El estudio presenta Zebra II, un sistema avanzado para la adquisición y análisis prolongados de ECG en pez cebra. Este sistema cuenta con un sistema de perfusión independiente y electrodos de múltiples puntos para el manejo de múltiples peces en entornos controlados. Se evaluaron y analizaron los efectos agudos de la amiodarona con pez cebra de tipo salvaje.
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Artículo de método
Zebra II como un nuevo sistema para registrar señales electrofisiológicas en el pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra y sus líneas mutantes se han utilizado ampliamente en investigaciones biomédicas, estudios cardiovasculares y detección de medicamentos. En el presente estudio, se presenta la versión comercial del novedoso sistema, Zebra II. El protocolo demuestra la adquisición y el análisis de electrocardiogramas (ECG) de múltiples peces cebra dentro de entornos de trabajo controlables. El dispositivo está compuesto por un sistema de perfusión externo e independiente, un electrodo de 4 puntos, sensores de temperatura y un sistema electrónico integrado. En estudios anteriores, el prototipo del dispositivo se sometió a validación contra el sistema iWORX establecido a través de varias pruebas, demostrando una calidad de datos y una respuesta de ECG similares a las intervenciones farmacológicas. A continuación, el estudio profundizó en el examen del impacto de los fármacos anestésicos y las fluctuaciones de temperatura en el ECG del pez cebra, lo que requirió una evaluación instantánea de los datos. Gracias a la capacidad del aparato para la administración constante de anestésicos y fármacos, fue posible extender la recolección de datos de ECG hasta 1 h, notablemente más que la duración de 5 min admitida por los sistemas actuales. Este documento presenta un análisis pionero, automatizado y basado en la nube que utiliza datos de cuatro peces cebra, ofreciendo un método eficiente para realizar experimentos combinados y reducir significativamente el tiempo y el esfuerzo. El sistema demostró ser eficaz en la captura y el análisis de ECG, especialmente en la detección de arritmias inducidas por fármacos en peces cebra de tipo salvaje. Además, la capacidad de recopilar datos a través de múltiples canales facilitó la ejecución de ensayos controlados aleatorios con modelos de pez cebra. El sistema de ECG desarrollado supera las limitaciones existentes, mostrando el potencial para acelerar en gran medida el descubrimiento de fármacos y la investigación cardiovascular con pez cebra.
Introducción
Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en todo el mundo. Según el Informe de actualización de la AHA de 2024, alrededor de 2552 personas mueren cada día de ECV en los EE. UU., y el costo promedio directo e indirecto de las ECV se estimó en $ 378.0 mil millones en 2017-20181. La fibrilación auricular (FA) es una de las arritmias cardíacas más comunes en los EE. UU.2 y se asocia con un pronóstico desfavorable, lo que aumenta el riesgo de accidente cerebrovascular y muerte tanto en CVD como en escenarios de enfermedades no cardiovasculares, lo que lleva a un mayor riesgo de resultados adversos3. Este tipo de arritmia se distingue por su actividad eléctrica rápida e irregular en las aurículas, que generalmente resulta en un ritmo ventricular rápido e irregular4. Además, dados los eventos recientes de COVID-19, ha habido un mayor número de estudios y evidencia que muestran una mayor aparición de arritmia en relación con COVID-19, principalmente a la bradicardia sinusal5. En el lado opuesto de la FA, la bradicardia sinusal presenta un ritmo cardíaco disminuido y más lento, con una frecuencia cardíaca inferior a 60 latidos por minuto (lpm). Este diagnóstico requiere un electrocardiograma (ECG) que muestre un ritmo sinusal normal a una frecuencia inferior a 60 lpm.
El pez cebra, Danio rerio, ha demostrado ser un modelo ideal para estudios cardiovasculares y de desarrollo de fármacos debido a su homología con los humanos tanto en morfología, fisiología y genética6,7. A pesar de tener solo dos cámaras discernibles en comparación con el corazón de cuatro cámaras en los humanos, el pez cebra posee una estructura contráctil similar con un sistema de conducción análogo8,9. Por lo tanto, el modelo de pez cebra es adecuado para investigar arritmias cardíacas y explorar la asociación entre las vías genéticas relacionadas y las características electrofisiológicas a través del análisis de ECG. En cuanto al diseño del sensor para el registro de ECG en el pez cebra, se utilizan comúnmente electrodos de aguja convencionales10. Otros estudios presentaron alternativas a las agujas convencionales mediante el diseño de un tipo diferente de aguja hecha de diferentes materiales11, estas incorporaron materiales como filamento de tungsteno, acero inoxidable y alambre de plata para evaluar la calidad de los datos registrados. Junto con el kit portátil de ECG, buscaron establecer una plataforma universal para los laboratorios de investigación y educativos.
El sistema de agujas también se implementó en otros estudios11,12,13,14 para llevar a cabo investigaciones sobre efectos biológicos y/o inducidos por medicamentos, en los que mostró resultados alentadores. Sin embargo, para obtener señales óptimas, fue necesario insertar cuidadosamente las agujas a través de la dermis del pez cebra. Este procedimiento invasivo puede causar lesiones en el corazón del pez debido al filo de las agujas, lo que posiblemente cambie la morfología de la señal13. Además, la colocación precisa del electrodo en el corazón pequeño sin causar daño para garantizar una captura clara del ECG presenta una curva de aprendizaje significativa. En consecuencia, se han introducido varios sistemas de sondas sustitutivos, como las matrices de microelectrodos (MEA) y los sensores impresos en 3D. Tanto nuestro equipo como otros investigadores han utilizado con éxito MEA para la adquisición de datos, logrando datos que ofrecen una buena relación señal-ruido (SNR) junto con una alta resolución espacial y temporal15,16,17. Por ejemplo, introdujimos un MEA que envuelve el corazón del pez, lo que permite la captura de señales de ECG específicas del sitio15,16. En contraste, otro equipo desarrolló un tipo diferente de MEA basado en una placa de circuito impreso flexible (FPCB) hecha de película de poliimida destinada a registrar múltiples electroencefalogramas (EEG) para la investigación de la epilepsia18. Si bien los MEA permiten el registro de numerosas señales, están limitados por la capacidad de evaluar solo un pez a la vez debido al número restringido de canales de electrodos. En respuesta a esta limitación, recientemente hemos presentado un sistema avanzado capaz de realizar grabaciones simultáneas de ECG de múltiples fish19. Este sistema emplea dos electrodos, cada uno de 125 μm de espesor y hechos de poliimida, con electrodos pulverizados en oro colocados en la parte inferior de su carcasa para facilitar la adquisición de datos. Sin embargo, la inclusión de una bomba de circulación de agua introdujo ruido, afectando la calidad de la relación señal-ruido (SNR) de las señales de ECG. Además, era necesario el uso de herramientas de recopilación de datos voluminosas y costosas, que requerían una conexión por cable a una computadora. En el mercado, sistemas como iWORX ofrecen una portabilidad mejorada a través de un amplificador compacto, pero se enfrentan a problemas no resueltos: (i) su tiempo de grabación es demasiado corto (3-5 min) para experimentos que necesitan duraciones más largas, como los que involucran efectos agudos de medicamentos; (ii) la necesidad de anestesiar a los animales, lo que puede estresarlos y sesgar los datos electrofisiológicos cardíacos innatos; (iii) las mediciones manuales y secuenciales dificultan la investigación con un gran número de peces; y (iv) la necesidad de procesamiento de datos de ECG fuera de línea y laborioso. Es importante destacar que aún no han surgido sistemas de alto rendimiento que incorporen microelectrónica para analizar fenotipos mutantes. Por lo tanto, la creación de sistemas de alto rendimiento que permitan el registro extendido del ECG es crucial para descubrir vínculos entre los fenotipos arrítmicos y los genotipos mutantes, identificar múltiples fenotipos arrítmicos asociados con genotipos mutantes individuales y probar la eficacia de los fármacos cardíacos utilizando el modelo de pez cebra. En consecuencia, presentamos, en 2022, el innovador prototipo del sistema Zebra II. Este novedoso sistema está equipado para realizar registros de ECG extendidos de varios peces a la vez. Para lograr esto, se elaboró un sistema electrónico interno, que utiliza la tecnología de Internet de las cosas (IoT) para la transmisión inalámbrica de datos y permite el análisis de datos a través de una aplicación móvil. La inclusión de la tecnología IoT no solo reforzó la flexibilidad y la portabilidad del sistema, sino que también facilitó las colaboraciones remotas para la investigación en modelos de pez cebra. En un estudio anterior, validamos la eficacia del sistema a través de pruebas exhaustivas, que mostraron su capacidad para 1) adquirir datos de ECG simultáneamente de cuatro peces; 2) realizar registros continuos de ECG durante un máximo de 1 hora, lo que supera significativamente la capacidad de los sistemas existentes que solo capturan unos pocos minutos; 3) minimizar los efectos de confusión de la anestesia mediante el empleo de una concentración reducida del 50% de tricaína. Además, el sistema demostró una gran capacidad para registros prolongados de ECG en varios experimentos, como los que involucran el bloqueo sinoauricular (SA) inducido por sodio, los cambios en la frecuencia cardíaca inducidos por la temperatura y las arritmias inducidas por medicamentos en peces mutantes y salvajes Tg (SCN5A-D1275N) en condiciones experimentales controladas. La adopción por parte del sistema de múltiples canales de electrodos para el registro extendido de ECG permite aún más la ejecución de ensayos controlados aleatorios, lo que permite estudiar dos peces por grupo experimental en condiciones idénticas20. En este artículo, presentamos la versión mejorada del sistema, con un electrodo de 4 puntos. Esta mejora permite a los usuarios capturar lecturas de ECG desde varios lugares del pez, lo que reduce significativamente la posibilidad de obtener señales de ECG de baja calidad. Además, esta iteración se basa y refina la mayoría de las funcionalidades descritas en investigaciones anteriores19. Este sistema de ECG evolucionado es muy prometedor para abordar las limitaciones existentes, lo que facilita sustancialmente el análisis de fenotipos arrítmicos y el cribado de fármacos en el pez cebra. La innovadora adición del electrodo de 4 puntos se probó rigurosamente a través de un breve estudio sobre la arritmia inducida por fármacos en el pez cebra de tipo salvaje, validando aún más su eficacia.
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Protocolo
Cumplir estrictamente con las pautas éticas garantiza el bienestar y el manejo adecuado del pez cebra involucrado en nuestros experimentos. Todas las actividades experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares establecidos por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Los experimentos y hallazgos detallados aquí fueron ejecutados con la aprobación de IACUC bajo el protocolo autorizado AUP-21-066.
1. Preparación y almacenamiento de soluciones madre
PRECAUCIÓN: Prepare la solución madre de tricaína en una campana extractora, utilizando el equipo de protección personal (EPP) adecuado.
- Mida 400 mg de polvo de tricaína y disuélvalo en 97,9 ml de agua desionizada (DI). Coloque un agitador magnético en el recipiente y mezcle gradualmente la solución.
- Ajuste el pH añadiendo gradualmente menos de 17 mL de solución de NaOH. Continúe agregando gotas de NaOH hasta que el pH alcance un rango de 6.8.-7.2.
- Determine la concentración final de la solución de tricaína, teniendo en cuenta el NaOH añadido necesario para ajustar el pH y almacenar.
NOTA: La solución de tricaína es sensible a la luz y debe almacenarse en un recipiente de color ámbar a 4 °C cuando no esté en uso. - Mida 258,13 mg de amiodarona y disuélvala en 1 L de agua desionizada. Inserte un agitador magnético en el recipiente y revuelva durante unos minutos hasta que la solución esté completamente disuelta y libre de polvo. Guarde la solución dentro de un refrigerador a 4 ° C cuando no esté en uso.
NOTA: La amiodarona debe prepararse dentro de una campana extractora y almacenarse dentro de un refrigerador a 4 °C. Use siempre el EPP adecuado.
2. Cría de peces
- Mantenga los peces en tanques individuales conectados a un sistema de circulación de agua, manteniendo la temperatura entre 28-29 ° C.
- Garantice el monitoreo continuo de la calidad del agua y cumpla con un ciclo día-noche de 14 h/10 h.
- Divida los 40 peces en cuatro grupos, cada uno de los cuales consta de 10 peces, y colóquelos en tanques separados.
3. Configuración del dispositivo
NOTA: El procedimiento descrito en el paso 3.2 debe realizarse para cada cámara del dispositivo (Figura 1). Si bien cada cámara se puede configurar de manera diferente, para mantener la consistencia en el experimento, es recomendable mantener configuraciones uniformes en todas las cámaras.
- Conecte el dispositivo a una fuente de alimentación e inicie la operación presionando el botón rojo ubicado en el panel frontal.
- Navegue por la pantalla táctil del dispositivo para elegir la cámara que desea configurar.
- Ajuste el ajuste del filtro de paso bajo a 0,1 Hz y el ajuste del filtro de paso alto a 500 Hz. Ajuste el ajuste de ganancia a 10.000.
- Levante la tapa frontal para acceder a las cuatro cámaras. Antes de comenzar el experimento, sumerja la esponja de cada cámara (esponja de celulosa estándar) en una solución de tricaína, luego exprima el exceso de líquido.
- Gire la guía de cuatro electrodos para asegurarse de que la esponja esté accesible antes de introducir el pez.
4. Tratamiento con amiodarona
NOTA: Utilice el agua de las peceras (agua de peces) para preparar soluciones diluidas de Amiodarona y Tricaína. Los pasos 4.3 y 4.4 deben repetirse para cada grupo separado en el paso 2.3 para cada solución preparada en el paso 4.1.
- Siga los pasos que se describen a continuación para diluir la solución madre de amiodarona.
- Diluya 8,75 mL de solución madre en 41,25 mL de agua de pescado para lograr una concentración de 70 μM.
- Diluya 12,5 mL de solución madre en 37,5 mL de agua de pescado para lograr una concentración de 100 μM.
- Diluir 25 mL de solución madre en 25 mL de agua de pescado para lograr una concentración de 200 μM.
- Prepare la solución de anestesia diluyendo 4 mL de solución madre de Tricaine en 100 mL de agua de pescado, lo que da como resultado una concentración de Tricaine de 0,16 mg/mL
- Sumerja cada pez individualmente en la solución de amiodarona preparada durante 5 min. Use temporizadores para controlar con precisión la duración de la inmersión.
- Transfiera el pez a la solución de tricaína durante 2-3 minutos para la anestesia. Asegúrese de que el tratamiento no cause la muerte de los peces. Si un pez exhibe un comportamiento anormal, como pérdida de color o una reducción significativa en el movimiento de las branquias, retírelo de la solución inmediatamente y vuelva a colocarlo en el agua limpia del pez.
5. Recogida de datos de ECG
NOTA: Siga inmediatamente estas instrucciones después de completar el paso 4.4. Repita el proceso para cada cámara antes de sellar el dispositivo. Las cámaras están diseñadas para acomodar peces de entre 4 y 10 mm de ancho y 25 a 50 mm de largo.
- Levanta el pez de la solución de tricaína y colócalo sobre la esponja, asegurándote de que su lado ventral quede hacia arriba.
- Coloque la guía de electrodos en forma de rombo sobre el área del pecho del pez para capturar señales de ECG desde cuatro puntos diferentes simultáneamente (Figura 2A,B). Asegúrese de ajustar cada electrodo con cuidado para que cada alfiler haga contacto con la piel del pez.
- Gire cada electrodo, bajando el pasador hasta que haga contacto con la parte inferior del pez. Si el alfiler está demasiado alto, gire el tornillo de mariposa correspondiente en el sentido de las agujas del reloj para bajarlo hasta que toque el pez.
- Realice el ajuste descrito anteriormente para los electrodos en todas las cámaras.
- Cierre la tapa de las cámaras una vez que todos los mazos de electrodos estén colocados correctamente sobre el pez en las cámaras operativas.
- Marque cada cámara para la grabación seleccionándola en la pantalla táctil y, a continuación, inicie la grabación haciendo clic en el botón Grabar en la pantalla.
- Haga clic en el botón Detener después de 2 minutos y luego haga clic en el botón Guardar en las ventanas de aviso que aparecen en la pantalla después de detenerse. Guarde la información en un disco o en la nube, dependiendo de las necesidades específicas de investigación.
6. Solución de problemas del sistema de posicionamiento de la matriz de cuatro electrodos
NOTA: Ocasionalmente, uno o varios electrodos pueden fallar en capturar una señal clara de ECG, lo que requiere un reposicionamiento. Utilice los siguientes pasos para solucionar problemas de la guía de electrodos cuando sea necesario.
- Presione el botón Detener en la interfaz del dispositivo para detener el proceso de grabación e identificar el canal o canales con señales inconsistentes.
- Levante la tapa frontal para acceder a las cámaras de electrodos. Identifique qué cámara(s) y electrodos específicos están causando problemas.
- Gire el tornillo de mariposa superior en el sentido de las agujas del reloj para ajustar la proximidad del electrodo al pez. Esta acción hará que el electrodo baje más cerca del pez.
- Repita el paso 6.3 según sea necesario. Si el simple hecho de acercarse no resuelve el problema, gire el electrodo a un punto diferente del pez hasta que se logre una señal satisfactoria.
7. Extracción y análisis de datos
NOTA: Todos los análisis de datos básicos presentados en este documento utilizan la técnica de ondículas21 para reducir varios tipos de ruido y la desviación estándar de los latidos normales de los senos paranasales (SDNN) para calcular la varianza latido a latido de la FC en segmentos de un minuto.
- Una vez que los datos se hayan guardado en el disco o en la nube, recupérelos para su análisis o envíelos directamente a un servidor en la nube para su posterior procesamiento.
- Navegue hasta los datos guardados haciendo clic en el botón Examinar en la pantalla y seleccione los conjuntos de datos que desea utilizar.
- Seleccione el botón Extraer en las opciones en pantalla y conecte una unidad USB a la parte posterior del dispositivo para extraer los datos.
- Siga las instrucciones del dispositivo para guardar los conjuntos de datos seleccionados en la unidad externa para su posterior recuperación y análisis.
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Resultados
La capacidad de registrar simultáneamente señales de ECG de múltiples peces distingue significativamente a este dispositivo, ofreciendo una ventaja considerable al reducir el tiempo necesario para la investigación farmacológica o cardíaca en pez cebra u otras especies similares (Figura 1). Registrar señales de ECG precisas puede ser un desafío debido a las variaciones anatómicas entre los peces, especialmente en lo que respecta a la colocación de los electrodos. Tradicionalmente, obtener una...
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Discusión
Los pasos actuales fueron modificados y mejorados de acuerdo con esta nueva versión del dispositivo a partir de un estudio previo realizado por nuestro equipo20. Aquí, también se incluye un diseño asistido por computadora (CAD) etiquetado del dispositivo.
Como se destaca en la guía de solución de problemas del protocolo, el dispositivo requiere que el usuario ejecute ciertos pasos críticos con diligencia y precisión, ya que estos pasos afectan de manera crucial la calid...
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Divulgaciones
Hung Cao y Michael Lau son los fundadores de Sensoriis, Inc. El sistema Zebra II de Sensoriis se desarrolló con el apoyo de los NIH, #R44OD024874 de subvención de la Fase II de SBIR. La Universidad de California, Irvine, ha revisado y aprobado la relación de Hung Cao con Sensoriis, Inc. de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. Los demás autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Estamos agradecidos por el apoyo del #R44OD024874 de la Fase II del SBIR de los NIH a H.C. y M.P.H.L. Los autores también desean agradecer el apoyo financiero brindado por el Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT) en México a través de la beca Beca CONAHCYT para Estudios de Doctorado en el Extranjero.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Clorhidrato de amiodarona | Sigma-Aldrich | PHR1164-1G | Polvo de amiodarona |
| Medidor de pH/mV de sobremesa | Sper Scientific | ||
| Etil3-aminobenzoato, sal de ácido metanosulfónico, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC118002500 | Tricaína en polvo |
| Isotemp Agitador de placa caliente Fisher | SP88854200 | Scientific | |
| Sistema Zebra II | Sensoriis | N/A | Comercial Sistema de registro de ECG de pez |
| cebra Sistema de ECG de pez cebra | iWorx | ZS-200 Sistema de | registro de ECG de pez cebra comercial |
Referencias
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