Este protocolo proporciona una guía para impermeabilizar la piel con cianocrilato para evitar la absorción de orina por el pelo y la piel. Incluye instrucciones para aplicar el pegamento a la piel, implantar un catéter vesical y electrodos para la cistometría y los registros de electromiografía del esfínter uretral externo en ratones despiertos.
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Artículo de método
Optimización de las técnicas urodinámicas del ratón para mejorar la precisión
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Resumen
Resumen
La medición precisa de los parámetros urinarios en ratones despiertos es crucial para comprender la disfunción del tracto urinario inferior (LUT), particularmente en afecciones como la lesión postraumática de la médula espinal (LME) de la vejiga neurógena. Sin embargo, la realización de registros de cistometría en ratones presenta desafíos notables. Cuando los ratones están en una posición prona y restringida durante las sesiones de grabación, la orina tiende a ser absorbida por el pelaje y la piel, lo que lleva a una subestimación del volumen miccional (VV). El objetivo de este estudio fue mejorar la precisión de los registros de cistometría y electromiografía de esfínter uretral externo (EUS-EMG) en ratones despiertos. Desarrollamos un método único que utiliza adhesivo de cianoacrilato para crear una barrera cutánea impermeable alrededor del meato uretral y el abdomen, evitando la absorción de orina y asegurando mediciones precisas. Los resultados muestran que después de aplicar el cianoacrilato, la suma de VV y RV se mantuvo consistente con el volumen de solución salina infundida, y no se observaron áreas húmedas después del experimento, lo que indica una prevención exitosa de la absorción de orina. Además, el método estabilizó simultáneamente los electrodos conectados con el esfínter uretral externo (EUS), garantizó señales de electromiografía (EMG) estables y minimizó los artefactos causados por el movimiento del ratón despierto y la manipulación del experimentador. Se discuten los detalles metodológicos, los resultados y las implicaciones, destacando la importancia de mejorar las técnicas urodinámicas en la investigación preclínica.
Introducción
El almacenamiento y la liberación de orina dependen de la actividad coordinada de la vejiga urinaria y el esfínter uretral externo (USE). En algunas patologías como la vejiga neurógena, tanto los músculos detrusores vesicales como el esfínter pueden llegar a ser disfuncionales, dando lugar a importantes problemas vesicales, especialmente tras una lesión medular traumática (LM)1.
Los pequeños roedores se utilizan habitualmente como modelo experimental para estudiar la función preclínica del tracto urinario inferior (LUT)2. Las técnicas de registro de cistometría de llenado (FC) y electromiografía USC (US-EMG) pueden proporcionar información objetiva precisa en función de la elección de los métodos, la medición precisa y la interpretación de los resultados3. Las pruebas urodinámicas se utilizan comúnmente para evaluar el volumen miccional (VV), la eficiencia miccional (VE) y la capacidad vesical4. La EV mide la eficacia con la que la vejiga puede vaciarse a sí misma. Se calcula dividiendo el volumen vaciado por la suma de los volúmenes vaciados y residuales (VV+RV). Por otro lado, la capacidad de la vejiga se calcula sumando el VV (la cantidad de orina expulsada durante la micción) al VD (la cantidad de orina que queda en la vejiga después de orinar)5. Por lo tanto, la medición de VV y RV son las claves para deducir otros parámetros.
La medición precisa del VV en ratones durante las pruebas urodinámicas presenta varios desafíos. La orina de los roedores, cuando se restringe físicamente en posición prona, tiende a ser arrastrada hacia abajo a través de la pared abdominal ventral debido a la influencia de la gravedad6. Este fenómeno puede conducir a la absorción de orina por el pelaje abdominal y la piel, lo que, a su vez, subestima el volumen de orina excretada. Teniendo en cuenta la pequeña cantidad de orina producida por el ratón, el impacto de esta absorbancia en la precisión de los resultados es aún más pronunciado7. Además, en los modelos de LME, el VV suele ser menor que en los ratones normales debido al impacto de la disinergia del esfínter del detrusor (DSD), que aumenta el riesgo de presiones en los puntos de fuga y la absorción de orina por el pelaje. Estos factores tienen un impacto significativo en los resultados. Por lo tanto, la medición precisa de VV y RV durante los estudios urodinámicos terminales en ratones es crucial9. Actualmente, hay una falta de detalles en las metodologías proporcionadas en la literatura publicada sobre cómo medir el volumen de orina con precisión en modelos de ratón.
El adhesivo de cianoacrilato es un tipo de pegamento que se utiliza comúnmente en procedimientos quirúrgicos en modelos humanos y animales debido a sus propiedades de unión rápidas y efectivas 10,11,12. Este adhesivo es particularmente útil para cerrar heridas y laceraciones, ya que forma una unión fuerte y flexible cuando se aplica sobre la piel13. Además, puede ser una gran barrera contra la orina y la humedad que pueden entrar en contacto con el pelo y las heridas11.
En este artículo, hemos desarrollado una técnica novedosa y rentable que utiliza adhesivo de cianoacrilato para lograr resultados precisos en registros de cistometría y EUS-EMG en ratones despiertos. Este método será beneficioso para comprender las causas subyacentes de la disfunción de la vejiga y diseñar tratamientos más efectivos para los trastornos de la LUT.
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Protocolo
El protocolo del estudio en animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana. Código de homologación: 21098MD/R/MSS/HZ Fecha de homologación: 29 de septiembre de 2021.
1. Preparación del catéter
- Corta un tubo de polietileno PE-30 de 30 cm (.017 pulgadas x .030 pulgadas). Use un encendedor para ensanchar un extremo del tubo, asegurándose de que no toque la llama, y retire el encendedor una vez que el tubo haya formado una punta redonda en forma de campana adecuada.
- Inserte con cuidado aproximadamente 3/4 de la aguja de 25G en el otro extremo del tubo. Prepare una jeringa de 1 ml y llénela con NaCl estéril al 0,9%. Conecte la jeringa a la aguja de 25 G.
- Infunda suavemente solución salina para verificar que la punta sea redonda adecuada y que no haya fugas por los extremos de la aguja. Asegúrese de que no se sienta presión y de que la solución salina fluya suavemente a través del catéter.
2. Preparación de los electrodos
- Prepara 2 alambres de acero de 20 cm de longitud. Tome los alambres de acero y aplique pulidor de arena en ambos extremos de la zona de recubrimiento para pelar 5 mm del alambre.
- Tome una aguja de 25G e insértela en un lado del alambre. Asegúrese de insertar la aguja con cuidado para evitar dañar el alambre. Dobla la parte pelada del alambre como un gancho. El gancho ayudará a conectar el cable al músculo eclesiástico endocannabinoide.
- Use soldadura para conectar el pin al otro extremo del cable rayado. La soldadura ayudará a asegurar el pin al cable y asegurará una conexión fuerte. Asegúrese de calentar la soldadura de estaño y plomo hasta que se derrita y cubra el cable y el pasador.
3. Preparación del animal
- Aloje el ratón hembra C57BL/6 (8 semanas de edad, 18-20 g de peso corporal) en el animalario de acuerdo con Institutional Animal Care con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso ilimitado a agua y gránulos de comida estándar.
4. Anestesia durante la cirugía
- Colocar a los animales en una cámara de isoflurano al 2% y oxígeno puro (1 L/min). Confirme la anestesia completa del animal mediante un examen negativo de pinzamiento de los dedos antes de transferirlo a la máscara. Una vez confirmado, cambie la condición del gas a una mascarilla.
- Asegúrese de que la mascarilla de anestesia esté fijada en la posición adecuada en el campo quirúrgico estéril. Colocar al animal en decúbito supino sobre el paño estéril con la nariz en una pequeña mascarilla inhalatoria (0,8-1 L/min con isoflurano al 2%) para continuar administrando la anestesia.
5. Preparación quirúrgica
- Fija las extremidades del animal con cinta adhesiva. Use una máquina de afeitar eléctrica para afeitar el pelaje de la parte inferior del abdomen y alrededor del meato uretral (región genital).
- Aplique un ungüento para los ojos para prevenir cualquier posible sequedad en los ojos. Prepare el área afeitada con la solución de povidona yodada y limpie la solución con etanol al 70%. Coloque un paño estéril en la región de la cirugía.
6. Procedimiento quirúrgico
- Implante de catéter vesical
- Bajo el microscopio quirúrgico, utilizando tijeras rectas y romas de Metzenbaum, cree una incisión de 1-2 cm en la línea media de la piel abdominopélvica. Proceda a incidir la fascia y los músculos de la línea media para exponer la vejiga a través de la herida incisional.
- Una vez que la vejiga sea visible a través de la herida incisional, proceda a retraer los órganos o tejidos circundantes según sea necesario para obtener una visión clara del campo quirúrgico. Tenga cuidado de evitar cualquier manipulación o tensión innecesaria en la vejiga, ya que esto puede provocar complicaciones como pérdidas de orina o lesiones en las estructuras circundantes.
- Sujete la cúpula de la vejiga y coloque un cordón de bolso utilizando una sutura de monofilamento no absorbible 5-0 con una aguja de punta cónica.
- Con unas microtijeras, crea una pequeña cistostomía dentro del cordón de la bolsa y haz un agujero hasta que salga la orina.
- Sujete el extremo de punta redonda del catéter e insértelo a través del orificio. Una vez que la punta del tubo haya pasado a través del orificio, sure el hilo de la bolsa alrededor del tubo. Luego, tire suavemente del tubo hacia afuera hasta que la punta se sienta debajo de la sutura.
- Infunda lentamente 1 mL de solución salina desde el otro extremo del tubo para distender la vejiga. Verifique si hay fugas alrededor del catéter. Si hay fugas, coloque una sutura adicional.
- Una vez que la solución salina salga de la uretra, retírela para descomprimir la vejiga.
- Implante de electrodos EUS (Figura 1)
- Use tijeras quirúrgicas para extender la incisión abdominal hasta el suelo pélvico.
- En línea con la vejiga, mueva los músculos y las membranas a los canales pudendos y localice la uretra y el músculo del esfínter externo. Tenga cuidado de no dañar los vasos ilíacos y caudales medios y los nervios pudendos.
- Punción bilateral de la piel, a 1 cm del meato uretral, con la aguja que contiene el electrodo.
- Agarre con cuidado la punta del gancho con pinzas y retire suavemente la aguja de la piel.
- Con la punta del electrodo, enganche con cuidado el músculo EUS bilateralmente. Evite golpear demasiado profundo, ya que esto puede dañar el músculo, lo que podría provocar una posible pérdida de orina.
- Utilice el monofilamento no absorbible 3-0 para suturar los músculos pélvicos y abdominales y la piel.
- Impermeabilización de la piel
- Aplique una capa delgada de pegamento de cianoacrilato en la piel donde salen los electrodos para fijar los electrodos en su lugar.
- Aplique el pegamento de cianoacrilato a 1 cm de distancia rodeando el meato uretral y 3 cm más allá extendiéndose hasta el abdomen y la región suturada. Para evitar el contacto con el pegamento, sostenga cuidadosamente el meato con pinzas.
- Utilice una micropipeta de 0,5-10 μL para extraer el líquido acelerador y secar el pegamento.
PRECAUCIÓN: El líquido del acelerador es un líquido combustible. - Agregue el líquido acelerador para asegurar una reacción adhesiva adecuada. Esto ayudará a secar el pegamento más rápidamente y asegurará que se fije de forma segura.
- Preparación urodinámica
- Prepare un bote de pesaje de poliestireno invertido de 4,5 cm de largo, ancho y profundidad. Córtalo en forma de triángulo con una base de 4 cm para poner el meato uretra del ratón en este espacio. Coloque el molde base desechable, de 37 mm x 24 mm x 5 mm, debajo del espacio para recoger la orina.
- Vuelva a colocar el mouse en posición prona y muévalo con cuidado sobre una placa hecha a medida equipada con una máscara antigás.
- Asegúrese de que el meato uretral esté colocado correctamente dentro de la ranura. Sujete suavemente la cabeza y la extremidad del ratón con cinta adhesiva y coloque la placa en una almohadilla térmica hasta que el ratón recupere la conciencia completa (Figura 2).
- Realice la cistometría solo cuando el ratón esté completamente despierto, es decir, al menos 40 minutos después de la recuperación de la anestesia.
7. Preparación del registro de cistometría y EUS-EMG
- Configure y calibre la bomba de infusión de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Tome una jeringa de 20 ml con un diámetro de 19,05 mm y llénela con NaCl estéril al 0,9% a temperatura ambiente. Fije la jeringa a la bomba de infusión. Ajuste la velocidad de infusión a 0,01 mL/min.
- Conecte la jeringa por el tubo PE-30 a un lado del conector de tres vías. Conecte el catéter vesical del otro lado a un transductor de presión. Antes de conectar el catéter vesical, asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire.
- Fije el transductor de presión al mismo nivel que la vejiga del ratón. El transductor de presión está conectado a través de un amplificador al sistema de adquisición de datos.
- Conecte un gancho de línea de tierra a la piel y el otro a los sitios de conexión de electrodos. Registre la presión en el software.
- Después de iniciar el software, verifique las señales de presión intravesical (IVP) y EUS-EMG. Guarde el nombre de la muestra y establezca la hora.
- Inicie la infusión de la bomba. Registre las señales.
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Resultados
Para analizar los datos se utilizaron cistometría y trazados de actividad EUS-EMG. El método de cistometría continua consiste en la infusión de solución salina en la vejiga y la medición simultánea de los cambios de presión y volumen en la vejiga. Para medir el VV, se infundieron 0,4 mL de solución salina a una velocidad de 0,01 mL/min, y la orina se recolectó durante 40 min en un tapón. El residuo postmiccional (PVR) se puede obtener aspirando la solución salina a través del catéter. En ratones normales sin pegamento, l...
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Discusión
Esta técnica urodinámica describe un procedimiento mejorado para medir el volumen de orina y la señal EUS-EMG en ratones despiertos y restringidos. La presencia de pelo alrededor del meato uretral y el área abdominal puede interferir con la precisión de la medición del VV mediante la absorción de orina. Aunque el pelaje que rodea el meato uretral y el abdomen se había afeitado cuidadosamente antes de la cirugía, los pequeños pelajes restantes dentro de estas áreas y la piel aún absorbían la orina, por lo general dejando ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por NIH-NINDS (R21NS130241), IND DEPT HLTH (55051, 74247, 74244) y US ARMY (HT94252310700).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acelerador | BOB SMITH INDUSTRIES | BSI-152 | |
| Cianoacrilato | TED PELLA, Inc | 14478 | |
| Molde base desechable | TED PELLA, Inc | 27147-4 | |
| Bomba de infusión | Harvard Apparatus PHD ULTRA | 70-3006 | |
| Isoflurano | Henry Schein Inc | 1182097 | |
| PIN | World Precision Instruments | 5482 | |
| Tubo de polietileno 30 | Braintree Scientific Inc | PE30 | |
| barco de pesaje estéril | HEATHROW SCIENTIFIC | 797CK2 | |
| Windaq/Lite | INSTRUMENTOS DATAQ 249022 |
Referencias
- Leslie, S. W., Tadi, P., Tayyeb, M. Neurogenic bladder and neurogenic lower urinary tract dysfunction. Statpearls. , (2024).
- Doelman, A. W., Streijger, F., Majerus, S. J., Damaser, M. S., Kwon, B. K. Assessing neurogenic lower urinary tract dysfunction after spinal cord injury: Animal models in preclinical neuro-urology research. Biomedicines. 11 (6), 1539(2023).
- Fraser, M. O., et al. Best practices for cystometric evaluation of lower urinary tract function in muriform rodents. Neurourol Urodyn. 39 (6), 1868-1884 (2020).
- Hashimoto, M., et al. Sex differences in lower urinary tract function in mice with or without spinal cord injury. Neurourol Urodyn. 43 (1), 267-275 (2024).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury-a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Lee, J., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. Int Urogynecol J. 14, 31-37 (2003).
- Mann-Gow, T. K., et al. Evaluating the procedure for performing awake cystometry in a mouse model. J Vis Exp. (123), e55588(2017).
- Saito, T., et al. Time-dependent progression of neurogenic lower urinary tract dysfunction after pinal cord injury in the mouse model. Am J Physiol Renal Physioly. 321 (1), F26-F32 (2021).
- Schneider, M. P., et al. A novel urodynamic model for lower urinary tract assessment in awake rats. BJU Int. 115, 8-15 (2015).
- Habib, A., Mehanna, A., Medra, A. Cyanoacrylate: A handy tissue glue in maxillofacial surgery: Our experience in alexandria, egypt. J Maxillofac Oral Surg. 12, 243-247 (2013).
- Sunjic Roguljic, V., Roguljic, L., Jukic, I., Kovacic, V. The influence of wound closure techniques after surgical decompression in patients with carpal tunnel syndrome on sleep disturbance and life quality: A prospective comparison of surgical techniques. Clin Pract. 14 (2), 546-555 (2024).
- Sohn, J. J., Gruber, T. M., Zahorsky-Reeves, J. L., Lawson, G. W. Comparison of 2-ethyl-cyanoacrylate and 2-butyl-cyanoacrylate for use on the calvaria of cd1 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 55 (2), 199-203 (2016).
- Ren, H., et al. Injectable, self-healing hydrogel adhesives with firm tissue adhesion and on-demand biodegradation for sutureless wound closure. Sci Adv. 9 (33), 4327(2023).
- Ito, H., Pickering, A. E., Kanai, A., Fry, C. H., Drake, M. J. Muro-neuro-urodynamics; a review of the functional assessment of mouse lower urinary tract function. Front Physiol. 8, 240395(2017).
- Abdelkhalek, A. S., Youssef, H. A., Saleh, A. S., Bollen, P., Zvara, P. Anesthetic protocols for urodynamic studies of the lower urinary tract in small rodents-a systematic review. PloS One. 16 (6), e0253192(2021).
- Saab, B. J., et al. Short-term memory impairment after isoflurane in mice is prevented by the α5 γ-aminobutyric acid type a receptor inverse agonist l-655,708. J Am Soc Anesthesiol. 113 (5), 1061-1071 (2010).
- Cannon, T. W., Damaser, M. S. Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat. Life Sci. 69 (10), 1193-1202 (2001).
- Weiss, D. A., et al. Morphology of the external genitalia of the adult male and female mice as an endpoint of sex differentiation. Mol Cell Endocrinol. 354 (1-2), 94-102 (2012).
- Leggat, P. A., Kedjarune, U., Smith, D. R. Toxicity of cyanoacrylate adhesives and their occupational impacts for dental staff. Ind Health. 42 (2), 207-211 (2004).
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