Artículo de método

Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón

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DOI:

10.3791/66991

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4 de octubre de 2024

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1Sichuan Provincial Key Laboratory for Human Disease Gene Study, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 3Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para aislar la retina de ratón de montaje completo y realizar inmunotinción para marcar todas las células ganglionares de la retina (RGC). Al proceso le siguen las imágenes y el recuento automático de las RGC mediante un software basado en IA, lo que proporciona un método sencillo, rápido y preciso para cuantificar las RGC en toda la retina del ratón.

Resumen

El glaucoma es una de las principales causas de ceguera a nivel mundial, caracterizado por un mecanismo patogénico complejo que dificulta la recuperación de la visión. Los ratones sirven como modelos animales valiosos para estudiar la patogénesis y el tratamiento del glaucoma debido a su fondo genético relativamente homogéneo y a las células ganglionares de la retina (RGC), que estructuralmente se parecen a las de los humanos. La evaluación precisa del daño de RGC y los resultados del tratamiento en modelos de glaucoma de ratón requiere determinar el número de RGC en toda la retina. Este protocolo describe un método integral que implica el aislamiento de toda la retina, el etiquetado de las RGC con anticuerpos específicos y el recuento automático rápido y preciso de las RGC mediante un programa basado en IA. El enfoque simplificado permite una cuantificación eficiente y precisa de los números de RGC en las retinas de ratones, lo que facilita la evaluación de la degeneración de RGC y las posibles intervenciones terapéuticas. Al permitir a los investigadores evaluar el alcance del daño de RGC, este protocolo contribuye a una comprensión más profunda de la patogénesis del glaucoma y ayuda a desarrollar estrategias de tratamiento efectivas para controlar y prevenir la pérdida de visión.

Introducción

El glaucoma se caracteriza por la muerte progresiva de las células ganglionares, lo que supone un importante reto para la restauración de la visión 1,2. Esta enfermedad es uno de los principales focos de investigación oftalmológica debido a su prevalencia e impacto en la visión3. Los modelos de ratón son indispensables en el glaucoma
debido a su bagaje genético homogéneo, su alta capacidad reproductiva y la similitud de sus propiedades de células ganglionares con las de los seres humanos4. El objetivo principal de este método es cuantificar con precisión las células ganglionares de la retina (RGC) en modelos de ratón, lo cual es esencial para comprender la patogénesis del glaucoma y desarrollar tratamientos relevantes.

La razón de ser del desarrollo de esta técnica se deriva de la necesidad de disponer de un método fiable y eficaz para evaluar la degeneración de RGC en modelos de ratón. Los métodos tradicionales, como el marcaje de las CGR en secciones de la retina, a menudo proporcionan resultados poco fiables debido a la distribución no uniforme de las CGR en la retina5. La cuantificación de las CGR en toda la retina refleja mejor los cambios en su número y es crucial para evaluar la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas.

Este método ofrece varias ventajas sobre las técnicas alternativas. Por ejemplo, el recuento manual de las células ganglionares de la retina (CGR) en la retina de un ratón adulto normal, que contiene entre 40.000 y 60.000 CGR, puede llevar mucho tiempo y ser propenso a errores 6,7,8. El software para el conteo automático de RGC que desarrollamos permite un conteo preciso en menos de 3 minutos, lo que podría ahorrar a los investigadores una cantidad significativa de tiempo. Además, el software basado en IA utilizado para el recuento automático minimiza el sesgo y mejora la reproducibilidad.

Además, esta técnica proporciona un enfoque estandarizado para evaluar la degeneración de RGC en diferentes modelos de ratón y condiciones experimentales, aportando datos valiosos al campo de la investigación del glaucoma. El método se alinea con otros estudios que enfatizan la importancia del análisis de retina de montaje completo para comprender los cambios de la retina en las enfermedades9.

Para ayudar a los lectores a determinar si este método es adecuado para su aplicación, es importante tener en cuenta que esta técnica es particularmente ventajosa para los investigadores que estudian la degeneración de las células ganglionares de la retina (RGC) en modelos de ratón de glaucoma u otras enfermedades de la retina. El método es adaptable a varias configuraciones experimentales y ofrece un alto grado de precisión y eficiencia en el recuento de RGC, lo que lo hace ideal para estudios tanto a pequeña como a gran escala. Además, el diseño sencillo del protocolo y la disponibilidad de software fácil de usar lo hacen accesible para investigadores con diversos niveles de experiencia en el análisis de la retina.

Protocolo

El procedimiento cumplió con las directrices de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología para el uso de animales en investigación y fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital Popular Provincial de Sichuan. En este estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6J (de 2 meses de edad). La figura 1 ilustra el procedimiento general descrito aquí. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de retinas de montaje completo

  1. Sacrificio de animales
    1. Sacrificar los ratones utilizando luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) (Figura 2A). Antes de la luxación cervical,
      Anestesiar a los ratones inhalando isoflurano (3%-5% en oxígeno) o mediante inyección intraperitoneal de la mezcla de ketamina/xilacina.
  2. Enucleación y procesamiento del globo ocular
    1. Marque el borde de la córnea en el lado dorsal del globo ocular con un marcador azul para recordar la orientación durante la disección posterior.
    2. Retire los tejidos musculares residuales adheridos al globo ocular con unas tijeras. Transfiera el globo ocular enucleado a un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2 mL lleno de 1x PBS para un breve enjuague (Figura 2C).
  3. Fijación
    1. Transfiera el globo ocular a otro tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2 mL que contenga paraformaldehído (PFA) al 4% recién hecho para su fijación a 4 °C durante 10 min (Figura 2D).
    2. Haga una pequeña incisión (aproximadamente 1-2 mm) en la córnea con unas tijeras finas bajo un microscopio de disección.
    3. Vuelva a colocar el globo ocular en el fijador para una mayor fijación a 4 °C durante 3 h para preservar la morfología del tejido (Figura 2D).
  4. Extirpación de córnea y cristalino 1,9
    1. Realice una pequeña incisión de aproximadamente 1 mm alrededor del limbo corneal, el borde entre la córnea y la esclerótica, con unas tijeras quirúrgicas finas.
    2. Corta cuidadosamente alrededor de la circunferencia de la córnea, extirpándola por completo para exponer las estructuras subyacentes.
    3. Use pinzas finas para agarrar suavemente y levantar con cuidado el cristalino de los tejidos circundantes para evitar daños en la retina. Mantener la integridad estructural de la retina con una operación delicada.
    4. Transfiera el ocular a un tubo de microcentrífuga para su posterior procesamiento.
      NOTA: Extirpar la córnea y extraer el cristalino de manera más eficiente utilizando la técnica de "hendidura cruzada"10. Haga dos hendiduras perpendiculares a través de la córnea y use fórceps para extraer el cristalino.
  5. Incisión escleral
    1. Corte una hendidura precisa en la esclerótica con tijeras oftálmicas finas para facilitar los pasos de disección posteriores (Figura 2J).
  6. Separación de la retina
    1. Inserte pinzas con dientes en la incisión entre la esclerótica y la retina. Agarre suavemente el borde de la esclerótica, evitando una fuerza excesiva para evitar desgarrar el tejido.
    2. Agrandar gradualmente la incisión moviendo las pinzas a lo largo del límite entre la esclerótica y la retina con movimientos lentos y constantes de la mano. Use la parte dentada de las pinzas para separar cuidadosamente la esclerótica de la retina, asegurándose de que la retina no se dañe (Figura 2J).
  7. Corte de retina
    1. Divide la retina en cuatro colgajos de aproximadamente el mismo tamaño con unas tijeras afiladas. Asegúrese de que los cortes estén aproximadamente a mitad de camino hacia el nervio óptico y orientados a 90° entre sí.
  8. Limpieza de retina
    1. Despliega suavemente la retina diseccionada con un cepillo de cerdas suaves y retira meticulosamente los residuos de su superficie (Figura 2K).
  9. Fijación final
    1. Transfiera la retina aislada a un tubo de microcentrífuga que contenga PFA fresco al 4% utilizando una pipeta Pasteur desechable. Permita la fijación en hielo durante 5 h adicionales o toda la noche para la conservación del tejido.

2. Inmunotinción

  1. Lavado
    1. Lave la retina aislada de montaje completo en 1x PBS con agitación suave durante 5 min. Deseche la solución PBS. Repita este proceso dos veces para eliminar el fijador residual y los desechos.
  2. Bloqueante
    1. Sumerja la retina lavada en una solución tampón bloqueante (1x PBS con un 4% de suero de burro normal (NDS) y un 0,2% de Triton X-100) durante 30 minutos para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos y mejorar la permeabilización (Figura 3A).
  3. Incubación primaria de anticuerpos
    1. Sustituya el tampón de bloqueo por el anticuerpo primario BRN3A (diluido 1:200 en el tampón de bloqueo). Incubar la retina durante la noche a 4 °C para permitir la unión antígeno-anticuerpo específico (Figura 3B).
  4. Lavado
    1. Lave la retina tres veces con 1x PBS durante 5 minutos cada una para eliminar los anticuerpos primarios no unidos y reducir las manchas de fondo (Figura 3C).
  5. Incubación secundaria de anticuerpos
    1. Incubar la retina con el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa594 o Alexa488 (diluido 1:300) durante 2 h a temperatura ambiente para visualizar los antígenos objetivo (Figura 3D).
  6. Lavado
    1. Realice tres lavados consecutivos con 1x PBS durante 5 minutos cada uno para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios y minimizar la unión inespecífica.
  7. Montura
    1. Transfiera suavemente la retina inmunoteñida a un portaobjetos de microscopio de vidrio, aplanándola cuidadosamente para minimizar el plegado o la distorsión.
    2. Aplique una pequeña gota de medio de montaje antidecoloración en el centro de la retina, asegurando una distribución uniforme en todo el tejido.
    3. Coloque con cuidado un cubreobjetos sobre la retina montada, evitando las burbujas de aire (Figura 3E,F).

3. Procesamiento de imágenes

NOTA: Importe la imagen en el software de conteo automático RGC y comience a contar. El número de células BRN3A positivas para toda la retina se puede obtener en minutos. Descargue el software AutoCount de GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Siga los pasos de instalación detallados para el software a continuación:

  1. Descargue el código desde el enlace de GitHub . Uno recibirá un archivo llamado "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Descomprima este archivo.
  2. Descargue los archivos necesarios del disco en la nube (consulte la Tabla de materiales) y descomprímalos. El archivo descargado se denomina "yolov5_cpu". Descomprima este paquete en la carpeta actual para evitar problemas inesperados.
  3. Localice el archivo de configuración del paso 1 y modifique su contenido para que apunte a la ruta de acceso "yolov5_cpu".
    NOTA: Por ejemplo, si el "yolov5_cpu" descargado se coloca en "D:\1me\yolov5_cpu_", cambie el archivo "config.ini" en el paso 1 a "D:/1me/yolov5_cpu" (use / en lugar de \). (Figura 4A).
  4. Abra la interfaz gráfica haciendo clic en userinterface.exe. La carga inicial puede ser lenta (ejecutarse como administrador) (Figura 4B).
  5. Después de abrir el software, verifique si el archivo de modelo "pmse_plus.pt" está presente en el directorio raíz de la unidad C. Si no está presente, cópielo en este directorio.
    NOTA: El archivo de modelo "pmse_plus.pt" se encuentra en la carpeta de pesos de la carpeta "yolov5", que se encuentra en la carpeta de RGC de cuantificación inteligente extraída (Figura 4C).
  6. Prepare las imágenes que se van a detectar.
    NOTA: El software solo permite leer una o cinco imágenes a la vez. Si lees más, se producirá un error.

4. Recuento automatizado de células

  1. Abra el software de conteo (Figura 5A).
  2. Haga clic en ABRIR IMAGEN para importar la imagen (Figura 5B).
  3. Haga clic en EJECUTAR para permitir que el software cuente automáticamente las celdas (Figura 5C).
    NOTA: El software marcará las celdas contadas con un cuadro cuadrado rojo y mostrará el recuento de celdas en la esquina superior derecha (Figura 5D).

Resultados

Este protocolo detalla la metodología para la inmunotinción de montaje completo de retinas de ratón, lo que garantiza una preparación meticulosa del tejido, una incubación precisa de anticuerpos y un recuento celular automatizado fiable. El procedimiento facilita el etiquetado y la cuantificación robustos de las células ganglionares de la retina (RGC), lo que permite una evaluación precisa de las poblaciones celulares en diversos contextos experimentales. El método se utilizó para contar las CGR en ratones de tipo salvaje y modelados con glaucoma, obteniendo resultados consistentes. Un resultado representativo muestra que el número de RGC en un ratón adulto normal a los 2 meses de edad es de aproximadamente 45.000 (Figura 6).

Para evaluar si el software de IA puede cuantificar con precisión las RGC marcadas con BRN3a en modelos normales y de enfermedad, generamos un modelo de ratón de glaucoma inducido por N-metil-D-aspartato (NMDA)7. La retina de montaje completo de este modelo se inmunotiñó con anti-BRN3A, y las RGC se cuantificaron utilizando el software de recuento automático. El resultado indicó una tinción de fondo relativamente alta (Figura 7). No obstante, el software fue capaz de identificar con precisión casi todos los RGC. Se identificaron un total de 15.231 RGC en esta retina, en comparación con aproximadamente 45.000-50.000 RGC en una retina normal de ratón, lo que indica una degeneración grave. Por lo tanto, el software de IA también se puede utilizar de manera efectiva para contar RGC en retinas con una calidad de tinción menos óptima.

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Figura 1: Diagrama esquemático para la preparación de RGC. (A) Se retira el globo ocular y se coloca en 1x PBS. (B) El globo ocular se fija en PFA al 4% sobre hielo durante 3 h. (C) Extracción de la córnea. (D) Extracción de la lente. (E) El ocular se divide en 4 solapas con unas tijeras. (F) La esclerótica se despega y los residuos se eliminan suavemente de la superficie de la retina con un cepillo suave. (G) La retina está inmunomarcada con anti-BRN3A. (H) Las señales fluorescentes se visualizan utilizando un microscopio confocal. (I) Conteo automático de RGCs. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

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Figura 2: Aislamiento de la retina entera del ratón. (A) El ratón es sacrificado por dislocación cervical. (B) El ratón se coloca sobre una superficie plana. (C) El globo ocular se extrae cuidadosamente con unas tijeras. (D) El globo ocular se coloca suavemente en 1x PBS. (E) El globo ocular se fija con pinzas en el borde de la córnea. (F) Se hace una pequeña incisión en el borde de la córnea con una aguja. (G) La estructura en forma de cuenco se retira después de extraer la córnea. (H) La lente se retira cuidadosamente con pinzas. (I) Se realiza una pequeña incisión a lo largo del borde de la córnea hacia el nervio óptico en la esclerótica, evitando dañar la retina. (J) La esclerótica se abre a lo largo de la incisión con fórceps. (K) La retina se aplana y se limpia con un pincel. (L) La retina se aplana y se fija rápidamente con metanol helado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Inmunotinción de la retina de ratón de montaje completo. (A) Después de lavar con 1x PBS, la retina se bloquea con un tampón de bloqueo. (B) La retina se incuba con un anticuerpo primario a 4 °C durante la noche. (C) La retina se lava con 1x PBS tres veces. (D) La retina se incuba con un anticuerpo secundario durante 2 h a temperatura ambiente. (E) La retina está montada en un portaobjetos de vidrio con los RGC hacia arriba. (F) Las imágenes se adquieren utilizando un microscopio confocal láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Instalación del software de conteo automático. (A) El paso 1 implica actualizar la ruta del archivo al directorio "yolov5_cpu". (B) Se inicia la interfaz gráfica. (C) Verificación de la presencia del archivo del modelo en el directorio raíz de la unidad C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Funcionamiento del software de conteo automatizado RGC. (A) Se abre el software de conteo. (B) Se hace clic en el botón ABRIR IMAGEN para importar la imagen. (C) Se hace clic en el botón EJECUTAR para iniciar el conteo automático. (D) Las celdas contadas están marcadas con un cuadro cuadrado rojo y el número de celda se muestra en la esquina superior derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Recuento automatizado de RGC de ratón. El panel superior (izquierda) muestra los resultados representativos de la retina de montaje plano inmunoteñida con anti-BRN3A; el panel superior (derecha) muestra el conteo automatizado de RGC con software desarrollado previamente. Barra de escala: 100 μm. Las inserciones de los paneles superiores se amplían y se muestran en el panel inferior, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Recuento de RGC en un modelo de ratón de glaucoma inducido por NMDA. Panel izquierdo: Vista general de la retina de montaje completo, que muestra los RGC reconocidos por el software de IA. Panel derecho: Vista ampliada de un área parcial de la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este protocolo proporciona un método para determinar todas las células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón, que se puede utilizar para monitorear la progresión de la degeneración de RGC en modelos de ratón para estudios de glaucoma. La retina del ratón es un tejido nervioso delicado5, y el aislamiento de las retinas de montaje completo de los ojos del ratón requiere una práctica repetida. Durante la experimentación, se encontró que el tiempo de fijación afecta significativamente la morfología de la retina. Para ratones alrededor de las 2 semanas de edad, un tiempo de fijación de 20 minutos es suficiente para obtener buenos resultados debido a la esclerótica delgada y débil. Sin embargo, para ratones adultos mayores de 2 meses, 20 minutos de fijación son inadecuados. Un tiempo de fijación de 3 h es óptimo para obtener retinas enteras intactas.

En el proceso de aislamiento de la retina, el paso más desafiante es separar la esclerótica de la retina10. La esclerótica se puede despegar de la retina con relativa facilidad utilizando dos juegos de pinzas con puntas dentadas. Al usar los dos juegos de pinzas para agarrar la esclerótica y separarla, la esclerótica se rompe en pedazos pequeños y se separa de la retina.

Una imagen de alta calidad de las células ganglionares de la retina (CGR) es fundamental para un recuento preciso. Dado que la retina es tridimensional, no todas las RGC están al mismo nivel en una retina de montaje plano8. Cuando la retina se monta en un portaobjetos de vidrio, debe extenderse lo más plano posible para facilitar la obtención de imágenes posteriores. Durante la obtención de imágenes, las imágenes se adquieren en múltiples niveles de enfoque para capturar todos los RGC en diferentes áreas de toda la retina.

En resumen, este protocolo proporciona un procedimiento estandarizado para el recuento automático de todas las CGR en una retina de ratón de montaje plano. Este método permite a los científicos evaluar con precisión la degeneración de RGC en modelos de ratón, mejorando la eficiencia y la precisión de la cuantificación de RGC. Esta precisión es crucial para comprender y tratar el glaucoma y las enfermedades relacionadas.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Agradecimientos

Este proyecto de investigación contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82371059 (H.Z.)), el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan, China (2023JDZH0002 (H.Z.)), la Oficina de Ciencia y Tecnología de Chengdu (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)) y el Hospital Popular Provincial de Sichuan (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1&veces; PBSServicebioG4202
Alexa594-conjugado Cabra Anti-Conejo IgG  (H+L)ThermoFisherA-11012
Anticuerpo anti-BRN3A [EPR23257-285]Abcamab245230
Softwarehttps://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Disco en la nubeEnlace de unidadhttps://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 
Disco en la nubeEnlace BaiduCódigo de extracción: g44khttps://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg 
RotuladorSharpie
Normal Donkey SerumBiosharp, Labgic25030081
ParaformaldehídoMacklinP804536
ProClean 300BeyotimeST853
SacarosaBBI, SangonA610498
Triton X-100BioFroxx, neoFroxx1139ML100
AutoCount de Google

Referencias

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  3. Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
  4. Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
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  10. Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).

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