Method Article

Optimización de las técnicas urodinámicas del ratón para mejorar la precisión

DOI:

10.3791/67019

⸱

June 7th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Indiana University School of Medicine, 2Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery, Goodman and Campbell Brain and Spine, Indiana University School of Medicine, 3Department of Rehabilitation Medicine, Zhongda Hospital Southeast University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo proporciona una guía para impermeabilizar la piel con cianocrilato para evitar la absorción de orina por el pelo y la piel. Incluye instrucciones para aplicar el pegamento a la piel, implantar un catéter vesical y electrodos para la cistometría y los registros de electromiografía del esfínter uretral externo en ratones despiertos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La medición precisa de los parámetros urinarios en ratones despiertos es crucial para comprender la disfunción del tracto urinario inferior (LUT), particularmente en afecciones como la lesión postraumática de la médula espinal (LME) de la vejiga neurógena. Sin embargo, la realización de registros de cistometría en ratones presenta desafíos notables. Cuando los ratones están en una posición prona y restringida durante las sesiones de grabación, la orina tiende a ser absorbida por el pelaje y la piel, lo que lleva a una subestimación del volumen miccional (VV). El objetivo de este estudio fue mejorar la precisión de los registros de cistometría y electromiografía de esfínter uretral externo (EUS-EMG) en ratones despiertos. Desarrollamos un método único que utiliza adhesivo de cianoacrilato para crear una barrera cutánea impermeable alrededor del meato uretral y el abdomen, evitando la absorción de orina y asegurando mediciones precisas. Los resultados muestran que después de aplicar el cianoacrilato, la suma de VV y RV se mantuvo consistente con el volumen de solución salina infundida, y no se observaron áreas húmedas después del experimento, lo que indica una prevención exitosa de la absorción de orina. Además, el método estabilizó simultáneamente los electrodos conectados con el esfínter uretral externo (EUS), garantizó señales de electromiografía (EMG) estables y minimizó los artefactos causados por el movimiento del ratón despierto y la manipulación del experimentador. Se discuten los detalles metodológicos, los resultados y las implicaciones, destacando la importancia de mejorar las técnicas urodinámicas en la investigación preclínica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El almacenamiento y la liberación de orina dependen de la actividad coordinada de la vejiga urinaria y el esfínter uretral externo (USE). En algunas patologías como la vejiga neurógena, tanto los músculos detrusores vesicales como el esfínter pueden llegar a ser disfuncionales, dando lugar a importantes problemas vesicales, especialmente tras una lesión medular traumática (LM)1.

Los pequeños roedores se utilizan habitualmente como modelo experimental para estudiar la función preclínica del tracto urinario inferior (LUT)2. Las técnicas de registro de cistometría de llenado (FC) y electromiografía USC (US-EMG) pueden proporcionar información objetiva precisa en función de la elección de los métodos, la medición precisa y la interpretación de los resultados3. Las pruebas urodinámicas se utilizan comúnmente para evaluar el volumen miccional (VV), la eficiencia miccional (VE) y la capacidad vesical4. La EV mide la eficacia con la que la vejiga puede vaciarse a sí misma. Se calcula dividiendo el volumen vaciado por la suma de los volúmenes vaciados y residuales (VV+RV). Por otro lado, la capacidad de la vejiga se calcula sumando el VV (la cantidad de orina expulsada durante la micción) al VD (la cantidad de orina que queda en la vejiga después de orinar)5. Por lo tanto, la medición de VV y RV son las claves para deducir otros parámetros.

La medición precisa del VV en ratones durante las pruebas urodinámicas presenta varios desafíos. La orina de los roedores, cuando se restringe físicamente en posición prona, tiende a ser arrastrada hacia abajo a través de la pared abdominal ventral debido a la influencia de la gravedad6. Este fenómeno puede conducir a la absorción de orina por el pelaje abdominal y la piel, lo que, a su vez, subestima el volumen de orina excretada. Teniendo en cuenta la pequeña cantidad de orina producida por el ratón, el impacto de esta absorbancia en la precisión de los resultados es aún más pronunciado7. Además, en los modelos de LME, el VV suele ser menor que en los ratones normales debido al impacto de la disinergia del esfínter del detrusor (DSD), que aumenta el riesgo de presiones en los puntos de fuga y la absorción de orina por el pelaje. Estos factores tienen un impacto significativo en los resultados. Por lo tanto, la medición precisa de VV y RV durante los estudios urodinámicos terminales en ratones es crucial9. Actualmente, hay una falta de detalles en las metodologías proporcionadas en la literatura publicada sobre cómo medir el volumen de orina con precisión en modelos de ratón.

El adhesivo de cianoacrilato es un tipo de pegamento que se utiliza comúnmente en procedimientos quirúrgicos en modelos humanos y animales debido a sus propiedades de unión rápidas y efectivas 10,11,12. Este adhesivo es particularmente útil para cerrar heridas y laceraciones, ya que forma una unión fuerte y flexible cuando se aplica sobre la piel13. Además, puede ser una gran barrera contra la orina y la humedad que pueden entrar en contacto con el pelo y las heridas11.

En este artículo, hemos desarrollado una técnica novedosa y rentable que utiliza adhesivo de cianoacrilato para lograr resultados precisos en registros de cistometría y EUS-EMG en ratones despiertos. Este método será beneficioso para comprender las causas subyacentes de la disfunción de la vejiga y diseñar tratamientos más efectivos para los trastornos de la LUT.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo del estudio en animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana. Código de homologación: 21098MD/R/MSS/HZ Fecha de homologación: 29 de septiembre de 2021.

1. Preparación del catéter

  1. Corta un tubo de polietileno PE-30 de 30 cm (.017 pulgadas x .030 pulgadas). Use un encendedor para ensanchar un extremo del tubo, asegurándose de que no toque la llama, y retire el encendedor una vez que el tubo haya formado una punta redonda en forma de campana adecuada.
  2. Inserte con cuidado aproximadamente 3/4 de la aguja de 25G en el otro extremo del tubo. Prepare una jeringa de 1 ml y llénela con NaCl estéril al 0,9%. Conecte la jeringa a la aguja de 25 G.
  3. Infunda suavemente solución salina para verificar que la punta sea redonda adecuada y que no haya fugas por los extremos de la aguja. Asegúrese de que no se sienta presión y de que la solución salina fluya suavemente a través del catéter.

2. Preparación de los electrodos

  1. Prepara 2 alambres de acero de 20 cm de longitud. Tome los alambres de acero y aplique pulidor de arena en ambos extremos de la zona de recubrimiento para pelar 5 mm del alambre.
  2. Tome una aguja de 25G e insértela en un lado del alambre. Asegúrese de insertar la aguja con cuidado para evitar dañar el alambre. Dobla la parte pelada del alambre como un gancho. El gancho ayudará a conectar el cable al músculo eclesiástico endocannabinoide.
  3. Use soldadura para conectar el pin al otro extremo del cable rayado. La soldadura ayudará a asegurar el pin al cable y asegurará una conexión fuerte. Asegúrese de calentar la soldadura de estaño y plomo hasta que se derrita y cubra el cable y el pasador.

3. Preparación del animal

  1. Aloje el ratón hembra C57BL/6 (8 semanas de edad, 18-20 g de peso corporal) en el animalario de acuerdo con Institutional Animal Care con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso ilimitado a agua y gránulos de comida estándar.

4. Anestesia durante la cirugía

  1. Colocar a los animales en una cámara de isoflurano al 2% y oxígeno puro (1 L/min). Confirme la anestesia completa del animal mediante un examen negativo de pinzamiento de los dedos antes de transferirlo a la máscara. Una vez confirmado, cambie la condición del gas a una mascarilla.
  2. Asegúrese de que la mascarilla de anestesia esté fijada en la posición adecuada en el campo quirúrgico estéril. Colocar al animal en decúbito supino sobre el paño estéril con la nariz en una pequeña mascarilla inhalatoria (0,8-1 L/min con isoflurano al 2%) para continuar administrando la anestesia.

5. Preparación quirúrgica

  1. Fija las extremidades del animal con cinta adhesiva. Use una máquina de afeitar eléctrica para afeitar el pelaje de la parte inferior del abdomen y alrededor del meato uretral (región genital).
  2. Aplique un ungüento para los ojos para prevenir cualquier posible sequedad en los ojos. Prepare el área afeitada con la solución de povidona yodada y limpie la solución con etanol al 70%. Coloque un paño estéril en la región de la cirugía.

6. Procedimiento quirúrgico

  1. Implante de catéter vesical
    1. Bajo el microscopio quirúrgico, utilizando tijeras rectas y romas de Metzenbaum, cree una incisión de 1-2 cm en la línea media de la piel abdominopélvica. Proceda a incidir la fascia y los músculos de la línea media para exponer la vejiga a través de la herida incisional.
    2. Una vez que la vejiga sea visible a través de la herida incisional, proceda a retraer los órganos o tejidos circundantes según sea necesario para obtener una visión clara del campo quirúrgico. Tenga cuidado de evitar cualquier manipulación o tensión innecesaria en la vejiga, ya que esto puede provocar complicaciones como pérdidas de orina o lesiones en las estructuras circundantes.
    3. Sujete la cúpula de la vejiga y coloque un cordón de bolso utilizando una sutura de monofilamento no absorbible 5-0 con una aguja de punta cónica.
    4. Con unas microtijeras, crea una pequeña cistostomía dentro del cordón de la bolsa y haz un agujero hasta que salga la orina.
    5. Sujete el extremo de punta redonda del catéter e insértelo a través del orificio. Una vez que la punta del tubo haya pasado a través del orificio, sure el hilo de la bolsa alrededor del tubo. Luego, tire suavemente del tubo hacia afuera hasta que la punta se sienta debajo de la sutura.
    6. Infunda lentamente 1 mL de solución salina desde el otro extremo del tubo para distender la vejiga. Verifique si hay fugas alrededor del catéter. Si hay fugas, coloque una sutura adicional.
    7. Una vez que la solución salina salga de la uretra, retírela para descomprimir la vejiga.
  2. Implante de electrodos EUS (Figura 1)
    1. Use tijeras quirúrgicas para extender la incisión abdominal hasta el suelo pélvico.
    2. En línea con la vejiga, mueva los músculos y las membranas a los canales pudendos y localice la uretra y el músculo del esfínter externo. Tenga cuidado de no dañar los vasos ilíacos y caudales medios y los nervios pudendos.
    3. Punción bilateral de la piel, a 1 cm del meato uretral, con la aguja que contiene el electrodo.
    4. Agarre con cuidado la punta del gancho con pinzas y retire suavemente la aguja de la piel.
    5. Con la punta del electrodo, enganche con cuidado el músculo EUS bilateralmente. Evite golpear demasiado profundo, ya que esto puede dañar el músculo, lo que podría provocar una posible pérdida de orina.
    6. Utilice el monofilamento no absorbible 3-0 para suturar los músculos pélvicos y abdominales y la piel.
  3. Impermeabilización de la piel
    1. Aplique una capa delgada de pegamento de cianoacrilato en la piel donde salen los electrodos para fijar los electrodos en su lugar.
    2. Aplique el pegamento de cianoacrilato a 1 cm de distancia rodeando el meato uretral y 3 cm más allá extendiéndose hasta el abdomen y la región suturada. Para evitar el contacto con el pegamento, sostenga cuidadosamente el meato con pinzas.
    3. Utilice una micropipeta de 0,5-10 μL para extraer el líquido acelerador y secar el pegamento.
      PRECAUCIÓN: El líquido del acelerador es un líquido combustible.
    4. Agregue el líquido acelerador para asegurar una reacción adhesiva adecuada. Esto ayudará a secar el pegamento más rápidamente y asegurará que se fije de forma segura.
  4. Preparación urodinámica
    1. Prepare un bote de pesaje de poliestireno invertido de 4,5 cm de largo, ancho y profundidad. Córtalo en forma de triángulo con una base de 4 cm para poner el meato uretra del ratón en este espacio. Coloque el molde base desechable, de 37 mm x 24 mm x 5 mm, debajo del espacio para recoger la orina.
    2. Vuelva a colocar el mouse en posición prona y muévalo con cuidado sobre una placa hecha a medida equipada con una máscara antigás.
    3. Asegúrese de que el meato uretral esté colocado correctamente dentro de la ranura. Sujete suavemente la cabeza y la extremidad del ratón con cinta adhesiva y coloque la placa en una almohadilla térmica hasta que el ratón recupere la conciencia completa (Figura 2).
    4. Realice la cistometría solo cuando el ratón esté completamente despierto, es decir, al menos 40 minutos después de la recuperación de la anestesia.

7. Preparación del registro de cistometría y EUS-EMG

  1. Configure y calibre la bomba de infusión de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Tome una jeringa de 20 ml con un diámetro de 19,05 mm y llénela con NaCl estéril al 0,9% a temperatura ambiente. Fije la jeringa a la bomba de infusión. Ajuste la velocidad de infusión a 0,01 mL/min.
  3. Conecte la jeringa por el tubo PE-30 a un lado del conector de tres vías. Conecte el catéter vesical del otro lado a un transductor de presión. Antes de conectar el catéter vesical, asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire.
  4. Fije el transductor de presión al mismo nivel que la vejiga del ratón. El transductor de presión está conectado a través de un amplificador al sistema de adquisición de datos.
  5. Conecte un gancho de línea de tierra a la piel y el otro a los sitios de conexión de electrodos. Registre la presión en el software.
  6. Después de iniciar el software, verifique las señales de presión intravesical (IVP) y EUS-EMG. Guarde el nombre de la muestra y establezca la hora.
  7. Inicie la infusión de la bomba. Registre las señales.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para analizar los datos se utilizaron cistometría y trazados de actividad EUS-EMG. El método de cistometría continua consiste en la infusión de solución salina en la vejiga y la medición simultánea de los cambios de presión y volumen en la vejiga. Para medir el VV, se infundieron 0,4 mL de solución salina a una velocidad de 0,01 mL/min, y la orina se recolectó durante 40 min en un tapón. El residuo postmiccional (PVR) se puede obtener aspirando la solución salina a través del catéter. En ratones normales sin pegamento, la suma de VV y RV fue a menudo inferior a 0,4 mL. Después del experimento, el pelaje del abdomen y del meato circundante estaba mojado debido a la absorción de orina (Figura 3A). Después de aplicar una capa delgada de pegamento para cubrir las pieles pequeñas, se demostró que la suma de VV y RV era de 0,4 mL, y no había área húmeda (Figura 3B, C).

Los trazados cistométricos resultantes proporcionaron un análisis detallado de varios parámetros, incluida la presión máxima de contracción vesical miccional (27,2 cmH2O), la duración de la contracción (16,26 s) y el intervalo entre contracciones (4,48 min). Al mismo tiempo, tuvimos un buen registro de la presión intravesical y las señales de EUS-EMG en ratones, como se muestra en la Figura 4.

Muchas mediciones urodinámicas en ratones se realizan bajo anestesia14. A pesar de que puede parecer un método conveniente para reducir el ruido de las señales eléctricas y la pérdida de orina resultante del movimiento del animal, es fundamental considerar que los fármacos anestésicos pueden afectar el flujo urinario, lo que puede llevar a resultados inexactos o poco confiables15. Por lo tanto, el registro urodinámico en animales despiertos es más popular para obtener resultados más cercanos a la condición fisiológica. El registro urodinámico en animales despiertos suele comenzar después de un período de 40-50 minutos de recuperación del isoflurano16. Este proceso implica monitorear de cerca a los ratones para asegurarse de que estén relajados y cómodos sin necesidad de anestesia. Se ha observado a través de varios experimentos que el movimiento de un ratón consciente puede afectar las señales urodinámicas 5,14, lo que lleva a mediciones inexactas de parámetros específicos como la presión del punto de fuga, VV y VE17. Como resultado, hemos implementado un método de restricción parcial de ratones conscientes para garantizar resultados urodinámicos más fiables. Sin embargo, incluso con una restricción limitada, los ratones conscientes todavía luchan cuando se despiertan inmediatamente de la anestesia, lo que también puede causar desprendimiento o contacto inestable entre el gancho del electrodo y la USE y crear un ruido significativo en las señales de EUS-EMG. Como se muestra en la Figura 3B, para minimizar estos artefactos, hemos adoptado el enfoque de fijar los electrodos con pegamento en el punto de salida de la piel. Este método ha demostrado ser eficaz para minimizar el movimiento de los electrodos y los artefactos posteriores que pueden producir.

figure-results-1
Figura 1: Desplazamiento de los electrodos de electromiografía. Implantación de electrodos (asterisco amarillo) bilateralmente al músculo uretral externo (EUS; flechas negras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Sujeción del ratón despierto. Después de la implantación del catéter y los electrodos, el ratón se sujetó a la placa para mantener la estabilidad durante el registro urodinámico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Regiones abdominales y meatos después del registro urodinámico. (A) Se observó una gran área húmeda (contorneada por una línea discontinua roja) en el abdomen y las regiones genitales. (B) Las áreas abdominales y genitales secas e impermeables se crearon con pegamento de cianoacrilato (contorneadas por una línea discontinua roja) después de la grabación. (C) Una gota de orina (flecha amarilla) se formó en el meato durante el registro urodinámico y permaneció como una gota durante mucho tiempo sin ser absorbida por la piel y el pelaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Trazas representativas de cistometría y electromiografía de esfínter uretral externo (EUS-EMG) en una rata hembra despierta y restringida. (A) Traza A: Registros simultáneos de cistometría continua (CMG) y EUS-EMG (trazas superior e inferior, respectivamente). (B) La traza B es la porción expandida de la traza A, indicada por un cuadro rectangular con diferentes escalas de tiempo. Durante la fase miccional, la micción intermitente coincidió con reducciones de la presión intravesical en el registro de CMG (trazo superior; flechas), que ocurrieron durante los períodos de baja tónica y reducción de la actividad de EUS-EMG (trazo inferior; flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta técnica urodinámica describe un procedimiento mejorado para medir el volumen de orina y la señal EUS-EMG en ratones despiertos y restringidos. La presencia de pelo alrededor del meato uretral y el área abdominal puede interferir con la precisión de la medición del VV mediante la absorción de orina. Aunque el pelaje que rodea el meato uretral y el abdomen se había afeitado cuidadosamente antes de la cirugía, los pequeños pelajes restantes dentro de estas áreas y la piel aún absorbían la orina, por lo general dejando un área húmeda en el abdomen después de la grabación. Este problema es particularmente notable en los roedores hembra debido a la distancia extremadamente corta entre el meato uretral y la piel circundante18. En esta técnica, se aplicó pegamento de cianoacrilato sobre la piel abdominal y uretral circundante para crear una superficie cutánea impermeable y proporcionar una evaluación precisa del volumen urinario durante el registro urodinámico, lo que permitió una mejor comprensión de la función vesical. El pegamento se aplicó con precisión, asegurándose de que cubriera la piel que rodeaba el meato y la que estaba cerca. El propósito de aplicar el pegamento era crear una barrera impermeable que evitara que las pieles absorbieran la orina. El pegamento se extendió uniformemente, con cuidado para evitar cualquier aglomeración o bloqueo del meato uretral. Los resultados registrados del procedimiento confirmaron que nuestro objetivo se había logrado completamente, ya que la suma de VV y VD se mantuvo constante en el volumen de infusión y no se observaron más áreas húmedas. Para garantizar la precisión de las mediciones, revisamos la vejiga después del experimento y se encontró que estaba vacía. Este paso adicional de revisión de la vejiga es crucial, ya que elimina cualquier posibilidad de retención de orina, lo que provoca una discrepancia entre la cantidad que retiramos a través de una jeringa y la cantidad real de RV.

Este método tiene limitaciones: 1) no es adecuado para estudios longitudinales y de múltiples puntos temporales. 2) No se puede aplicar a un ratón que se mueve libremente. 3) si se produce el desprendimiento de los electrodos de la USE, es difícil abrir el abdomen y volver a instalarlos. 4) Si bien los adhesivos de cianoacrilato son una herramienta valiosa en muchos entornos quirúrgicos debido a su facilidad de uso y efectividad, es importante usarlos con precaución y seguir los protocolos de seguridad adecuados para minimizar cualquier riesgo potencial. El cianoacrilato es generalmente seguro para la piel, pero se debe evitar el contacto frecuente con él y los investigadores deben tomar las medidas de protección personal adecuadas. Los adhesivos de cianoacrilato pueden liberar vapores tóxicos si se inhalan. Para minimizar el riesgo de inhalación de estos vapores, los investigadores deben mantener niveles más altos de humedad y optimizar la ventilación de la habitación en el ambiente de trabajo19. También se pueden utilizar filtros especiales de aire acondicionado para reducir aún más la toxicidad de los vapores.

En general, este experimento proporcionó información importante sobre la precisión de la medición de la orina miccionada durante el registro urodinámico y ayudó a identificar posibles fuentes de error que podrían haber llevado a discrepancias en la cantidad total de VV y VD después de la infusión.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por NIH-NINDS (R21NS130241), IND DEPT HLTH (55051, 74247, 74244) y US ARMY (HT94252310700).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AceleradorBOB SMITH INDUSTRIESBSI-152
Cianoacrilato TED PELLA, Inc14478
Molde base desechableTED PELLA, Inc27147-4
Bomba de infusiónHarvard Apparatus PHD ULTRA70-3006
IsofluranoHenry Schein Inc1182097
PINWorld Precision Instruments5482
Tubo de polietileno 30Braintree Scientific IncPE30
barco de pesaje estérilHEATHROW SCIENTIFIC797CK2
Windaq/Lite INSTRUMENTOS DATAQ 249022

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