Este protocolo describe el procedimiento para aislar la retina de ratón de montaje completo y realizar inmunotinción para marcar todas las células ganglionares de la retina (RGC). Al proceso le siguen las imágenes y el recuento automático de las RGC mediante un software basado en IA, lo que proporciona un método sencillo, rápido y preciso para cuantificar las RGC en toda la retina del ratón.
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Artículo de método
Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón
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En este artículo
Resumen
Resumen
El glaucoma es una de las principales causas de ceguera a nivel mundial, caracterizado por un mecanismo patogénico complejo que dificulta la recuperación de la visión. Los ratones sirven como modelos animales valiosos para estudiar la patogénesis y el tratamiento del glaucoma debido a su fondo genético relativamente homogéneo y a las células ganglionares de la retina (RGC), que estructuralmente se parecen a las de los humanos. La evaluación precisa del daño de RGC y los resultados del tratamiento en modelos de glaucoma de ratón requiere determinar el número de RGC en toda la retina. Este protocolo describe un método integral que implica el aislamiento de toda la retina, el etiquetado de las RGC con anticuerpos específicos y el recuento automático rápido y preciso de las RGC mediante un programa basado en IA. El enfoque simplificado permite una cuantificación eficiente y precisa de los números de RGC en las retinas de ratones, lo que facilita la evaluación de la degeneración de RGC y las posibles intervenciones terapéuticas. Al permitir a los investigadores evaluar el alcance del daño de RGC, este protocolo contribuye a una comprensión más profunda de la patogénesis del glaucoma y ayuda a desarrollar estrategias de tratamiento efectivas para controlar y prevenir la pérdida de visión.
Introducción
El glaucoma se caracteriza por la muerte progresiva de las células ganglionares, lo que supone un importante reto para la restauración de la visión 1,2. Esta enfermedad es uno de los principales focos de investigación oftalmológica debido a su prevalencia e impacto en la visión3. Los modelos de ratón son indispensables en el glaucoma
debido a su bagaje genético homogéneo, su alta capacidad reproductiva y la similitud de sus propiedades de células ganglionares con las de los seres humanos4. El objetivo principal de este método ....
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Protocolo
El procedimiento cumplió con las directrices de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología para el uso de animales en investigación y fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital Popular Provincial de Sichuan. En este estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6J (de 2 meses de edad). La figura 1 ilustra el procedimiento general descrito aquí. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Aislamiento de retinas de montaje completo<....
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Resultados
Este protocolo detalla la metodología para la inmunotinción de montaje completo de retinas de ratón, lo que garantiza una preparación meticulosa del tejido, una incubación precisa de anticuerpos y un recuento celular automatizado fiable. El procedimiento facilita el etiquetado y la cuantificación robustos de las células ganglionares de la retina (RGC), lo que permite una evaluación precisa de las poblaciones celulares en diversos contextos experimentales. El método se utilizó para contar las CGR en ratones de tipo salvaj.......
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Discusión
Este protocolo proporciona un método para determinar todas las células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón, que se puede utilizar para monitorear la progresión de la degeneración de RGC en modelos de ratón para estudios de glaucoma. La retina del ratón es un tejido nervioso delicado5, y el aislamiento de las retinas de montaje completo de los ojos del ratón requiere una práctica repetida. Durante la experimentación, se encontró que el tiempo d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto de investigación contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82371059 (H.Z.)), el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan, China (2023JDZH0002 (H.Z.)), la Oficina de Ciencia y Tecnología de Chengdu (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)) y el Hospital Popular Provincial de Sichuan (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1&veces; PBS | Servicebio | G4202 | |
| Alexa594-conjugado Cabra Anti-Conejo IgG (H+L) | ThermoFisher | A-11012 | |
| Anticuerpo anti-BRN3A [EPR23257-285] | Abcam | ab245230 | |
| Software | https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs | ||
| Disco en la nube | Enlace de unidad | https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 | |
| Disco en la nube | Enlace Baidu | Código de extracción: g44k | https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg |
| Rotulador | Sharpie | ||
| Normal Donkey Serum | Biosharp, Labgic | 25030081 | |
| Paraformaldehído | Macklin | P804536 | |
| ProClean 300 | Beyotime | ST853 | |
| Sacarosa | BBI, Sangon | A610498 | |
| Triton X-100 | BioFroxx, neoFroxx | 1139ML100 |
Referencias
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peri....
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Reimpresiones y permisos
