias y devuélvalo a la cavidad abdominal.
  22. Localice el asta uterina contralateral y el ovario y repita los pasos 2.17-2.21.
  23. Reposicionar las estructuras dentro de la cavidad abdominal y añadir 1 L de suero fisiológico o solución de lactato de Ringer calentada (39 °C) para evitar adherencias antes de iniciar la abdominorrafia.
  24. Suturar la musculatura abdominal con sutura reabsorbible tamaño 2 en puntos "X" (Sultan) interrumpidos.
  25. Aproximar el tejido subcutáneo con una sutura continua de colchón utilizando sutura reabsorbible tamaño 2.
  26. Cierre la piel con sutura de nailon de tamaño 2 en puntos simples interrumpidos, grapas quirúrgicas o adhesivo de etil-cianoacrilato. En este procedimiento, optamos por el uso de adhesivo.
  27. Limpiar la herida quirúrgica con una gasa empapada en peróxido de hidrógeno y secar con una compresa para mejorar la fijación del adhesivo quirúrgico en la herida quirúrgica. Aplicar rifamicina o ungüento de Pearson, cubrir con una gasa y, por último, aplicar adhesivo quirúrgico.
    NOTA: La herida debe permanecer cerrada con un apósito durante 5 días.

3. Cuidados postoperatorios

  1. Evaluar a los animales para detectar signos de dolor clínico característico durante al menos los 3 días consecutivos siguientes, de acuerdo con la escala propuesta por Luna et al.12.
    NOTA: Esta escala se basa en los diferentes comportamientos que exhiben los cerdos al experimentar diferentes niveles de dolor, como la postura, la interacción y el interés por el entorno, la actividad, el apetito y la atención a la zona afectada. La puntuación oscila entre 0 y 3, dependiendo del tipo de comportamiento exhibido, para cada parámetro evaluado. Al final de la evaluación, la suma de todas las puntuaciones refleja la intensidad del dolor experimentado por el animal, donde 0 representa ningún dolor y 18 representa un dolor muy intenso12.
  2. Administrar una dosis única de 15 mg/kg de amoxicilina y 0,4 mg/kg de meloxicam al 2% por vía intramuscular (en el músculo glúteo o cervical) una vez al día durante 3 días como cuidados postoperatorios para prevenir dolor, procesos inflamatorios e infección.
    NOTA: Si la puntuación de dolor es igual o superior a 6 en la escala de dolor utilizada (puntuación de 0 a 18), administrar 5.000 mg/animal de dipirona sódica por vía intramuscular (en el músculo glúteo o cervical) una vez al día, además del antiinflamatorio y el antibiótico. Alternativamente, realice la analgesia como se describe en las pautas locales de IACUC.
  3. Al 6º día después de la cirugía, retirar el adhesivo quirúrgico para la limpieza de heridas con una gasa empapada en una solución de clorhexidina alcohólica al 2% y aplicar el ungüento tópico de Pearson hasta el 10º día, cuando se recomienda la retirada de la sutura o de las grapas quirúrgicas, si se utilizan.

4. Diagnóstico gestacional ultrasonográfico del embarazo

  1. Realizar una evaluación ultrasonográfica transabdominal del embarazo con un dispositivo de ultrasonido (rango de frecuencia de 4,5 a 8,5 MHz) 30 días después de la cirugía de transferencia embrionaria.
  2. Aplique gel de ultrasonido a la sonda y colóquela cerca de la región abdominal inguinal, mirando medialmente.
    NOTA: La visualización de vesículas embrionarias anecoicas redondeadas, debido al líquido en la luz uterina, indica gestación. La no visualización del líquido intrauterino, o la presencia de líquido intrauterino sin delineación de las vesículas embrionarias, sugiere la ausencia de gestación.

5. Eutanasia de los animales

NOTA: Sacrificar a las primerizas que no presentaron fetos de tamaño y apariencia correspondientes a la edad gestacional en el examen ultrasonográfico.

  1. Con una aguja de 40 mm x 12 mm, extraer 15 mg/kg de ketamina y 2 mg/kg de midazolam en la misma jeringa de 50 ml conectada a un equipo de administración intravenosa, y administrar por vía intramuscular en el músculo trapecio en la región cervical caudal al conducto auditivo externo, como medicación preanestésica.
  2. Cánula de la vena auricular con un catéter de 20 G e inducir la anestesia con 4 mg/kg de propofol por vía intravenosa en un bolo hasta que se produzca la bradicardia (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
  3. Posteriormente, administrar de 10 a 20 mL de cloruro potásico al 19,1% por vía intravenosa. Confirmar el paro cardiorrespiratorio observando la ausencia de movimientos respiratorios, mucosas pálidas, pérdida del reflejo corneal y ausencia de latidos cardíacos colocando un estetoscopio sobre la región cardíaca.
  4. Recoger cualquier tipo de contenido intrauterino (tejido embrionario, líquido o secreciones mucosas) de las hembras necropsiadas13 y enviarlo para su análisis microbiológico para detectar posibles patógenos y también para la caracterización genotípica de los clones (si es necesario). Verificar visualmente la presencia o ausencia de cuerpos lúteos, quistes ováricos, secreciones anormales y la aparición de adherencias en el útero, ovarios y oviductos14.

Resultados

Este artículo tiene como objetivo demostrar la cirugía de laparotomía para transferir embriones clonados al oviducto de primerizas. Todos los animales permanecieron en un plano anestésico adecuado, sin incidentes intraoperatorios ni complicaciones durante la recuperación anestésica. Las primerizas tardaron, en promedio, 2-3 horas en ponerse de pie después de que terminó la cirugía.

Todos los procedimientos quirúrgicos duraron, en promedio, 44 min. Nueve primerizas se sometieron a cirugía, con un promedio de 185 embriones clonados transferidos por primeriza, totalizando 1.664 embriones transferidos bilateralmente (Tabla 1). La localización de los ovarios, su exteriorización y la introducción del catéter Tomcat que contiene los embriones en el ostium del oviducto correspondieron a los momentos más delicados de la cirugía. Los ovarios de todas las primerizas fueron inspeccionados durante la cirugía, y todos presentaron folículos hemorrágicos recientemente ovulados, lo que concuerda con lo esperado para el protocolo de sincronización del celo realizado, que tenía como objetivo realizar transferencias embrionarias poco después de la ocurrencia de la ovulación. Todos los procedimientos ocurrieron sin incidentes intraoperatorios.

Ningún animal mostró signos de dolor intenso después de la cirugía, con una puntuación media de dolor de 0,33, 0,33, 3,67, 1,33, 0,33, 1,33, 4,67, 2,00 y 0,33 en la escala de dolor (que va de 0 a 18) realizada durante los 3 días postoperatorios para cada una de las primerizas operadas (Tabla 2). Solo 1 de las primerizas operadas presentó acumulación de líquido subcutáneo (seroma) a los 12días postoperatorios, con signos de infección e inflamación localizados cerca de la herida quirúrgica. Tras drenar el líquido con una aguja de 40 mm x 1,6 mm guiada por ecografía, aplicar compresas frías en la zona inflamada durante 30 minutos diarios durante 7 días, administrar ceftiofur (3 inyecciones intramusculares, con un intervalo de 72 h entre inyecciones) y meloxicam al 2% (0,4 mg/kg de SID, por vía intramuscular, durante 3 días), la herida se fistuló y drenó el contenido mucopurulento restante, resultando en una mejoría completa del animal. Las otras primerizas operadas permanecieron con el apósito quirúrgico durante 5 días sin necesidad de cambiarlo o retirarlo para la limpieza de la herida, que solo se realizó del6º al10º día postoperatorio.

En las primerizas 2, 8 y 9 no se observó acumulación de líquido ni formación de vesículas embrionarias en la luz uterina (Figura 1A). Por lo tanto, el diagnóstico gestacional de estos animales se consideró negativo. Las otras primerizas mostraron acumulación de líquido intrauterino y la formación de vesículas embrionarias visualizadas como estructuras redondeadas anecoicas bien definidas (Figura 1B-D). Fue posible identificar, en dos de las primerizas receptoras, una región hiperecogénica en relación con la estructura embrionaria en la fase temprana de desarrollo dentro de las vesículas embrionarias en eldía 32 de gestación (Figura 1E,F).

Tras un diagnóstico gestacional negativo o sin progresión de la gestación, las primerizas fueron sacrificadas y se analizó el sistema reproductivo. Se observaron adherencias en regiones de ovarios, oviductos y cuernos uterinos en menor o mayor grado en las primerizas 1, 2, 3 y 4, y quistes ováricos en las primerizas 8 (Figura 2). Cuatro estructuras embrionarias, con una edad gestacional compatible con aproximadamente 12 a 20 días de gestación, se obtuvieron del útero de la primeriza 3, y una estructura se obtuvo de la primeriza 7 (Figura 3). El análisis de los fragmentos de tejido embrionario resultó negativo para la detección de Parvovirus, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae y Circovirus Porcino tipos 2 y 3 (PCV2/PCV3), que pueden causar muerte embrionaria o abortos.

Secuencia de ultrasonido, análisis de la estructura renal, imágenes médicas, procedimiento diagnóstico, estudio renal.
Figura 1: Imágenes ultrasonográficas del útero de la primeriza receptora de embriones 30 días después del procedimiento quirúrgico. (A) El útero de la primeriza 2 sin presencia de líquido en su interior, caracterizando un diagnóstico gestacional negativo. El útero grávido de la primeriza 1 (B), la cerda 3 (C) y la cerda 4 (D) que contiene vesículas embrionarias con líquido en su interior (asteriscos). El útero grávido de la primeriza 3 (E) y la primeriza 7 (F) muestra una estructura hiperecogénica (flecha) dentro de la vesícula embrionaria, lo que indica la formación fetal en la fase temprana a los 32 días de gestación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proceso de disección, estudio anatómico, segmentos de muestra etiquetados, diagrama de investigación educativa.
Figura 2: Análisis del sistema reproductivo. Imágenes de úteros, ovarios y oviductos después de la necropsia de la dorada 1 (A), la dorada 2 (B), la dorada 3 (C), la dorada 4 (D), la dorada 5 (E), la dorada 6 (F), la dorada 7 (G), la dorada 8 (H) y la dorada 9 (I). Las flechas resaltan las adherencias en los cuernos uterinos, los ovarios y los oviductos, y las puntas de flecha resaltan los quistes ováricos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imágenes de disección que muestran muestras de tejido biológico y muestra en placa de Petri para estudio anatómico.
Figura 3: Diagnóstico gestacional. Los embriones en estadio temprano extraídos de la primeriza 3 (A-D) y la primeriza 7 (E) presentan un diagnóstico gestacional positivo y estructuras hiperecogénicas dentro de vesículas embrionarias en el examen ultrasonográfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Número y tipo de embriones transferidos por primeriza, embarazos diagnosticados y número de embriones obtenidos después de la necropsia de las primerizas operadas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Valores asignados a cada una de las primerizas operadas en cuanto a la presentación de signos de dolor. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El método quirúrgico descrito ha sido realizado previamente por otros grupos de investigación que trabajan con la producción de cerdos clonados o cerdos clonados genéticamente modificados, con reportes de nacimientos después de la implementación de esta técnica 15,16,17,18,19,20. Las tasas de embarazo y natalidad de los embriones SCNT producidos a partir de varias líneas celulares oscilan entre el 20% y el 30% (de 264 transferencias desde 2017), con una media de 3,2 ± 0,4 lechones nacidos por camada 3,21. Varios factores están relacionados con la baja eficiencia de esta técnica, incluyendo el protocolo de sincronización utilizado para las cerdas receptoras, la sincronización entre la cerda receptora y la etapa de los embriones transferidos, el sitio de deposición embrionaria, la calidad de los ovocitos utilizados para la SCNT y los embriones producidos, la calidad y el estado celular de las células somáticas del donante del núcleo y el número de embriones transferidos21.

De acuerdo con el presente estudio, la cirugía descrita demostró ser efectiva, rápida y segura para realizar la transferencia quirúrgica de embriones clonados (hasta 4 células) en primerizas, resultando en diagnósticos gestacionales ultrasonográficos positivos y visualización de estructuras embrionarias dentro de la luz uterina después de la necropsia, con una edad gestacional aproximadamente entre 12-20 días de gestación22. Otro método menos invasivo para transferir embriones de SCNT al oviducto de las cerdas es la laparoscopia. Sin embargo, la eficacia de esta técnica varía considerablemente desde menos del 20% hasta más del 80% debido a diversos factores como la anatomía de las estructuras, el tipo de catéter utilizado y el lugar de deposición embrionaria 4,6,23,24,25,26,27. Al transferir 2-4 embriones de cerdo blastómero por laparoscopia a través del infundíbulo a 6 cerdas, Wieczorek et al.4 no lograron embarazos positivos a los 28-31 días después del procedimiento, y este resultado se relacionó con dificultades en la inserción del catéter en el oviducto, inserción superficial del catéter en el oviducto y aparición de perforación del infundíbulo con el catéter. Por lo tanto, el método de transferencia embrionaria mediante laparotomía al oviducto de las cerdas sigue siendo el más eficiente.

El riesgo quirúrgico asociado al procedimiento de laparotomía para la transferencia embrionaria en cerdas es pequeño; sin embargo, es importante destacar la posibilidad de hipertermia maligna durante la anestesia, que se observa comúnmente en cerdos comerciales de las razas Landrace y Large White28. En este caso, ninguna de las cerdas operadas mostró signos clínicos de hipertermia maligna durante la anestesia. También existe el riesgo de sangrado local menor de los vasos más grandes de la región subcutánea, que puede detenerse fácilmente con pinzas hemostáticas o suturar con sutura reabsorbible. También puede producirse la posibilidad de incidir accidentalmente cualquier órgano de la cavidad abdominal, como la vejiga o las asas intestinales, durante la incisión con el bisturí en punzada y la incisión de extensión en la línea alba con tijeras. En este caso, el cirujano debe prestar mucha atención durante la incisión de la línea alba y la sutura de los músculos abdominales para evitar cortar o lacerar las estructuras subyacentes.

La destreza manual del cirujano es fundamental para la correcta manipulación de los ovarios y una cuidadosa exteriorización, evitando la rotura de los vasos del pedículo ovárico. Cuando existe dificultad para localizar el ovario o ovarios, es posible iniciar el procedimiento localizando uno de los cuernos uterinos y siguiendo su extensión hasta llegar a la punta del cuerno uterino en la unión útero-tubárica cerca del ovario. Se debe tener cuidado de evitar adherencias ováricas y uterinas debidas a la manipulación excesiva de estos órganos. La hidratación de estas estructuras con solución de Ringer lactato o solución salina a 39 °C durante la cirugía puede ayudar a prevenir la formación de adherencias29. La manipulación de la trompa uterina, especialmente en la región de las fimbrias, debe realizarse con mucha delicadeza para evitar estiramientos y rupturas. Aunque la transferencia unilateral de embriones, solo a una de las trompas uterinas, se puede realizar para evitar la manipulación excesiva del útero y reducir el tiempo quirúrgico, la transferencia bilateral puede ser más segura y ventajosa, especialmente en los casos en los que hay una rotura accidental de una de las trompas uterinas o dudas sobre la deposición embrionaria en el lugar correcto. Además, la transferencia bilateral es más recomendable, ya que promueve mayores tasas de preñez y número de lechones nacidos en comparación con la transferencia unilateral16,30. La presencia de quistes se asocia con un retorno regular o irregular al celo, con hasta el 10% de las mujeres con quistes ováricos que permanecen en el anestro. Se relaciona con diversas causas como el estrés, el uso de protocolos hormonales o la herencia genética31,32. En nuestro caso, los quistes foliculares ocurrieron a pesar de seguir la dosis y el tiempo de administración recomendados por el fabricante de la hormona para la sincronización del calor.

Saber localizar el ostium de la trompa uterina por la apertura de las fimbrias es de fundamental importancia para la correcta deposición de los embriones en el lugar adecuado. Para evitar errores en cuanto a la localización de la deposición embrionaria, se recomienda realizar un entrenamiento previo sobre el paso del catéter Tomcat lleno de solución (por ejemplo, agua) a través del ostium de la trompa uterina en las muestras de matadero. Cuando la pipeta se introduce en el lugar correcto, es posible observar un aumento en el volumen de la trompa uterina al inyectar la solución. Vale la pena señalar que cuanto menor es la cantidad de líquido transferido junto con los embriones, mayores son las posibilidades de embarazo33. Si al cirujano le resulta muy difícil encontrar el ostium de la trompa uterina, es posible hacer un bolsillo en el oviducto e insertar el catéter a través de él. Aunque este último método es más rápido e implica una menor manipulación del oviducto, el cirujano debe evitar los vasos sanguíneos y asegurarse de que el catéter se haya insertado correctamente dentro de la luz del oviducto.

Aunque el riesgo de infecciones postoperatorias por este procedimiento quirúrgico es bajo, puede ocurrir debido a factores como el nivel de limpieza del área donde se alojan los animales, la duración del procedimiento quirúrgico, el mantenimiento del apósito durante un tiempo adecuado y la correcta prescripción de medicamentos, como la terapia antibiótica preventiva y los antiinflamatorios. La hipótesis más plausible para la ocurrencia de la infección observada en una de las cerdas jóvenes operadas está relacionada con la caída del apósito poco después de que el animal se levanta después de la anestesia. Aunque la limpieza diaria de la herida quirúrgica de esta primeriza se realizó con gasa empapada en solución salina y la aplicación tópica de ungüento de Pearson, dicho procedimiento no fue suficiente para prevenir la contaminación ascendente, requiriendo la aplicación de agua fría en el sitio, drenaje, terapia antibiótica sistémica y 3 días adicionales de tratamiento antiinflamatorio. Incluso con la aparición de infección subcutánea, esta primeriza mostró signos de embarazo en el examen ultrasonográfico.

Después de usar hilos de nailon y grapas quirúrgicas para cerrar la piel en cirugías anteriores, optamos por usar adhesivo de etil-cianoacrilato para reducir el estrés al retirar los puntos y evitar que queden hilos o grapas. La presencia de hilos o grapas promueve una pequeña inflamación local con formación de pústulas. El adhesivo de etil-cianoacrilato ya se ha utilizado de forma segura en procedimientos quirúrgicos, demostrando ser eficaz, no tóxico y bactericida 34,35. Todos los animales mostraron una excelente cicatrización de las heridas, sin complicaciones, a excepción de la primeriza, a la que se le cayó el apósito poco después del procedimiento quirúrgico.

Divulgaciones

Ninguno de los autores revela ningún conflicto de intereses

Agradecimientos

Agradecemos al Hospital Veterinario Equino y al Hospital Veterinario de Rumiantes de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de São Paulo (FMVZ/USP), São Paulo, Brasil, FAPESP (subvención 2022/11459-3, Fundación de Investigación de São Paulo), EMS Pharma, CNPq (subvención 405254/2022-9) y Porcicultura Água Branca, Itu, São Paulo, Brasil.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pajita de 0,25 mLgenérico-Materialquirúrgico
Jeringa de 1 mLDescarpack341001Material quirúrgico
Jeringa de 10 mLDescarpack324601Material quirúrgico
Jeringa de 20 mLDescarpack324801Material quirúrgico
Jeringa de 3 mLDescarpack324201Material quirúrgico
Jeringa de 5 mLDescarpack324401Material quirúrgico
Jeringa de 60 mLDescarpack323201Material quirúrgico
tubo endotraqueal de 9 mmRusch112482-000090Material quirúrgico
Allis pinzasgenéricas-Instrumental
quirúrgico Amox LAJA Saú de AnimalRegistro MAPA: 8.781/2004
Fórceps BakhausGenérico-QuirúrgicoCatéter de instrumental
20GDescarpack362401Catéter de acceso intravenoso
CetaminAgener Uniã oRegistro MAPA: SP-000292-5.000011 anestésico
Gel clínico conductivoRMCRegistro ANVISA: 80122200013Material quirúrgico
Dipirona D-500ZoetisRegistro MAPA: SP0000728-46Medicamento farmacéutico
Bisturí desechable n. 22WiltexRegistro ANVISA: 10150470565Instrumental quirúrgico
Esponja-cepillo estéril desechableRioquimica7.89778E+12Asepsia quirúrgica
Easy-Scan:GoIMVESCG01Ultrasound
Endozime AW PlusRuhof34514Detergente para instrumental quirúrgico
Fentanilo (Fentanest)Cristá liaMatrícula ANVISA: 1029800810159Anestésico
Gosset retractorgenérico-Instrumentoquirúrgico
Halstead-pinza hemostática para mosquitosgenérico-Instrumentoquirúrgico
Ungüento curativo - Unguento PearsonPearson SARegistro MAPA: SP0000094-16Medicamento farmacéutico
solución de peróxido de hidrógenoRioquimicaMatrícula ANVISA: 218690015Material quirúrgico
IsofluoranoBioquímicoMatrícula ANVISA: 100630222Anestésico
IV Conjunto de goteo extensorgenérico-Fluidoterapia
IV Macro equipo de goteoDescarpack410301Fluidoterapia
Lactofur (ceftiofur)Ourofino SAInscripción MAPA: SP0000051-50Medicamento farmacéutico
Laringoscopio--Instrumento quirúrgico
Maxicam 2%Ourofino SARegistro MAPA: SP0000051-69Medicamento farmacéutico
Adhesivo de microporos 5 cm x 10 cm genérico1530Material quirúrgico
MidazolamHipolabor RegistroANVISA: 1134301430035Anestésico
Multi-Vía IV Set de InfusiónDescarpack413201Fluidoterapia
Aguja 40 mm x 1,2 mmDescarpack353601Aguja estéril para la aplicación de medicamentos y anestésicos.
Aguja 40 mm x 1,6 mmWiltexRegistro ANVISA: 10150470664Aguja estéril para la aplicación de medicamentos y anestésicos.
Portaagujasgenérico-Instrumentoquirúrgico
Nylon 2 suturas trheadShalon MedicalN502CTI40Material quirúrgico
Pluma ordinariagenérica-Plumaregular para tomar notas
Solución fisiológica 0,9% Bolsa de 500 mLJP FarmaMS:1.0491.0070Fluidoterapia
Ácido poliglicólico 2 hilo de suturaAtramatG4099-75HMaterial quirúrgico
Cloruro de potasioSamtecRegistro ANVISA: 1559200010139Medicamento parenteral
Guantes de procedimientoDescarpack122401Equipo de protección personal (EPP)
Propofol (Provive)Uniã o Quí micaRegistro ANVISA: 1049714490057Anestésico
Ringer solución de lactato bolsa de 500 mLJP FarmaMS:1.0491.0061Fluidoterapia
Riohex 0,5% solución de alcohol de clorexidinaRioquimica 218690356Asepsia quirúrgica
Riohex 2% solución de clorexidina con tensioactivoRioquímica218690356Asepsia quirúrgica
cuero cabelludo 21 gDescarpack421201Material quirúrgico
Fundas para zapatosEquipodeProtección Personal (EPP) genéricosCompresas
estérilesCremerRegistro ANVISA: 10071150065Material quirúrgico
Almohadilla de gasa estérilProcitexRegistro ANVISA: 80245210083Material quirúrgico
Paños quirúrgicos estériles 140 cm x 90 cm Venkuri7010003Material quirúrgico
Paños quirúrgicos estériles 150 cm x 190 cm PolarFixF00208Material quirúrgico
Guantes quirúrgicos estérilesMucamboCA: 39.317Equipo de protección individual (EPP)
Estetoscopiogenérico-Equipoquirúrgico
Gorro quirúrgicoDescarpack93201Equipo de protección individual (EPP)
Bata quirúrgicaDescarpack231101Equipo de protección individual (EPP)
Mascarilla quirúrgicaDescarpack110701Equipo de protección individual (EPI)
Tijeras quirúrgicas romas-romasgenéricas-Instrumentoquirúrgico
Tijeras quirúrgicas afiladas-afiladasgenéricas-Instrumentoquirúrgico
Grapadora quirúrgicaTradevet-Materialquirúrgico
Tekbond super glueTek Bond78072720030Material quirúrgico
Termómetrogenérico-Equipoquirúrgico
Llave de paso de tres víasSolidor374Material quirúrgico
Tramadol hidrocloruroAgener Uniã oRegistro MAPA: SP-000292-5.000002Anestésico
Apósito de película transparenteSkinupper RegistroANVISA: 82307460014Material quirúrgico
Adhesivo impermeable 10 cm x 4,5 cm genérico364828Material quirúrgico

Referencias

  1. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), 5758(2021).
  2. Xi, J., et al. Genetically engineered pigs for xenotransplantation: Hopes and challenges. Front Cell Dev Biol. 10, 1093534(2023).
  3. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim Sci. 3, 826324(2022).
  4. Wieczorek, J., et al. Laparoscopic embryo transfer in pigs - comparison of different variants and efficiencies of the method. Pol J Vet Sci. 26 (2), 295-306 (2023).
  5. Martinez, E. A., et al. Design, development, and application of a non-surgical deep uterine embryo transfer technique in pigs. Anim Front. 3 (4), 40-47 (2013).
  6. Wieczorek, J., et al. A new concept in minimally invasive embryo transfer. Ann Anim Sci. 20 (4), 1289-1308 (2020).
  7. Brussow, K. P., Torner, H., Kanitz, W., Ratky, J. In vitro technologies related to pig embryo transfer. Reprod Nutr Dev. 40 (5), 469-480 (2000).
  8. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim. Sci. 3, 826324(2022).
  9. Langendijk, P., vanden Brand, H., Soede, N. M., Kemp, B. Effect of boar contact on follicular development and on estrus expression after weaning in primiparous sows. Theriogenology. 54 (8), 1295-1303 (2000).
  10. Costea, R., Ene, I., Pavel, R. Pig sedation and anesthesia for medical research. Animals. 13, 3807(2023).
  11. Vierstraete, M., Der Vekens, N. V. an, Beckers, R., Renard, Y., Muysoms, F. Descriptive anatomy of the porcine ventral abdominal wall as a basis for training ventral hernia repair techniques. J Abdom Wall Surg. 3, (2024).
  12. Luna, S. P. L., et al. Validation of the UNESP-Botucatu pig composite acute pain scale (UPAPS). PLoS One. 15 (6), e0233552(2020).
  13. Arruda, P. H. E., Gauger, P. Optimizing sample selection, collection, and submission to optimize diagnostic value. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 98-111 (2019).
  14. Althouse, G. C., Kauffold, J., Rossow, S. Diseases of the reproductive system. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 373-392 (2019).
  15. Hao, Y., et al. Porcine skin-derived stem cells can serve as donor cells for nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 101-109 (2010).
  16. Rim, C. H., et al. The effect of the number of transferred embryos, the interval between nuclear transfer and embryo transfer, and the transfer pattern on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 143 (1-4), 91-96 (2013).
  17. Choi, K., et al. Production of heterozygous alpha 1,3-galactosyltransferase (GGTA1) knock-out transgenic miniature pigs expressing human CD39. Transgenic Res. 26 (2), 209-224 (2017).
  18. Shim, J., et al. Human immune reactivity of GGTA1/CMAH/A3GALT2 triple knockout Yucatan miniature pigs. Transgenic Res. 30 (5), 619-634 (2021).
  19. Glanzner, W. G., Rissi, V. B., Bordignon, V. Somatic cell nuclear transfer in pigs. Methods Mol Biol. 2647, 197-210 (2023).
  20. Kim, J. H., et al. Analysis of production efficiency of cloned transgenic Yucatan miniature pigs according to recipient breeds with embryo transfer conditions. Theriogenology. 218, 193-199 (2024).
  21. Navarro-Serna, S., Piñeiro-Silva, C., Romar, R., Parrington, J., Gadea, J. Generation of Gene Edited Pigs. , 71-130 (2022).
  22. Geisert, R. D., et al. Rapid conceptus elongation in the pig: An interleukin 1 beta 2 and estrogen-regulated phenomenon. Mol Reprod Dev. 84 (9), 760-774 (2017).
  23. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  24. Hazeleger, W., Kemp, B. Recent developments in pig embryo transfer. Theriogenology. 56 (8), 1321-1331 (2001).
  25. Youngs, C. R. Factors influencing the success of embryo transfer in the pig. Theriogenology. 56 (8), 1311-1320 (2001).
  26. Wieczorek, J., Koseniuk, J., Mandryk, I., Poniedziałek-Kempny, K. Piglets born after intrauterine laparoscopic embryo transfer. Pol J Vet Sci. 18 (2), 425-431 (2015).
  27. Brüssow, K. P., Rátky, J., Antosik, P., Kempisty, B., Jaśkowski, J. M. Embryo transfer in swine - an indispensable key for the application of reproduction techniques. Electron J Pol Agric Univ. 21 (3), (2018).
  28. Cadwallader, J. A., Alley, M. R. Malignant hyperthermia in a crossbred landrace-large white pig. N Z Vet J. 23 (9), 207-211 (1975).
  29. Fatehi Hassanabad, A., et al. Prevention of postoperative adhesions: A comprehensive review of present and emerging strategies. Biomolecules. 11 (7), 1027(2021).
  30. Shi, J., et al. Influence of embryo handling and transfer method on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 154, 121-127 (2015).
  31. Castagna, C. D., et al. Ovarian cysts and their consequences on the reproductive performance of swine herds. Anim Reprod Sci. 81 (1-2), 115-123 (2004).
  32. Knox, R. V. Factors influencing follicle development in gilts and sows and management strategies used to regulate growth for control of estrus and ovulation. J Anim Sci. 97 (4), 1433-1445 (2019).
  33. Galvin, J. M., Killian, D. B., Stewart, A. N. V. A procedure for successful nonsurgical embryo transfer in swine. Theriogenology. 41 (6), 1279-1289 (1994).
  34. Lins, R. D. A. U., et al. Use of cyanoacrylate in the coaptation of edges of surgical wounds. An Bras Dermatol. 87 (6), 871-876 (2012).
  35. Horvath-Pereira, B. deO., et al. Case report: An innovative non-invasive technique to manage shell injuries in C. carbonarius. Front Vet Sci. 9, 930419(2022).

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