La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el glioblastoma, una enfermedad para la que no hay cura. Aquí, reportamos una nano plataforma terapéutica de óxido de hierro guiada por imágenes in vivo que puede eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en el tumor.
Artículo de método
Entrega de nanopartículas de una carga útil de oligonucleótidos en un modelo animal de glioblastoma multiforme
En este artículo
Resumen
Resumen
El glioblastoma multiforme (GBM) es la forma más común y agresiva de neoplasia maligna cerebral primaria para la cual no existe cura. La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el GBM. Aquí se informa de una nanoplataforma de administración terapéutica basada en óxido de hierro guiada por imágenes capaz de eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en la región tumoral, entregando su carga útil. Esta nanoplataforma de 25 nm consta de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de dextrano reticuladas marcadas con colorante fluorescente Cy5.5 y que contienen oligonucleótidos antisentido como carga útil. El núcleo magnético de óxido de hierro permite el seguimiento de las nanopartículas a través de imágenes de resonancia magnética in vivo , mientras que el colorante Cy5.5 permite el seguimiento mediante imágenes ópticas. Este informe detalla el seguimiento de la acumulación de esta plataforma de nanopartículas (denominada MN-anti-miR10b) en tumores de glioblastoma implantados ortotópicamente después de una inyección intravenosa. Además, proporciona información sobre la administración in vivo de oligonucleótidos de ARN, un problema que ha dificultado la traducción de las terapias de ARN a la clínica.
Introducción
El glioblastoma multiforme (GBM) es el grado más alto de astrocitoma para el que prácticamente no hay cura. Aproximadamente 15.000 personas son diagnosticadas con glioblastoma anualmente, que tiene una mediana de supervivencia pésima de aproximadamente 15 meses y una tasa de supervivencia a 5 años del 5%1. En las últimas décadas, ha habido una mejora marginal en el pronóstico a pesar de los múltiples esfuerzos para avanzar en las opciones terapéuticas. El estándar actual de atención para la GBM incluye la resección quirúrgica máxima, cuando sea posible, seguida de radioterapia y quimioterapia2. La temozolomida (TMZ), la quimioterapia de elección, fue la última terapia para el glioblastoma que mostró una eficacia clínica notable; sin embargo, al menos el 50% de los tumores GBM muestran resistencia a TMZ3. A pesar de este riguroso régimen terapéutico, todavía existe una necesidad clínica significativa de mejorar el tratamiento del glioblastoma.
El desarrollo de terapias para el GBM y otras enfermedades relacionadas con el cerebro se ve obstaculizado significativamente por la naturaleza selectiva de la barrera hematoencefálica (BBB). La BHE es una barrera fisiológica compuesta por células endoteliales, pericitos y extremos de los pies de los astrocitos, que crea la membrana semipermeable entre el sistema circulatorio y el cerebro, restringiendo el libre paso de moléculas y células al cerebro4. Si bien es protector en la fisiología normal y crítico para la homeostasis cerebral, la BHE impide que muchas terapias lleguen al cerebro, lo que complica el tratamiento de la MBG. Los esfuerzos para mejorar la administración de terapias para GBM han llevado al desarrollo de vehículos de administración basados en nanopartículas, la mejora de la administración de fármacos por ultrasonido focalizado y la administración de fármacos mediada por receptores 5,6.
Las nanopartículas se han convertido en un medio prometedor para el desarrollo de terapias para una gran variedad de enfermedades, incluidos los cánceres. La aplicación de nanopartículas con fines imagenológicos y terapéuticos en GBM se ha intentado utilizando varias construcciones de nanopartículas 7,8. Con el enfoque en la administración de fármacos a GBM junto con la obtención de imágenes in vivo de la administración, el enfoque propuesto utiliza nanopartículas magnéticas (MN) que consisten en un núcleo de óxido de hierro y están cubiertas por dextrano para su estabilidad. Las propiedades magnéticas de estas nanopartículas permiten su detección por resonancia magnética (RM), mientras que la química de conjugación simple con el recubrimiento de dextrano aminado permite la conjugación de fracciones terapéuticas como moléculas de ARN, fracciones de focalización adicionales o fracciones de imagen (como el colorante óptico de infrarrojo cercano Cy5.5)9,10. Además de las capacidades de imagen, la nanoplataforma es capaz de prolongar la vida media de las terapias de ARN protegiendo el oligonucleótido de las nucleasas endógenas, mejorando la administración terapéutica. Aquí, se presenta la aplicación de esta nano plataforma para la administración in vivo de oligonucleótidos terapéuticos (denominados MN-anti-miR10b) a GBM, monitoreados por imágenes in vivo. Anteriormente, se demostró la capacidad de esta nanoplataforma para acumularse en células GBM in vitro, causando una pérdida significativa de viabilidad de las células tumorales11. Antes de realizar estudios terapéuticos in vivo, es necesario demostrar la entrega in vivo de esta nanoplataforma a los tumores GBM en modelos animales. Para lograr esto, se produjeron modelos animales ortotópicos de GBM, y se realizó la administración intravenosa del constructo seguida de imágenes in vivo. A continuación se describen los protocolos de estos estudios que muestran la acumulación en la región tumoral confirmada por imágenes in vivo y microscopía ex vivo.
Protocolo
Todos los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC). Se compraron ratones hembra exogados desnudos atímicos de Jackson Labs (cepa #007850) a las 7 semanas de edad y se les permitió aclimatarse durante 1 semana antes de la cirugía de implantación. Los ratones pesaban aproximadamente 21-25 g en el momento del implante. Las células U251 que expresan luciferasa de luciferasa fueron generadas y proporcionadas por la Dra. Ana deCarvalho12.
1. Cultivo celular y preparación para la implantación
- Cultivo de células de glioblastoma humano marcadas con luciferasa, U251 en el medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene D-glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio y suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C con 5% de CO2.
- Una vez que las células alcanzan el 70% de confluencia, tripsinizar con tripsina/EDTA al 0,25% durante 1-2 min a 37 °C. Utilice 2-4 mL para un matraz T-75, o 4-6 mL para un matraz T-175.
- Una vez que las células se hayan desprendido del matraz, apague la reacción con una proporción de 2:1 de DMEM suplementado y mezcle suavemente mediante pipeteo para disociar las células en una suspensión de una sola célula. Transfiera las células a un tubo cónico y granule las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Cuente las células con un hemocitómetro utilizando la tinción con azul de tripán para excluir las células muertas y calcular el número total de células vivas. Vuelva a pellet las células, como se describió anteriormente.
- Vuelva a suspender el pellet celular a una concentración de 1 x 108 células/mL en PBS y almacene la suspensión celular en hielo para la implantación intracraneal.
2. Implante de tumores ortotópicos a mano alzada
NOTA: Este protocolo es una adaptación de Irtenkauf et al. (procedimiento de la Dra. Ana deCarvalho; Centro de Tumores Cerebrales Henry Ford Health Hermelin)12. Todos los pasos deben llevarse a cabo en una cabina de bioseguridad para garantizar la seguridad tanto de los sujetos como de los investigadores. El método de implantación a mano alzada permite un procedimiento más rápido para lograr tamaños de muestra más grandes mientras se mantiene la calidad de la implantación intracraneal. Alternativamente, se puede utilizar un dispositivo estereotáxico para implantar el tumor en las mismas coordenadas que se describen a continuación.
- Pesar el ratón atímico desnudo y administrar una solución anestésica de ketamina/xilacina (100 mg/kg/10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal con una jeringa de 28 G. Coloque el mouse en una jaula de recuperación encima de una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. Confirme la anestesia comprobando el reflejo del pedal.
- Aplique ungüento oftálmico para los ojos, administre ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea con una jeringa de 28 g y dé punzones identificativos en los oídos.
- Esterilice el sitio quirúrgico en la parte superior de la cabeza con etanol al 70% seguido de un exfoliante con betadine y repita 3 veces. Luego, haga una incisión de 5-7 mm con unas tijeras quirúrgicas pequeñas a la derecha de la línea media de la cabeza y retraiga la piel con pinzas finas para exponer el cráneo y las líneas de sutura del cráneo.
- Frote el cráneo con un hisopo de algodón para eliminar el periostio, permitiendo el acceso al hueso. Aplique una solución de peróxido de hidrógeno al 3% con un hisopo de algodón nuevo para secar el hueso. Con un hisopo de algodón nuevo, limpie el exceso de peróxido de hidrógeno y cualquier espuma que pueda formarse. Repita este paso 3 veces hasta que el bregma sea visible en el cráneo y el hueso esté lo suficientemente seco como para perforar. Un cráneo suficientemente seco tendrá líneas de sutura muy blanqueadas y un enrojecimiento reducido desde la apariencia inicial.
- Con respecto al brema mida -2,5 mm medial/lateral y -1 mm anterior/posterior con una regla y marque el sitio de perforación con un marcador. Mida de nuevo antes de perforar para asegurarse de que la marca esté en la posición correcta.
- Tome un taladro de microcirugía eléctrico (11.000 RPM) con una fresa de 0,5 mm y haga con cuidado un agujero en el cráneo donde se marcó anteriormente. Absorba cualquier sangre o líquido que pueda acumularse en el sitio de perforación con un hisopo de algodón nuevo.
- Prepare una jeringa de microlitros de 33G provista de un manguito de aguja con una longitud de aguja expuesta de 3 mm. Extraiga 5 μL de la suspensión de 1 x 108 celdas/ml previamente preparada después de resuspender brevemente con una pipeta y asegúrese de que no haya burbujas en la solución inyectable. Limpie cuidadosamente cualquier exceso de suspensión celular que quede en el exterior de la aguja y el manguito de la aguja con una toallita de isopropanol al 70%.
- Inserte la aguja verticalmente en el sitio de perforación hasta que el manguito de la aguja detenga la inserción adicional de la aguja. Retraiga con cuidado la aguja aproximadamente 0,5 mm para crear espacio para que se acumulen las células inyectadas.
- Inyecte lentamente la suspensión celular durante un período de 1 min. Una vez que se haya inyectado todo el volumen, sostenga la aguja en profundidad durante un minuto adicional para reducir el flujo de la solución inyectable. Luego, retraiga la aguja con cuidado.
- Con un hisopo de algodón limpio, limpie cualquier líquido que se acumule en el lugar de la inyección y luego aplique cera de hueso para sellar el orificio.
- Cierre la incisión con una unión veterinaria y deje que se seque. Con un bastoncillo de algodón limpio, aplique lidocaína tópica como analgésico.
- Monitoree el mouse hasta que esté completamente recuperado y deambulatorio. Administrar ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea durante 2 días después de la implantación para el tratamiento del dolor.
3. Síntesis de plataforma de nanopartículas
- Sintetizar y conjugar las nanopartículas con Cy5.5 y oligonucleótido (anti-miR10b) como se ha descrito anteriormente11.
4. Administración de MN-anti-miR10b
NOTA: En este estudio, las inyecciones se realizaron una vez a la semana durante 6 semanas a partir de 7 días después de la implantación, pero se puede usar el mismo protocolo para varias frecuencias de inyección.
- Pesar el ratón y calcular el volumen de MN-anti-miR10b para administrarlo al ratón. Las dosis de MN-anti-miR10b se administran a dosis de 20 mg Fe/kg en modelos murinos de GBM. Por ejemplo, un ratón de 20 g recibe una dosis de 80 μL de 5 mg de Fe/mL de MN-anti-miR10b. Los ratones de control reciben un volumen igual de PBS de acuerdo con este esquema de dosificación.
- Prepare una jeringa de 28 g con la dosis de MN-anti-miR10b y asegúrese de que no haya burbujas en la solución inyectable.
- Anestesiar el ratón con isoflurano al 2%-4% para la inducción y al 1,5%-2% para el mantenimiento con un caudal de 1,5 L/min en una caja de inducción. Mueva el ratón a un cono de la nariz y continúe administrando la anestesia. Verifique la profundidad de la anestesia y aplique ungüento veterinario.
- Esterilice la cola con una toallita de isopropanol al 70% y deje que se seque el exceso de alcohol.
- Gire la cola para colocar las venas caudales laterales en la parte superior de la cola. Luego, apuntando a la vena, inserte la aguja en la cola y establezca un vacío tirando hacia atrás del émbolo.
- Inserte la aguja hasta que la sangre ingrese a la jeringa, lo que indica que se ha ingresado correctamente a la vena.
- Inyecte lentamente MN-anti-miR10b y retraiga la aguja después de completar el parto. Aplique presión en el sitio de la inyección con una gasa hasta que se detenga el sangrado.
- Retire el ratón del cono de la nariz. Monitoree el mouse hasta que esté completamente recuperado y deambulatorio.
NOTA: La administración de nanopartículas en bolo puede causar dificultad respiratoria. Vigile cuidadosamente al ratón e inmediatamente aplique compresiones torácicas ligeras si hay signos de dificultad respiratoria.
5. Imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia in vivo
NOTA: Las imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia in vivo se realizan en el Sistema de Imágenes In Vivo (IVIS) antes y 24 horas después de inyectar la nanopartícula.
- Prepare D-luciferina filtrada estérilmente a una concentración de 30 mg/mL en PBS sin Mg2+ y Ca2+.
- Abra el software de operación IVIS y comience la inicialización para preparar la máquina. Mientras se inicializa el sistema, seleccione una carpeta para guardar imágenes seleccionando Adquisición > Guardar automáticamente en y defina la carpeta para los archivos que se van a guardar.
- En los puntos temporales de la imagen, pesar el ratón y calcular el volumen de D-luciferina a administrar para una dosis de 150 mg/kg. Prepare una jeringa de 28 g con el volumen, protegiendo la solución de la luz directa. Este estudio incluyó imágenes 2 días después de la cirugía de implantación para confirmar la siembra, y pruebas de imagen semanales que comenzaron el día 7 después del implante, inmediatamente antes de los tratamientos semanales.
- Anestesiar el ratón con isoflurano al 2%-4% para la inducción y al 1,5%-2% para el mantenimiento con un caudal de 1,5 L/min en una cámara de inducción. Una vez anestesiado, frote suavemente el ratón para evitar lesionar más el sitio quirúrgico e inyecte la dosis de D-luciferina por vía intraperitoneal. Deje que el mouse se recupere y espere 10 minutos antes de tomar imágenes para permitir que la señal de bioluminiscencia se desarrolle y estabilice.
- Mientras se desarrolla la señal de bioluminiscencia, prepare el escáner IVIS para la obtención de imágenes de bioluminiscencia. Coloque la estera negra de baja fluorescencia en la platina de imagen y configure la matriz de conos de la nariz para el número de sujetos que se van a fotografiar.
- En el software, haga clic en Asistente para imágenes. Seleccione Imágenes de bioluminiscencia y, a continuación, seleccione Abrir filtro. En la siguiente pantalla, seleccione Sujeto de imagen y campo de visión. El IVIS ahora está configurado para imágenes de bioluminiscencia.
- A los 3 minutos antes de la toma de imágenes, comience a cebar la caja de inducción permitiendo que la mezcla de isoflurano y oxígeno llene la caja. 2 minutos antes de la toma de imágenes, coloque los ratones en la caja de inducción para la anestesia.
- Una vez anestesiados, mueva los ratones de la caja de inducción al IVIS para obtener imágenes y acuéstelos en posición prona. Proporcionar anestesia de mantenimiento utilizando isoflurano al 2% durante la toma de imágenes.
- Una vez que los ratones se hayan colocado en el escáner IVIS, haga clic en Adquirir secuencia. Tome una imagen con la configuración de exposición automática con un umbral de señal mínimo de 3.000 recuentos. Las imágenes de bioluminiscencia visualizan la localización de las células de glioblastoma U251 marcadas con luciferasa. La exposición automática capturará una imagen con una duración de exposición calculada en función de la señal más brillante a la vista hasta la duración máxima definida por el usuario de 5 minutos.
NOTA: Una jaula típica de ratones requiere una sola imagen, ya que la siembra es generalmente uniforme. En los casos con uno o más ratones brillantes, se pueden eliminar los ratones y se puede repetir la adquisición para capturar mejor las señales de los ratones tenues. - Después de las imágenes de bioluminiscencia, cambie la configuración de IVIS para preparar imágenes de epifluorescencia y realizar exploraciones de fluorescencia.
- En el Asistente para imágenes, seleccione Fluorescencia > Par filtrado con epiiluminación. En la siguiente pantalla, seleccione las sondas que se van a visualizar, como Cy5.5. Seleccione el sujeto de la imagen y el campo de visión. El escáner IVIS ahora está configurado para imágenes de fluorescencia de las sondas seleccionadas en la pantalla anterior.
- Tome una imagen con la configuración de exposición automática con un umbral de señal mínimo de 6.000 recuentos. Las imágenes de fluorescencia Cy5.5 visualizan la localización de MN-anti-miR10b. La exposición automática capturará una imagen con una duración de exposición calculada en función de la señal más brillante a la vista hasta la duración máxima definida por el usuario de 5 minutos.
NOTA: Las imágenes de fluorescencia rara vez tardan más de 1 minuto en exposiciones, incluso en ratones de control inyectados con PBS. Una sola imagen siempre es suficiente, ya que la desviación de la señal entre los ratones tratados es pequeña. - Retire el ratón del IVIS después de la toma de imágenes. Monitoree hasta que esté completamente recuperado de la anestesia y la ambulación.
6. Resonancia magnética in vivo
NOTA: La resonancia magnética se realiza antes y 24 horas después de la inyección de nanopartículas y se puede realizar en los mismos animales que se someten a la inyección óptica y de bioluminiscencia.
- Anestesiar al ratón sujeto en una caja de inducción con 2%-4% de isoflurano para la inducción y 1,5%-2% para mantenimiento con un caudal de 1,5 L/min. Una vez anestesiado, coloque al ratón boca abajo en la cama de resonancia magnética encima del balón de monitoreo respiratorio. Coloque el cono de la nariz cómodamente en el hocico para administrar anestesia durante la toma de imágenes y aplique un ungüento oftálmico para los ojos.
- Inmovilice y coloque la cabeza para escanear con una barra de mordida y barras para los oídos.
- Instale la sonda de temperatura rectal lubricada y asegúrese de que el monitoreo de la respiración y la temperatura funcione. Coloque la bobina cerebral del ratón sobre la cabeza colocando las clavijas de la cama del ratón en los agujeros de la bobina y pegue la bobina en su lugar para reducir el movimiento durante el escaneo.
- Coloque una pequeña almohadilla de circulación de agua tibia sobre la parte superior del mouse para mantener la temperatura corporal mientras está anestesiado. Tenga cuidado de dejar cierta distancia entre la bobina y la manta térmica para limitar la distorsión de la imagen por interferencia del agua.
- Mueva el ratón y la base de imágenes a su posición para el escaneo.
- Ajuste y haga coincidir las bobinas de resonancia magnética iniciando el paso de configuración de Wobble en el software de adquisición. En el extremo de servicio de la resonancia magnética, use las perillas de sintonización y coincidencia en la bobina para asegurarse de que la traza esté centrada (sintonización) y lo más profunda posible (coincidencia).
- Adquiera un escaneo localizador de tres planos y ajuste el lecho de imágenes para posicionar el cerebro en el isocentro del imán, si es necesario.
- Adquiera exploraciones ponderadas 2D T2 para detectar el agente inyectado en el tumor con los siguientes parámetros: tiempo de repetición (TR) = 2500 ms, tiempo de eco (TE) = 25 ms, campo de visión (FOV) 20 x 20 mm, 18 cortes coronales, espacio de corte de 0,2 mm, resolución en el plano de 150 x 150 μm, grosor de corte de 0,5 mm.
- Adquiera un mapa B0 de todo el cerebro para calcular una cuña localizada utilizando la utilidad Mapshim. A continuación, utilice imágenes ponderadas 3D T2 para visualizar las nanopartículas con TR = 30 ms, TE = 10 ms, campo de visión 20 x 15 x 12 mm, resolución isótropa de 100 μm.
- Adquiera el mapa T2* para obtener más imágenes de nanopartículas utilizando la imagen ponderada T2 2D como referencia para el escaneo de posición sobre el tumor. Utilice TR = 800 ms, TE = 3,5 ms. Campo de visión de 20 x 20 mm, 5 cortes coronales, sin espacio entre cortes. Resolución en plano 100 μm en plano. Adquiera 10 imágenes de eco positivo con un espaciado de tiempo de eco de 5 ms.
- Controle la respiración y la temperatura corporal a lo largo de las secuencias de imágenes y ajuste la temperatura del isoflurano y del agua si es necesario.
- Después de la toma de imágenes, retire el ratón del escáner de resonancia magnética y colóquelo en una jaula de recuperación con calor. Monitoree el ratón hasta que esté completamente recuperado de la anestesia y la deambulación.
7. Imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia ex vivo
- Realizar imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia ex vivo en el IVIS, similares a las imágenes in vivo . Lleve a cabo los pasos de inicialización y configuración de escaneo de IVIS como se describe anteriormente.
- En el punto final experimental, pesar el ratón y calcular el volumen de D-luciferina a administrar para una dosis de 150 mg/kg. Inyecte la dosis de D-luciferina y realice imágenes en vivo 10 minutos después de la inyección, como se describió anteriormente.
- Después de las imágenes finales de bioluminiscencia y fluorescencia in vivo , eutanasiar rápidamente al ratón por dislocación cervical mientras aún está bajo anestesia, diseccionar el ratón y recolectar los órganos principales, incluido el cerebro, en una placa de Petri.
- Coloque la placa de Petri con los órganos extirpados en el escáner IVIS y obtenga imágenes de los órganos con las modalidades de bioluminiscencia y fluorescencia utilizando los mismos ajustes de adquisición que las imágenes in vivo .
- Congele rápidamente cualquier órgano necesario para un análisis posterior en OCT bajando lentamente el criomold con la muestra en OCT a un charco poco profundo de nitrógeno líquido con pinzas largas hasta que la OCT se vuelva completamente blanca. No permita que el nitrógeno líquido toque el OCT líquido o baje el molde demasiado rápido, ya que se producirán burbujeos del OCT. Almacene las muestras congeladas a -80 °C.
- Almacene el cerebro que contiene el tumor en OCT y congele rápidamente para la criosección. Almacenar a -80 °C hasta que sea necesario para el análisis.
8. Microscopía de fluorescencia
- Prepare el criostato para la criosección. Ajuste las temperaturas de la cámara y del cabezal de la muestra entre -15 °C y -20 °C.
- Saque el cerebro ultracongelado en OCT del almacenamiento a -80 °C y colóquelo dentro de la cámara de criostato. Deje que las muestras se calienten a la temperatura de la cámara (-20 °C) antes de cortarlas.
- Con una navaja de afeitar de un solo filo, corte el cerebro coronalmente en el lugar de la inyección. Por lo general, esto es visible como un hoyuelo en la superficie del cerebro. Monte la muestra en el disco de muestra usando una pequeña cantidad de OCT para posicionar el lado cortado del cerebro que se va a seccionar. Aplique suficiente presión con el peso enfriado dentro de la cámara para garantizar un montaje estable de la muestra.
- Mueva la muestra montada y el disco de muestra a la cabeza de la muestra en preparación para el corte. Recorte el tejido a la profundidad deseada tomando secciones de 20 μm, ajustando el ángulo de la muestra para seccionar el tejido lo más cerca posible del nivel.
- Una vez que se haya alcanzado la profundidad de tejido deseada, ajuste el criostato para tomar secciones de 5 a 7 μm de la muestra. Monte las secciones en portaobjetos de vidrio preetiquetados con descriptores como la identificación del ratón, el tejido seccionado y el número de portaobjetos bajando rápidamente el lado cargado del portaobjetos del microscopio sobre la sección.
- Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% fresco. Sumerja el portaobjetos con pañuelo en la solución de PFA durante 15 minutos para fijar el tejido. Enjuague el portaobjetos con DPBS 3 veces después de la fijación.
- A la sección de tejido ahora fijada en el portaobjetos de vidrio, agregue una gota de 40 μL de medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que tiñe los núcleos celulares. Coloque con cuidado un cubreobjetos de vidrio de 24 mm x 50 mm en la parte superior del medio de montaje y asegúrese de que todo el tejido haya quedado encajonado en el medio de montaje.
- Visualice el tejido mediante microscopía de fluorescencia DAPI (emisión (em) a 359 nm, excitación (ex) a 457 nm) y Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm).
Resultados
Se sintetizó y caracterizó MN-anti-miR10b, como se describió anteriormente11. La microscopía electrónica de transmisión de MN-anti-miR10b muestra la morfología y polidispersidad de la nanoplataforma (Figura 1B). Esta nanoplataforma tiene un tamaño promedio de 25,12 ± 0,34 nm con un potencial zeta de 13,18 ± 1,47 mV (Figura 1C,D). En estos estudios, se implantaron ortotópicamente células de glioblastoma humano U251 a ratones atímicos desnudos siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Se realizaron inyecciones intravenosas sistémicas de MN-anti-miR10b a 20 mg Fe/kg. Los ratones fueron sacrificados y los tejidos se recolectaron 7 días después de la dosis final del nanofármaco. Las señales de fluorescencia y bioluminiscencia Cy5.5 en ratones inyectados con MN-anti-miR10b mostraron una clara colocalización (Figura 2A,B), lo que indica la entrega de las nanopartículas al tumor, mientras que los ratones de control no mostraron señal de fluorescencia. Las imágenes de fluorescencia ex vivo mostraron la localización de las nanopartículas en los principales órganos de eliminación, como el hígado y los riñones, lo que se espera para este tipo de nanopartículas (Figura 2C). En un estudio separado, a los ratones se les implantaron ortotópicamente células GBM, como se mencionó anteriormente, y se les sometió a imágenes de resonancia magnética in vivo. Se obtuvieron imágenes ponderadas deT2* y mapas deT2* antes de la administración de las nanopartículas y 24 h después de una dosis única de 20 mg Fe/kg. Una disminución característica en la señal de resonancia magnética ponderada enT2 demuestra el potencial de MN-anti-miR10b como agente de contraste de resonancia magnética para atravesar la barrera hematoencefálica y su acumulación en la región tumoral (Figura 3). Después de las imágenes in vivo, se realizó una microscopía de fluorescencia para verificar aún más la entrega de nanopartículas al tumor. Como se describió anteriormente, los tejidos se seccionaron y se prepararon para la microscopía con tinción con DAPI. Se mostró una señal de fluorescencia Cy5.5 en la región tumoral, confirmando el parto (Figura 4).
Figura 1. Caracterización de MN-anti-miR10b. (A) Una estructura esquemática de un MN-anti-miR10b. La nanoplataforma consiste en un núcleo de óxido de hierro cubierto con dextrano, marcado con un colorante óptico Cy5.5 y conjugado con oligonucleótido terapéutico (anti-miR10b). Creado con BioRender.com. (B) Microscopía electrónica de transmisión de MN-anti-miR10b. (C) El tamaño hidrodinámico de la construcción es de 25,12 ± 0,34 nm. (D) El potencial zeta de MN-anti-miR10b es de 13,18 ± 1,47 mV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Estudios in vivo y ex vivo en modelo GBM. (A) Las imágenes de bioluminiscencia in vivo (izquierda) y las imágenes de fluorescencia (derecha) muestran la colocalización de la señal de nanopartículas magnéticas en la región tumoral. (B) Las imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia ex vivo de cerebros extirpados confirman la colocalización de la señal. (C) La biodistribución de los órganos muestra acumulación en los principales órganos de eliminación. B: Cerebro; H: Corazón; Lu: Pulmones; Li: Hígado; S: Bazo; K: Riñones; M: Músculo; (n=6 para todos los grupos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. In vivo Resonancia magnética en modelo GBM. Imágenes ponderadas T2* (fila superior) y mapas T2* (fila inferior) obtenidas antes (izquierda) y 24 h después de la inyección (derecha) de MN-anti-miR10b. La disminución de la intensidad de la señal en la imagen posterior a la inyección es indicativa de acumulación de óxido de hierro (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Microscopía de fluorescencia ex vivo de tejidos tumorales. Las imágenes microscópicas representativas muestran la acumulación de nanopartículas. Azul - DAPI, Magenta - Cy5.5. Barra de escala = 100 μm; (n=6 para todos los grupos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Varios pasos críticos en los diferentes métodos de validación de la acumulación de las nanopartículas en la BBB pueden ser decisivos para el éxito del protocolo. A partir de la implantación ortotópica de células GBM, es importante asegurarse de que las líneas de sutura del cráneo sean visibles después de secar el hueso; Esto ayuda a la colocación precisa de las células tumorales. Para perforar el cráneo, es mejor aplicar una ligera presión en el sitio de perforación y comenzar a perforar para hacer una impresión poco profunda en el hueso. Una vez que se hace la marca inicial y en la ubicación correcta, es más fácil perforar con un deslizamiento mínimo de la perforación. Deje de perforar inmediatamente después de perforar el cráneo para minimizar el daño al cerebro. Durante la inyección intravenosa de nanopartículas y otros agentes, es fundamental asegurarse de que no haya burbujas de aire en la solución inyectable para evitar embolias gaseosas venosas potencialmente mortales. Algunos indicadores de entrada exitosa en la vena de la cola siguiendo este protocolo son la extracción de sangre en la jeringa y la pérdida de color en la vena de la cola alrededor de la punta de la aguja. Para la obtención de imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia ex vivo de tejidos extirpados, es mejor trabajar rápidamente ya que la señal de bioluminiscencia comienza a decaer con el tiempo. La cinética de la señal de bioluminiscencia puede variar entre líneas celulares, por lo que es importante comprender modelos específicos.
Ciertos pasos se pueden modificar para ayudar en la detección de la localización de nanopartículas. Durante las imágenes de bioluminiscencia in vivo , las variaciones en la implantación de células tumorales y las tasas de crecimiento tumoral pueden provocar diferencias en la señal de bioluminiscencia. En determinadas circunstancias, el ratón con la señal BLI más alta puede acortar el tiempo de exposición de la exploración, lo que provoca una disminución de la señal detectada en otros ratones. En este caso, es aconsejable continuar con el escaneo de fluorescencia para que los ratones permanezcan en la misma posición con fines de colocalización de BLI y FLI. Luego, vuelva a crear una imagen de la bioluminiscencia después de eliminar los ratones que mostraron señal en el escaneo BLI inicial. Esto dará como resultado que el cálculo del tiempo de exposición se base en estos ratones de señal más baja y, en última instancia, la detección del tumor. Al tomar imágenes de fluorescencia in vivo , la localización de nanopartículas en el cuerpo puede determinarse mejor cubriendo la cola con papel negro, que puede tener una alta señal de fluorescencia debido a la presencia residual de nanopartículas de las inyecciones de la vena de cola. En una línea de razonamiento similar, durante el escaneo de fluorescencia ex vivo de los órganos, la obtención de imágenes del cerebro por sí sola puede mostrar mejor la localización de la nanopartícula en el cerebro y la región tumoral, ya que la acumulación de la nanopartícula en los órganos del sistema reticuloendotelial puede oscurecer la detección de señales.
Una limitación de este método para la administración terapéutica de ARN es la distribución sistémica de las nanopartículas en el cuerpo. Como es el caso con todas las demás inyecciones sistémicas, el tratamiento es eliminado del torrente sanguíneo por órganos como el hígado, los riñones y el bazo, lo que en última instancia resulta en una disminución de la entrega de la nanopartícula a la región de interés. Para abordar este problema, MN-anti-miR10b se ha sintetizado con un recubrimiento de dextrano reticulado para aumentar el tiempo de circulación en el cuerpo13. A pesar de los esfuerzos por aumentar el tiempo de circulación y la acumulación mediante la optimización de la estructura de la nanopartícula, es posible que se requieran múltiples inyecciones de la nanopartícula para una acumulación significativa en la región tumoral, dependiendo del modelo específico y el estado de la enfermedad.
La administración de moléculas terapéuticas en GBM representa un desafío importante debido a la BBB altamente selectiva. Muchos estudios han probado vehículos de entrega basados en nanopartículas, que finalmente son ineficaces en la penetración de la BHE debido a su tamaño y carga 5,6,7. La construcción de nanopartículas de 25 nm, MN-anti-miR10b, descrita aquí, es capaz de atravesar esta barrera fisiológica y acumularse en la región tumoral cuando se inyecta sistémicamente. Esta plataforma de nanopartículas tiene el potencial de mediar la entrega de moléculas de ARN a GBM y permite el monitoreo de la acumulación del vehículo de entrega mediante imágenes. La biodistribución de las nanopartículas de óxido de hierro sigue un patrón esperado, donde se acumulan en los órganos del sistema reticuloendotelial para su eliminación. Se ha informado de una biodistribución similar con nanopartículas análogas utilizadas con fines terapéuticos o de imagen. Es importante destacar que en estos estudios previos no hubo indicios de toxicidades asociadas fuera del objetivo en los órganos principales, incluso a una dosis de 30 mg de Fe/kg 14,15.
Una ventaja de este sistema de plataforma de nanopartículas son las capacidades de imagen in vivo que permiten un seguimiento no invasivo de su acumulación. El tinte fluorescente de infrarrojo cercano Cy5.5 conjugado con la capa de dextrano permite obtener imágenes ópticas rápidas para detectar su presencia. Además de esta modalidad, el núcleo superparamagnético de nanopartículas de óxido de hierro de MN-anti-miR10b hace que la construcción sea adecuada como agente de contraste para resonancia magnética y representa un área en desarrollo de la teranóstica16. La resolución anatómica de la resonancia magnética en combinación con el contraste de nanopartículas de óxido de hierro puede mostrar con precisión dónde se acumulan las nanopartículas en el cerebro. Estas dos modalidades juntas hacen posible el seguimiento preclínico in vivo de la nanoplataforma para monitorear la entrega del ARN u otras cargas útiles a través de la BBB.
Divulgaciones
Z.M. y A.M. son cofundadores y accionistas de TransCode Therapeutics Inc. El resto de los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
El financiamiento para este estudio fue proporcionado en parte por la subvención de la Alianza de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Michigan Henry Ford Health Systems a A.M. y A.dC. Agradecemos a la Dra. Danielle R. Ferguson por supervisar los estudios con animales en la Universidad Estatal de Michigan y por aprobar este video.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones "J:NU" desnudos atímicos | Laboratorio Jackson | RRID:IMSR_JAX:007850 | Modelo de ratón inmunodeprimido |
| 0.25% Tripsina | Gibco | 25200-056 | Reactivo de cultivo celular para tubo |
| microcentrífuga U251 1.7 mL | DOT Scientific | RN1700-GMT | Para recolección de tejidos |
| 10 y micro; L, Jeringa Neuros, Modelo 1701 RN, calibre 33, Punta Estilo 4 | Hamilton | 65460-06 | Jeringa para la implantación intracraneal de células tumorales |
| 3M Vetbond | 3M | 1469SB | Adhesivo tisular para el cierre de la zona quirúrgica |
| 4% Paraformaldehído | Thermo Scientific | J199943-K2 Solución de fijación de | tejidos |
| Toallita con alcohol isopropoilo al 70 % | Cardinal | MW-APL | Toallita antiséptica tópica para la implantación de tumores y la inyección de venas de cola |
| Aperio Versa | Leica | Para el escaneo de portaobjetos de secciones de tejido teñidas | |
| Betadine Surgical Scrub Purdue 6761815101 | Antiséptico tópico para la implantación de | ||
| tumoresBioSpec 70/30 | Bruker | Escáner de resonancia magnética | |
| Cera | Medline DYNJBW25 | Cera ósea para sellar el sitio de implantación | |
| Fresas para Micro taladro | F.S.T. | 19007-05 | Fresa de perforación utilizada para hacer un agujero en el cráneo para la implantación de tumores |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 Medios de | montaje de tejidos que contienen tinción de DAPI |
| Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM) | Gibco | 11995-065 | Medios de cultivo celular para pinzas |
| de Graefe extrafinas | F.S.T. | 11150-10 | Herramienta quirúrgica para la implantación de tumores Suero |
| fetal bovino | Corning | 35-010-CV Suplemento de | medios de cultivo celular para U251 |
| Tijeras finas - Afiladas 10,5 cm | F.S.T. | 14060-10 | Herramienta quirúrgica para la implantación de tumores |
| Glydo (lidocaína) | Sagent | 673-76 | Analgésico tópico para el sitio quirúrgico |
| Ideal Micro Drill | CellPoint Scientific | 67-1200A | Taladro utilizado para hacer un agujero en el cráneo para la implantación de tumores |
| Jeringa de insulina 1CC 29G X 1/2 " | Becton, Dickinson | 324704 | Jeringa para inyección de D-Luciferina e inyección en la vena de cola de nanopartículas |
| Isoflurano | Covetrus | 11695067772 | Anethesia |
| Vaporizador de isoflurano | SOMNI Scientific | VS6002 | Aparato de anestesia |
| IVIS SpectrumCT Sistema de imagen in vivo | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Escáner de imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia |
| IVISbrite D-Luciferina Sal de potasio | PerkinElmer/Revvity | 122799-100MG | Sustrato para la obtención de imágenes de bioluminiscencia |
| Ketaset (Ketamina) | Zoetis | 10004027 | Anestésico para la cirugía de implantación de tumores |
| Ketofen (Ketoprofeno) | Zoetis | 10004031 Analgésico para la cirugía de implantación de tumores | |
| Leica CM1950 | Leica | CM1950 | Para la criosección de muestras incrustadas en OCT |
| PBS | Gibco | 14190-144 | Reactivo de cultivo celular y solución de suspensión celular para la implantación de U251 |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Antibiótico para medios de cultivo celular para U251 |
| Pomada veterinaria Puralube | MWI Veterinary | 27505 | Pomada oftálmica para los ojos para la protección durante la implantación del tumor |
| Ruler | F.S.T. | 18000-30 | Se utiliza para medir el sitio de perforación para la implanación |
| Tissue-Tek Cryomold Intermedio 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | Molde de recolección para la recolección de muestras de tejido |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Compuesto de congelación para la recolección |
| de muestras de tejido U-251 MG línea celular | humana Millapore Sigma 9063001 | línea celular de glioblastoma humano | |
| Solución inyectable de xilacina, 100 mg/ml | Covetrus | 1XYL006 | Paralítico para cirugía de implantación tumoral |
Referencias
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