Técnica de natación horizontal en forma de U para la preparación de espermatozoides de alta calidad con bajo índice de fragmentación del ADN

Resumen

Este protocolo describe un método para el cribado de espermatozoides de alta calidad con un bajo índice de fragmentación del ADN mediante la utilización de las características de motilidad de los espermatozoides y la tigmotaxis. El método emplea un carril de natación horizontal en forma de U, lo que permite que los espermatozoides de alta calidad lleguen al lado opuesto a través de gotas tampón, mientras que los espermatozoides muertos, los restos de células y las impurezas se excluyen.

Resumen

El semen humano es una mezcla compleja que comprende espermatozoides progresivamente móviles, espermatozoides no progresivamente móviles, espermatozoides inmóviles, restos celulares y plasma seminal viscoso. Los espermatozoides de alta calidad se refieren a espermatozoides progresivamente móviles con morfología normal, que a menudo exhiben un índice de fragmentación del ADN (DFI) más bajo y un mayor potencial de fertilización. La preparación de esperma de alta calidad es un paso crítico en la tecnología de reproducción asistida por humanos. El método tradicional de preparación de espermatozoides, la centrifugación en gradiente de densidad discontinua (DGC), requiere mucho tiempo y mano de obra. La centrifugación repetida puede dañar el ADN de los espermatozoides, afectando así a la posterior fecundación y al desarrollo embrionario. Este estudio presenta un método de natación horizontal en forma de U (UHS) para preparar espermatozoides de inyección intracitoplasmática (ICSI), que elimina significativamente los efectos perjudiciales de la centrifugación en el ADN de los espermatozoides. El método UHS consiste en crear un carril UHS utilizando un medio de fertilización dentro de una placa operativa ICSI. Se coloca una microgota de medio de fertilización de 10 μL en el punto de inicio en el lado izquierdo del carril UHS para contener el semen. Dos gotas tampón adicionales de 10 μL de medio de fertilización se colocan a intervalos a lo largo de la sección central izquierda del carril, con todas las gotas conectadas por el medio de fertilización. A continuación, la placa se cubre con aceite de cultivo y se incuba durante la noche a 37 °C con un 6% de_CO2 para equilibrarse. Posteriormente, se añaden 3 μL de semen a la microgota en el punto de partida. Los espermatozoides de alta calidad nadan hacia el lado derecho del carril UHS, lo que facilita su succión en la aguja de inyección ICSI. Los espermatozoides muertos, los restos de células y otras impurezas viscosas permanecen en gran medida en el punto inicial o en las gotas tampón. Procesamos simultáneamente 21 muestras de semen utilizando las técnicas UHS y DGC y comparamos su DFI. Los resultados demostraron que el DFI en el grupo DGC fue del 5,5% ± del 3,2%, mientras que el DFI en el grupo UHS fue del 1,7% ± del 1,1%. La diferencia entre los dos grupos fue estadísticamente significativa (P < 0,05).

Introducción

Las técnicas de optimización del semen y preparación de espermatozoides juegan un papel crucial en la obtención de fracciones celulares enriquecidas con espermatozoides estructural y funcionalmente superiores, lo cual es un paso clave en la tecnología de reproducción asistida por humanos¹. El propósito de la optimización del semen es: (1) reducir o eliminar las prostaglandinas, las células inmunoactivas, los anticuerpos antiespermatozoides, los espermatozoides inmóviles de baja calidad, las bacterias y los desechos en el plasma seminal; (2) Reducir o eliminar la viscosidad del semen; y (3) Promover la capacitación de los espermatozoides y mejorar la capacidad de fertilización. Una técnica ideal de preparación de espermatozoides debe recuperar una población de espermatozoides altamente funcional que preserve la integridad del ADN y no induzca disfunción a través de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por parte de los espermatozoides y los leucocitos².

La tecnología de preparación de espermatozoides más utilizada en la actualidad es el método DGC. Las ventajas de este método son su alta tasa de recuperación³ y su fácil estandarización. En el uso práctico, se puede seleccionar de manera flexible en función de la calidad de la muestra para el método de gradiente de doble densidad⁴, el método mini-DGC o el método de centrifugación de gradiente de una sola capa⁵. Este método se puede utilizar para preparar espermatozoides de alta calidad con buena vitalidad, libres de restos celulares, glóbulos blancos contaminados, células no germinales y células germinales degeneradas. Sin embargo, la desventaja de este método es que requiere centrifugación, lo que puede causar daños en el ADN de los espermatozoides⁶.

El método que aquí se presenta es una adaptación del estudio original de Baldini et ^al.7, que se centró en la migración horizontal de espermatozoides en placas de inyección. Este método modificado incorpora un carril horizontal en forma de U para separar los espermatozoides de alta calidad con una fuerte vitalidad. Evita el daño al ADN causado por la centrifugación y minimiza la influencia de espermatozoides muertos, restos celulares y otras impurezas viscosas durante los procedimientos de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).

El enfoque específico implica el uso de un medio de fertilización para crear un carril UHS en el plato de operación ICSI. Se coloca una microgota de medio de fertilización de 10 μL en el punto de inicio izquierdo del carril UHS para contener el semen. Dos gotas tampón adicionales de 10 μL de medio de fertilización se colocan a intervalos en la sección central izquierda del carril UHS, y todas las gotas están conectadas por medio de fertilización. Después de cubrir la instalación con aceite de cultivo, la placa se incuba durante la noche a 37 °C con 6% de CO₂ para equilibrar. Posteriormente, se añaden 3 μL de semen a la microgota en el punto de inicio en el lado izquierdo del carril UHS. Los espermatozoides de alta calidad nadan hasta la pista en el lado derecho del carril UHS, lo que facilita su recolección con la aguja de inyección ICSI. Los espermatozoides muertos, los restos de células y otras impurezas viscosas permanecen principalmente en la ubicación original o en las gotas del tampón.

El chip microfluídico simula el proceso de selección natural en el tracto reproductivo femenino, lo que permite el aislamiento óptimo de espermatozoides de alta calidad del semen sin centrifugación. Esto es fundamental para mejorar la motilidad de los espermatozoides⁸, reducir el índice de fragmentación del ADN de los espermatozoides⁹ y mejorar los resultados del embarazo¹⁰. Sin embargo, la fabricación de dichos dispositivos es compleja, costosa y difícil de implementar ampliamente.

El protocolo aquí descrito ofrece una alternativa novedosa, sencilla y factible. Al aprovechar las características de motilidad de los espermatozoides, este método logra resultados comparables a los de la tecnología microfluídica. Los espermatozoides preparados exhiben una fuerte vitalidad, bajos índices de fragmentación del ADN y son adecuados para su uso en ICSI.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Afiliado Huai'an First People's Hospital de la Universidad Médica de Nanjing (número de aprobación: KY-2024-181-01). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes cuyas muestras se utilizaron en este estudio. El procedimiento debe ser realizado por personal experimentado, de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio y las guías clínicas^11,12. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de una antena parabólica ICSI

1. Utilice 20 μL de medio de fertilización para crear pistas en forma de U en la placa de operación ICSI (Figura 1). La longitud de la pista izquierda de la pista en forma de U debe ser de unos 30 mm, y la longitud de la pista derecha también debe ser de unos 30 mm.
2. Aspire 10 μL de medio de fertilización con una pipeta y cree una gota circular en el punto de inicio izquierdo de la pista en forma de U. Conéctelo con el punto de inicio izquierdo de la pista en forma de U para agregar la solución madre de semen.
3. Cree dos gotas de tampón de medio de fertilización de 10 μL a intervalos en la sección central izquierda del carril UHS. Conecte todas las gotas con el medio de fertilización.
4. Cree una tira larga de gota de líquido en el lado derecho del carril en forma de U con 2,5 μL de polivinil pirrolidona (PVP). Asegúrese de que la tira PVP esté paralela al carril derecho del carril en forma de U.
5. Haga seis microgotas usando el medio de procesamiento de ovocitos en el lado derecho de la tira de PVP, con 20 μL por gota.
6. Agregue 7 ml de aceite de cultivo al plato, asegurándose de que el aceite cubra el punto más alto de la gota. Colóquelo en una incubadora a 37 °C y 6% de CO₂ durante la noche para mantener el equilibrio.

2. Recogida de muestras de semen

1. Proporcionar a los pacientes instrucciones claras escritas y verbales con respecto a la recolección de la muestra de semen. Asegúrese de que la recolección de la muestra esté completa e indique a los pacientes que se abstengan de eyacular durante 3 a 7 días antes de la recolección.
2. Recoja el semen a través de la masturbación en una taza de recolección de esperma especializada desechable, estéril y no tóxica. Asegúrese de que se recoja todo el eyaculado e instruya a la persona para que informe sobre cualquier pérdida de cualquier fracción de la muestra.
3. Verifique los nombres, documentos de identificación válidos y huellas dactilares del cónyuge del paciente. Marque el nombre y el número de registro médico del cónyuge del paciente en el cuerpo y la tapa de la copa de recolección de esperma.
4. Después de que el paciente masculino haya recolectado el semen, entregue la muestra cara a cara entre el personal y el paciente. Tome una pequeña cantidad de la muestra de semen para empaquetarla y almacenarla. Asegúrese de que el paciente firme en el área de embalaje.
5. Numere y almacene las muestras encapsuladas durante 2 años. Registre la información del paciente, el número de identificación y las firmas del destinatario y los testigos en el libro de registro de procesamiento de semen.
6. Si algún miembro del personal del centro reproductivo descubre la identidad de un paciente sospechoso, deje de recibir la muestra y vuelva a verificar la identidad del paciente. No reciba dos o más muestras al mismo tiempo. Si hay sospecha de confusión en los especímenes, deje de recibirlos.

3. Análisis de la muestra de semen

1. Observa el color de las muestras de semen.
   NOTA: El semen normal aparece homogéneo y de color blanco grisáceo después de la licuefacción. El semen con una concentración de espermatozoides muy baja puede parecer transparente. Si hay glóbulos rojos, el semen puede tener un aspecto marrón rojizo. Si el paciente tiene ictericia o toma ciertas vitaminas, el semen puede aparecer amarillo.
2. Mida el volumen de semen utilizando el método de pesaje, con una precisión de 0,1 mL.
3. Colocar la muestra de semen a 37 °C durante 15-30 min. Aspire en una pipeta desechable de plástico de diámetro ancho (aproximadamente 1,5 mm de diámetro), permitiendo que el semen caiga por gravedad. Observa la longitud de cualquier hilo.
   NOTA: Un eyaculado licuado normal forma gotas pequeñas y discretas. Si la viscosidad es anormal, la gota formará un hilo de más de 2 cm.
4. Si el semen aún no se licúa dentro de los 60 minutos, agregue una cantidad igual de medio fertilizante. A continuación, inhale y exhale repetidamente la mezcla con una pipeta de transferencia de plástico desechable hasta que se licúe por completo.
5. Mida el valor de pH del semen con papel de prueba de pH de precisión (pH 6.0-10.0).
6. Tome 10 μL de semen completamente licuado y gotee en una cámara de recuento Makler. Evalúe la motilidad de los espermatozoides en un campo de 200x con un microscopio óptico. Observar la presencia de espermatozoides aglutinantes y no espermatozoides.
7. Evalúe la concentración de espermatozoides en un campo de 200x con un microscopio óptico.

4. Recogida de ovocitos

1. Prepare un plato para recoger ovocitos (OPD) el día antes de la extracción de ovocitos. Añadir 2,5 mL de medio de procesamiento de ovocitos a una placa de cultivo estéril de 35 mm. A continuación, añada 1,5 ml de aceite y coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante la noche para mantener el equilibrio.
2. Prepare dos platos para el cultivo de ovocitos (TOC) el día antes de la extracción de ovocitos. Agregue 1 mL de medio de fertilización al anillo interno de una placa de cultivo de pozo central estéril, luego agregue 1 mL de aceite. Añadir 4 mL de medio de fertilización al anillo exterior. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C con 6% de CO₂ para equilibrarla durante la noche.
3. Encienda todos los calentadores y placas calefactoras y mida la temperatura 30 minutos antes de la extracción de ovocitos.
4. Lávese las manos con desinfectante de manos y enjuague bien con agua corriente. Use guantes limpios, estériles y libres de polvo.
5. Precalentar la placa de cultivo estéril en una plataforma de calentamiento a 37 °C.
6. Verificar estrictamente la identidad de la paciente antes de la extracción de ovocitos.
7. Inhale el líquido folicular en tubos de ensayo estériles a través de presión negativa, luego entréguelo inmediatamente a los embriólogos de laboratorio.
8. Vierta todo el líquido folicular en placas de cultivo estériles y busque complejos de cúmulos de corona de ovocitos (OCCC) bajo un microscopio estereoscópico de bajo aumento. Recoja los OCCC con una pipeta y colóquelos en un OPD para su almacenamiento temporal a 37 °C.
9. Registre la cantidad, el color, el número de folículos y el número de OCCC en el líquido folicular.
10. Después de la extracción de ovocitos, transfiera los OCCC a OCD utilizando una pipeta Pasteur estéril. Colóquelos rápidamente en una incubadora de cultivo (37 °C, 6% de CO₂, 5% de_O2 y humedad saturada) durante 2 h.
11. Prepare un plato de cuatro pocillos, agregue 0,5 mL de solución de hialuronidasa al primer pocillo y 1 mL de medio de procesamiento de ovocitos a cada uno de los tres pocillos restantes. Incubar a 37 °C durante 1 h.
12. Utilice una pipeta Pasteur para transferir los OCCC del paso 4.10 a una hialuronidasa que contenga un pocillo durante 30 s. A continuación, transfiera los OCCC a un medio de procesamiento de ovocitos que contenga un pocillo.
13. Utilice un tubo de extracción de ovocitos de 150 μm de diámetro para soplar y aspirar los OCCC para eliminar las células de la granulosa. A continuación, utilice una nueva pipeta Pasteur para transferir los ovocitos al medio de procesamiento de ovocitos para su lavado. Transfiéralos a otro TOC preequilibrado y colóquelos en una incubadora a 37 °C con 6% de CO₂ .

5. Selección de espermatozoides y operación ICSI

1. Añadir 5 μL de semen a la microgota del medio de fertilización en el punto de inicio izquierdo de la pista en forma de U en la placa de operación ICSI, que se preparó desde el paso 1.1 hasta el paso 1.6.
2. Coloque la placa de funcionamiento ICSI en una incubadora a 37 °C, 6% de CO₂ durante 30-60 min.
3. Abra el microscopio invertido, el sistema operativo del microscopio y la etapa de calentamiento para asegurarse de que todos los controles operativos se restauren a su rango controlable original, lo que permite un funcionamiento suave y cómodo.
4. Instale la aguja ICSI en el portaagujas. Fije el soporte de la aguja en el micromanipulador, ajuste la aguja de sujeción y la aguja de inyección en la lente del objetivo 4x, y ajuste secuencialmente sus ángulos y posiciones para que las dos agujas sean relativas y paralelas a la plataforma. Compruebe el rango de movimiento de la aguja de operación debajo de la lente del objetivo × 20.
5. Ajuste el ángulo y la posición de la aguja de sujeción del ovocito y la aguja de inyección debajo de la lente del objetivo 4x, de modo que las dos cabezas de la aguja estén relativas y paralelas a la platina. Mueva la aguja de operación hacia adelante, hacia atrás, hacia la izquierda y hacia la derecha. Compruebe el rango de movimiento de la aguja de operación bajo los objetivos 10x y 20x.
6. Levante la aguja de sujeción de ovocitos y la aguja de inyección para asegurarse de que la altura entre la mesa de operaciones y la mesa de calentamiento permita una fácil colocación del vaso quirúrgico sin tocar la aguja de operación.
7. Después de la comprobación, transfiera los ovocitos seleccionados del paso 4.12 a las microgotas del medio de procesamiento de ovocitos en la placa operativa ICSI, una por gota.
8. Coloque la placa de operación que contiene el ovocito en la platina caliente del operador del microscopio preparado.
9. Ajuste la distancia focal del microscopio debajo de la lente del objetivo 10x para que los bordes de las microgotas dentro del plato de operación sean claros y visibles.
10. Baje la aguja de inyección en la tira PVP de la placa de operación ICSI. Ajuste el microscopio para que la aguja de inyección sea claramente visible e inhale una pequeña cantidad de PVP en la aguja de inyección al mismo tiempo.
11. Mueva la aguja de inyección en la tira larga en el lado derecho de la pista en forma de U y extraiga espermatozoides de alta calidad con buena morfología y motilidad progresiva.
12. Transfiera los espermatozoides a la tira de PVP en el lado derecho y coloque los espermatozoides en el fondo de la placa de operación.
13. Presione suavemente la aguja de inyección en la sección media o inferior de la cola de espermatozoide, tire rápidamente de la aguja de inyección hacia atrás y rasque el esperma para que se detenga.
14. Inhale el esperma desde la cola hasta la cabeza en la aguja de inyección.
15. Transfiera la aguja de inyección a la gota del medio de procesamiento de ovocitos que contiene el ovocito en el lado derecho.
16. Baje la aguja de sujeción del ovocito y mueva suavemente el ovocito para colocar el primer cuerpo polar a las 12 en punto, asegurando el ovocito.
17. Ajustar la aguja microquirúrgica y la membrana del ovocito al mismo plano horizontal. Empuje los espermatozoides hasta la punta de la aguja de inyección.
18. Pasar verticalmente por la zona pelúcida a las 3 horas sobre el ovocito y continuar inyectando la aguja hasta que llegue al centro del ovocito o cruce ligeramente la posición central, con una ligera retracción de la aguja de inyección.
    NOTA: Cuando se produce un reflujo rápido en el citoplasma y los espermatozoides, indica que la membrana del ovocito se ha roto y la aspiración se ha detenido.
19. Inyecte lentamente los espermatozoides en el citoplasma del ovocito y salga de la aguja de inyección. La profundidad de la inyección de espermatozoides en el citoplasma debe ser de aproximadamente el 50%-75% del diámetro del ovocito.
20. Después de retirar la aguja de inyección, ajuste la presión negativa de la aguja de sujeción de ovocitos para liberar los ovocitos.
21. Repita los pasos anteriores hasta que se hayan inyectado todos los ovocitos maduros.
22. Transfiera la placa ICSI de la placa calefactora del microscopio al microscopio de disección.
23. Retire la placa de cultivo de escisión de la incubadora.
24. Transfiera el ovocito espermática inyectado a una microgota en una placa de cultivo de escisión.
25. Vuelva a colocar la placa de cultivo de escisión en una incubadora a 37 °C, 6% CO₂, 5% O₂ .

6. Preparación de espermatozoides mediante el método DGC

1. Añada 1,5 mL de solución de centrifugación en gradiente de densidad al 45% a un tubo de ensayo de fondo cónico estéril de 15 mL.
2. Agregue lentamente 1,5 ml de solución de centrifugación en gradiente de densidad del 90% al fondo de la solución de centrifugación en gradiente de densidad del 45%, manteniendo la interfaz entre los dos líquidos.
3. Añadir suavemente el semen licuado sobre la solución de centrifugación en gradiente y centrifugar a 300 x g durante 15 min (a temperatura ambiente).
4. Retire el sobrenadante y agregue aproximadamente 0,5 mL del sedimento de esperma restante a 3 mL de medio de fertilización. Soplar y mezclar bien.
5. Centrifugar a temperatura ambiente a 200 x g durante 5 min.
6. Pipetear el sobrenadante y dejar unos 0,2 mL de sedimento.
7. Agregue una cantidad adecuada de medio de fertilización para resuspender el sedimento, cuente la concentración y vitalidad de los espermatozoides y registre. Colocar en una incubadora de CO2 al 6% a 37 °C para su uso posterior.

7. Detección de la integridad del ADN nuclear de los espermatozoides (Método de dispersión de la cromatina de los espermatozoides, SCD)

1. Ajuste la temperatura interior a 20-28 °C antes de realizar el experimento. Retire el kit de reactivos y deje que se equilibre a temperatura ambiente durante 30-60 min.
2. Prepare la solución desnaturalizante: Tome 0,8 mL de solución desnaturalizante concentrada y agréguela a 100 mL de agua destilada.
3. Prepare la solución de etanol al 70%: Tome 26,65 mL de agua destilada y 70,35 mL de etanol anhidro para preparar la solución de etanol al 70%.
4. Prepare la solución de etanol al 90%: Tome 9,55 mL de agua destilada y 90,45 mL de etanol anhidro para preparar la solución de etanol al 90%.
5. Coloque el tubo de agarosa de bajo punto de fusión (que contiene 25 μL de solución de agarosa de bajo punto de fusión) en un baño de agua a 90-100 °C durante 1-2 minutos hasta que el gel de agarosa se derrita por completo. A continuación, coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 5 minutos hasta que la temperatura sea constante.
6. Tomar 3-10 μL de semen antes del tratamiento de optimización y suspensión de esperma después del tratamiento de optimización. Agréguelos a diferentes tubos de agarosa de bajo punto de fusión, luego mezcle bien.
7. Tome 30 μL de la suspensión de agarosa de bajo punto de fusión que contiene esperma y colóquela en un portaobjetos de vidrio pretratado en posición horizontal.
8. Cubra suavemente el cubreobjetos (de 22 mm x 11 mm) con el portaobjetos, evitando en la medida de lo posible la formación de burbujas.
9. Coloque el portaobjetos de vidrio pretratado en un refrigerador a 2-8 °C durante 4 min, manteniendo el portaobjetos en posición horizontal durante todo el proceso. Retire el portaobjetos de vidrio del refrigerador y deslícelo suavemente para quitar la cubierta de vidrio.
10. Sumerja rápidamente el portaobjetos de vidrio pretratado en la solución desnaturalizante durante 7 min.
11. Retire el portaobjetos de vidrio pretratado y sumérjalo en agua destilada durante 5 s.
12. Retire el portaobjetos de vidrio pretratado y póngalo en posición vertical. Use papel de filtro para absorber las gotas de agua en la superficie del portaobjetos y evite tocar el área de la muestra.
13. Sumerja el portaobjetos de vidrio pretratado en el tampón de lisis y reaccione con precisión durante 20 minutos.
14. Sumerja los fragmentos pretratados en la solución de lavado durante 3 minutos para lavar la solución de lisis.
15. Retire el portaobjetos de vidrio pretratado y sumérjalo en una solución de etanol al 70% durante 2 minutos.
16. Retire el portaobjetos de vidrio pretratado y sumérjalo en una solución de etanol al 90% durante 2 minutos.
17. Retire el portaobjetos de vidrio pretratado y sumérjalo en una solución de etanol anhidro durante 2 minutos.
18. Retire el portaobjetos de vidrio pretratado y deje que se seque al aire de forma natural.
19. Prepare la solución A y la solución B para el tinte de Wright en una botella vacía marrón en una proporción de 1:1.
20. Coloque el portaobjetos de vidrio pretratado horizontalmente y agregue la solución de tinte mezclada en el portaobjetos, asegurándose de que la solución de tinte cubra todo el portaobjetos (aproximadamente 0,5-1 ml de solución de tinte).
21. Después de teñir durante 5 minutos, enjuague suavemente el portaobjetos de vidriera con agua destilada de 10 a 15 veces para eliminar el exceso de agente manchante.
22. Deje que el vidrio se seque naturalmente y obsérvelo bajo un microscopio óptico a 400×. Cuente más de 200 espermatozoides y determine el porcentaje de espermatozoides anormales con anillos de halo pequeños, sin anillos de halo y degeneración.

8. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos utilizando software disponible en el mercado.
2. Compare el DFI (%) entre el semen original, DGC y UHS utilizando la prueba de Friedman.
   NOTA: Para comparaciones por pares de dos métodos, utilice la prueba de rango con signo de Wilcoxon. Considere un valor p ≤ 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Se utilizaron los métodos UHS y DGC para optimizar el tratamiento de 21 muestras y comparar el índice de fragmentación del ADN espermático entre los dos métodos. El método que utiliza la pista UHS en la placa ICSI puede reemplazar al DGC, lo que puede causar daño a los espermatozoides. Los espermatozoides de alta calidad con buena motilidad progresiva nadan suavemente a lo largo del borde de la pista en forma de U (Figura 2), lo que facilita que la aguja ICSI los agarre individualmente. Los ...

Discusión

El paso clave para separar espermatozoides de alta calidad utilizando el método UHS descrito en este artículo es el establecimiento de un carril UHS con gotas tampón. Tanto el carril UHS como las gotas tampón se crean utilizando semen lavado y recibido. El carril UHS guía el esperma de alta calidad para que nade libremente y se acumule a lo largo del borde de la pista, lo que facilita su recolección. Las gotas tampón reducen la viscosidad del semen, filtrando los espermatozoides muertos,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de polivinil pirrolidona al 7%	Vitrolife Sweden AB	10111
ICSI Aspirador	LABOTECT-Aspirador	de
trabajo biológico limpio	Suzhou Antai	-Banco de	trabajo biológico limpio
Medio de cultivo de blastocistos	Vitrolife Sweden AB	10132	Medio de cultivo de blastocistos
Medio de cultivo de escisión	Vitrolife Sweden AB	10128	Medio de cultivo de escisión
CO2 incubadora	Thermo	Scientific-Incubadora de	CO2
Aceite de cultivo	Vitrolife Sweden AB	10029	OVOIL
Pipeta de transferencia de plástico desechable	BD Falcon	357575	pipeta de transferencia de plástico desechable
Medio de fertilización	Vitrolife Sweden AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI BD	Falcon	351006	placa de Petri
Hialuronidasa instantánea	Vitrolife Suecia AB	10017	Hialuronidasa instantánea
Microscopio invertido	NIKON	-	Microscopio invertido
Estación de trabajo de FIV	Dinamarca Estación de trabajo K-SYSTEM-IVF	de
recuento Makler	Sefi Medical Instruments		de recuento Makler
Sistema operativo micro NIKON		-	Micro sistema operativo
Medio de procesamiento de ovocitos	Vitrolife Sweden AB	10130	G-MOPS PLUS
Microscopio óptico	OLYMPUS-Microscopio		óptico
Microscopio de contraste de fase	de contraste de	NIKON&	nbsp;
Tablero de conteo de espermatozoides	Tablero	de	conteo de espermatozoides Markler
Solución de separación por gradiente de espermatozoides	Vitrolife Sweden AB	10138	SpermGrad
Kit de integridad del ADN del núcleo de los espermatozoides	Shenzhen HuaKang	-	Kit de integridad de ADN del núcleo de esperma (SCD)
Microscopio estereoscópico	NIKON-Microscopio		estereoscópico
Centrífuga de sobremesa	HETTICH-Centrífuga		de sobremesa
Gradilla termostática para tubos de ensayo	GRANT-Gradilla		termostática
tubos de ensayo Incubadora tri-gas	ASTEC-Incubadora		tri-gas