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Artículo de método

Revelando el transporte y los efectos de los xenobióticos en las mitocondrias aisladas: perspectivas de los ensayos respirométricos y enzimáticos

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DOI:

10.3791/67146

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7 de marzo de 2025

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1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta una metodología para estudiar los efectos de los xenobióticos sobre la función mitocondrial a través de ensayos respirométricos y enzimáticos. Examina la modulación de la cadena de transporte de electrones en varias especies, ofreciendo información para el desarrollo de bioplaguicidas dirigidos contra enfermedades transmitidas por insectos vectores.

Resumen

Las mitocondrias a menudo se denominan la fuente de energía de la célula debido a su papel crucial en la producción de energía a través de la cadena de transporte de electrones (ETC). Sin embargo, su importancia va mucho más allá de la producción de energía. La desregulación de la bioenergética mitocondrial puede desencadenar cascadas intracelulares que afectan la salud y la función celular. Dada su importancia fisiológica, existe un creciente interés en explorar el potencial farmacológico de la función mitocondrial para el desarrollo de nuevas terapias y bioproductos. La modulación de la bioenergética mitocondrial podría proporcionar enfoques innovadores para abordar desafíos como los trastornos neurodegenerativos, las enfermedades metabólicas y el cáncer, así como para desarrollar bioproductos para el control de plagas y enfermedades transmitidas por vectores.

Este trabajo presenta un método para evaluar los efectos de los xenobióticos en la cadena de transporte de electrones (ETC) utilizando varios sustratos, incluyendo glutamato y NADH para el complejo I, succinato para el complejo II y citocromo c (tanto oxidado como reducido) para los complejos III y IV. Esta metodología permite evaluar la activación o inhibición del transporte de electrones a través de complejos mitocondriales utilizando un respirómetro y un espectrofotómetro. Las mitocondrias pueden obtenerse de mitocondrias aisladas, células fragmentadas o tejido homogeneizado de varias especies.

En el laboratorio, se ha analizado la función mitocondrial en ratas Aedes aegypti y Wistar, pero este método también es aplicable a otras especies, como Rhipicephalus microplus y Rhodnius prolixus. Este enfoque proporciona la base para teorizar sobre la existencia de proteínas desacopladoras y las preferencias de sustratos oxidables específicas de la especie influenciadas por sus demandas energéticas únicas. Los hallazgos recientes ofrecen información valiosa sobre estrategias innovadoras de diseño de bioinsecticidas que se dirigen a la función mitocondrial, con un potencial significativo para controlar eficazmente las enfermedades transmitidas por vectores y las infestaciones de plagas.

Introducción

Las mitocondrias siempre han sido llamadas la planta de energía de las células debido a su generación de energía química durante el proceso de fosforilación oxidativa 1,2. Más allá de sus principales funciones metabólicas centrales, las mitocondrias también están implicadas en muchos otros procesos celulares, que van desde los niveles de regulación intracelular de Ca2+, los procesos inflamatorios y la producción de especies reactivas de oxígeno hasta los procesos de inducción de la muerte celular3. La bioenergética mitocondrial y su desregulación se han asociado con procesos intracelulares que afectan la función celular y la salud en general. Esto ha despertado un creciente interés en la investigación del potencial farmacéutico de dirigirse a la función mitocondrial para desarrollar terapias innovadoras y bioproductos seguros 4,5,6. Además, comprender la intrincada interacción de los procesos mitocondriales y su impacto en la función celular es crucial para desarrollar terapias dirigidas y presentar oportunidades para el diseño de bioproductos para controlar enfermedades transmitidas por vectores e infestaciones de plagas 7,8.

Dirigirse a componentes específicos de la cadena de transporte de electrones con xenobióticos ha surgido como una estrategia para modular la función mitocondrial para la generación de bioplaguicidas. Se ha demostrado que los compuestos naturales y sintéticos incluidos en las formulaciones de plaguicidas, como los plaguicidas dirigidos a mitocondrias basados en nanopartículas, afectan la función mitocondrial al disminuir el potencial mitocondrial y la síntesis de ATP en S. frugiperda9.

Además, se ha informado que la mayoría de los carbamatos y productos a base de piretroides son inhibidores del complejo I en mosquitos; sin embargo, su exposición prolongada ha creado algunas poblaciones resistentes a los piretroides en Anopheles gambiae, a menudo relacionadas con niveles elevados de P450 que pueden metabolizar estos sustratos10,11. Del mismo modo, las plantas y sus aceites esenciales, extractos y metabolitos secundarios han sido documentados como potenciales insecticidas con un amplio rango de mortalidad en diferentes estadios de los insectos12,13. La actividad insecticida de estos compuestos naturales puede estar relacionada con la inhibición del transporte de electrones en un punto específico de la cadena respiratoria mitocondrial mediante la modulación de la producción de especies reactivas de oxígeno, el potencial mitocondrial ΔΨm y la síntesis de ATP que pueden desencadenar procesos de muerte celular 6,8.

Los compuestos naturales, como fuentes para la formulación de plaguicidas, y sus efectos sobre las mitocondrias desempeñan un papel crucial en el diseño de bioplaguicidas nuevos y seguros. En este contexto, este manuscrito describe una metodología para identificar la capacidad de los xenobióticos para activar o inhibir el transporte de electrones a través de complejos mitocondriales. Este enfoque integral permite la medición precisa de los efectos de los xenobióticos en la función mitocondrial utilizando una variedad de sustratos, empleando métodos de respirometría y espectrofotometría. Esta metodología se ha aplicado para analizar la función mitocondrial de especies vectoras clave, incluido el Aedes aegypti, lo que ha llevado a teorizar la presencia de proteínas desacopladoras y distintas preferencias de sustratos oxidables específicas para cada especie.

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Protocolo

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité de ética en investigación científica CEINCI. Además, estos ensayos cumplieron con los lineamientos de Arrive y siguieron la Ley 84 de Colombia de 1989 (Capítulo IV, Art. 23-26) y la Resolución 8430 (1993, Título IV, Art. 83-93) que regula la investigación con animales en Colombia.

NOTA: Se recomienda encarecidamente leer el capítulo de fosforilación oxidativa de cualquier libro de bioquímica antes de comenzar este protocolo.

1. Reactivos y soluciones

  1. Para aislar las mitocondrias del hígado de rata, prepare 250 mL de tampón de aislamiento de mitocondrias: 250 mM de D-manitol, 10 mM de HEPES pH 7,2 y 1 mM de EGTA. Saque 50 mL de tampón de aislamiento (esto se llamará tampón de aislamiento sin BSA) y luego agregue 0,2 g de BSA a los otros 200 mL (esto se llamará tampón de aislamiento con BSA).
  2. Para homogeneizar las larvas de Aedes aegypti , prepare 100 mL de tampón: 250 mM de sacarosa, 10 mM de HEPES, 1 mM de EGTA pH 7,2.
  3. Preparar el tampón de reacción: 80 mM de solución tampón de fosfato de sodio, pH 7,4, 50 μM EDTA.
  4. Prepare un stock de reactivos utilizados para actividades enzimáticas a pH 7,2 como se describe a continuación: 25 mM de NADH (recién preparado para cada ensayo), 2 M de succinato de sodio, 4 mM de citocromo c (recién preparado para cada ensayo), 200 μM de rotenona, 0,5 mM de KCN, 6 mM de 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP), 100 mM de metosulfato de fenazina (PMS) y 60 mM de ferricianuro de potasio.
    NOTA: Para todos los experimentos y preparación de reactivos se utilizó agua ultrapura con una resistividad de 18,2 MΩ·cm a 25 °C. Esta agua se generó utilizando un sistema de purificación Milli-Q, lo que garantiza la eliminación de contaminantes orgánicos, inorgánicos y microbianos a niveles por debajo de los límites detectables, lo que la hace adecuada para aplicaciones bioquímicas y de biología molecular de alta sensibilidad.

2. Disección hepática, homogeneización y aislamiento de mitocondrias a partir de hígado de rata

  1. Antes de comenzar, coloque todos los materiales y tampones en hielo, asegurándose de que todos los materiales estén helados durante todo el ensayo para evitar daños mitocondriales.
  2. Coloque 10 ml de tampón de aislamiento de mitocondrias en un tubo cónico helado.
  3. Eutanasia de la rata Wistar macho mediante decapitación cervical, evitando el uso de CO2 que puede interferir con los ensayos de respiración. Para ello, el Comité de Ética en la Investigación Científica de la Universidad Industrial de Santander (CEINCI) aprobó los métodos en la resolución 13 de 2022.
    NOTA: Las ratas no deben pesar más de 170 g; La grasa también puede afectar a los análisis de la respiración.
  4. Haga una incisión (aprox. 4-5 cm) con un bisturí estéril a través de la sección abdominal de la rata.
  5. Diseccionar el hígado por completo una vez que el área abdominal sea visible. El hígado de rata es un órgano multilobulado, de color rojo oscuro de aproximadamente 10 cm x 5 cm.
  6. Coloque con cuidado el hígado dentro del tampón de aislamiento helado y enjuague dos veces con este medio.
  7. Picar finamente el hígado (tamaño inferior a 1 cm) con unas tijeras afiladas en una placa de Petri con 10 mL de medio de aislamiento.
  8. Coloque la solución en el tubo homogeneizador de tejidos Potter Elvehjem y homogeneice cuidadosamente al menos diez veces, a baja velocidad (~390 rpm).
  9. Transfiera la solución a un tubo cónico y centrifuga a 600 x g durante 10 min a 4 °C.
  10. Después de la centrifugación, vierta con cuidado el sobrenadante en un nuevo tubo cónico. Deseche el pellet con parte del tejido, la sangre y los componentes celulares intactos.
  11. Llene el tubo con más tampón de aislamiento (~35 mL) y centrifugue a 6000 x g durante 10 min a 4 °C.
  12. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet (mitocondrias) en un nuevo tampón de aislamiento sin BSA.
    NOTA: Para la resuspensión mitocondrial, se recomienda utilizar un cepillo suave.
  13. A continuación, centrifugar a 7000 x g durante 10 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender las mitocondrias aisladas en 2 mL de tampón de aislamiento sin BSA.
  14. Determinar la concentración de proteínas utilizando el método de Bradford o similar14.

3. Colonia de Aedes aegypti y homogeneización de larvas.

NOTA: Para este procedimiento, la colonia de Ae. aegypti se mantuvo dentro de jaulas de cría (40 cm × 40 cm × 40 cm) bajo condiciones de insectario como humedad (70% ± 5%), fotoperiodo (12:12) y temperatura (27 ± 5 °C). Los huevos se recogieron en papel de filtro.

  1. Asegúrese de que los huevos eclosionen en bandejas con agua filtrada y declorada una semana antes del experimento. Identificar el estadio por el proceso de muda en el ciclo de las larvas. Observe cada proceso de muda para verificar su estado L1, L2 y L3. Cuando la larva entre en L3, espere un máximo de 12 h para recoger el material.
  2. Recoja al menos 100 larvas de Ae. aegypti en el estadio L3-L4 en agua libre de cloro (~30 mL de agua). Tome las larvas con una pipeta Pasteur.
  3. Filtre las larvas con papel de filtro, enjuague las larvas recolectadas y vuelva a suspenderlas en el tampón de homogeneización de Aedes aegypti (~2 mL).
  4. Transfiera la solución con larvas al tubo homogeneizador de tejidos Potter Elvehjem y homogeneice cuidadosamente al menos diez veces a ~ 390 rpm.
  5. Transfiera el tejido homogeneizado y fíltrelo a través de una jeringa de lana de vidrio para eliminar los residuos grandes del exoesqueleto.
  6. Determinar la concentración de proteínas mediante el método de Bradford o similar15.
    NOTA: No es necesario aislar las mitocondrias de las larvas de mosquitos; Es posible evaluar el efecto de los xenobióticos utilizando el extracto proteico obtenido en este paso.

4. Determinación de los efectos de los xenobióticos en la cadena de transporte de electrones mitocondrial

NOTA: Este protocolo fue diseñado para evaluar el efecto de los xenobióticos sobre la bioenergética mitocondrial en mitocondrias aisladas de hígado de rata y tejido de insecto homogeneizado.

Los ensayos se dividen en dos: polarográficos (NADH y Succinato oxidasa) y espectrofotométricos (NADH deshidrogenasa - complejo I, succinato deshidrogenasa - complejo II, citocromo c reductasa - complejo III y citocromo c oxidasa - complejo IV).

  1. Ensayos polarográficos: Para ello, utilice la respirometría de alta resolución para medir la oxidación completa de NADH y succinato por el consumo deO2 , e informe los resultados como NADH y succinato oxidasa.
    1. Calibre el instrumento todos los días antes de comenzar los ensayos. Este paso puede variar en función del oxígrafo utilizado. Siga las instrucciones del fabricante.
      1. Para la calibración de Oroboros, agregue medio de reacción en las cámaras con un exceso de al menos 0,2 mL por encima del volumen de la cámara experimental (2 mL), para llenar la cámara y el capilar de inyección con medio.
    2. Encienda los agitadores después de la adición de medio.
    3. Espere hasta que la señal de concentración de oxígeno se estabilice y regístrese.
    4. Para una calibración de oxígeno cero, agregue mitocondrias, suspensiones celulares, levadura de panadería o ditionita (se recomienda levadura de panadería) que permitan el agotamiento de oxígeno y regístrese. Espere a que la señal alcance los niveles de fondo (normalmente ± 2 pmol/mL/s para el sistema O2k).
    5. Realizar actividades de NADH y succinato oxidasa monitorizando el consumo de oxígeno al añadir tampón de reacción, 0,1 mg de proteína (mitocondrial o larvaria homogeneizada) y el sustrato (0,17 mM de NADH o 10 mM de succinato de sodio) a la cámara.
    6. Utilice inhibidores de proteínas transportadoras de electrones para confirmar que el consumo de oxígeno observado se debe a la cadena respiratoria mitocondrial. Los más comunes son la rotenona 1 μM y la KCN 1mM16. En la celda del oxígrafo, agregue los reactivos de acuerdo con la Tabla 1 (la secuencia es importante).
  2. Ensayos espectrofotométricos
    NOTA: Para evaluar el transporte de electrones a través de los complejos mitocondriales, se realizaron ensayos enzimáticos y se midieron utilizando un espectrofotómetro y aceptores de electrones artificiales como PMS, DCPIP y citocromo c. Se recomienda medir una enzima por día. Prepare los tampones y los reactivos al menos un día antes de los ensayos. Algunos compuestos son fotosensibles; ver Tabla 2 para obtener más recomendaciones.
    1. Para la actividad de la NADH deshidrogenasa, los sistemas de reacción contienen 50 mM de solución tampón de fosfato pH 7,4, 2 mM de EDTA, 0,1 mg/mL de proteína mitocondrial, 1 μM de rotenona y 1 mM de KCN. En la celda del espectrofotómetro, agregue los reactivos de acuerdo con la Tabla 2 (la secuencia es importante)17. Los pasos recomendados son los siguientes:
      1. Prepare 100 mL de fosfato tampón mezclado con el EDTA y compruebe que el pH no cambie. Mantenga el tampón en el refrigerador, pero es obligatorio mantenerlo a temperatura ambiente (RT; aproximadamente 25 °C) durante los ensayos.
      2. Prepare soluciones madre frescas de rotenona, KCN, NADH y ferricianuro de potasio (estables hasta 4 h). El volumen sugerido es de 1 mL de soluciones concentradas (ver la primera columna de la tabla).
      3. Si el compuesto probado tiene baja solubilidad en agua, incluya un control adicional para la actividad enzimática en el diseño experimental utilizando solo el solvente del compuesto.
      4. En primer lugar, se monitoriza la actividad de la NADH deshidrogenasa mediante la reducción del ferricianuro de potasio a 420 nm. Calcular su concentración por su coeficiente de extinción molar de 1.04 mM-1·cm-1. El espectrofotómetro tiene una opción para calcular la actividad máxima en una reacción; Consulte el manual de usuario. Posteriormente, divida la actividad reportada por la concentración de proteína utilizada para obtener la actividad específica de la enzima.
    2. Evaluar la actividad de la succinato deshidrogenasa mediante la adición de 20 mM de succinato de sodio y 1 mM de metosulfato de fenazina (PMS) con 60 μM de 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP) como aceptores de electrones artificiales. En la celda del espectrofotómetro, agregue los reactivos de acuerdo con la Tabla 3 (la secuencia es importante)17. Las recomendaciones son las siguientes:
      1. Prepare el mismo tampón que se utiliza para la NADH deshidrogenasa. Manténgalo en las mismas condiciones.
      2. Prepare soluciones madre frescas de Succinato, PMS y DCPIP. El volumen sugerido es de 1 mL de soluciones concentradas. Prepare las soluciones de PMS y DCPIP el mismo día del ensayo.
      3. Si el compuesto probado tiene baja solubilidad en agua, incluya un control adicional para la actividad enzimática en el diseño experimental.
      4. Monitorizar la oxidación del succinato por la reducción de DCPIP a 600 nm. Calcular su concentración por su coeficiente de extinción molar de 21.0 mM−1·cm−1, aplicando la ley de Beer. Posteriormente, divida la actividad reportada por la concentración de proteína utilizada para obtener la actividad específica de la enzima.
    3. Mida la actividad de la citocromo c reductasa (complejo III) utilizando NADH o succinato como sustratos oxidables. Con esta enzima, el transporte de electrones del complejo I (usando NADH) o del complejo II (usando succinato) pasa a la ubiquinona y luego al complejo III, que pasa los electrones al citocromo c. A esta reacción le sigue la reducción del citocromo c. Prepare el sistema de reacción que contenga 50 mM de solución tampón de fosfato pH 7,4, 2 mM de EDTA, 0,1 mg de proteína mitocondrial, 50 μM de NADH y 0,1 mM de KCN. En la celda del espectrofotómetro, agregue los reactivos de acuerdo con la Tabla 4 (la secuencia es importante)18. Las recomendaciones son las siguientes:
      1. Prepare el mismo tampón que se utiliza para la NADH deshidrogenasa. Manténgalo en las mismas condiciones.
      2. Utilice el mismo NADH y KCN de la NADH deshidrogenasa.
      3. Si el compuesto probado tiene baja solubilidad en agua, incluya un control adicional para la actividad enzimática en el diseño experimental.
      4. Monitorizar la reducción del citocromo c a 550 nm y calcular su concentración por su coeficiente de extinción molar de 19,8 mM−1·cm−1, aplicando la ley de Beer. Posteriormente, divida la actividad reportada por la concentración de proteína utilizada para obtener la actividad específica de la enzima.
    4. Mida la citocromo c oxidasa (complejo IV) expresada como actividad de la citocromo c oxidasa. Para ello, prepare una reacción del sistema que contenga 50 mM de solución tampón de fosfato, pH 7,4, 2 mM de EDTA y 0,1 mg de proteína mitocondrial (Tabla 5). Para estos ensayos enzimáticos, reduzca el citocromo c mezclando cantidades equimolares de citocromo c y ditionito de sodio, asegurando la reducción completa del citocromo c.
    5. A continuación, pase la mezcla resultante a través de una columna de gel de dextrano reticulado utilizando la misma solución tamponada con fosfato que la fase móvil. Posteriormente, cuantificar las fracciones colectadas utilizando un espectrofotómetro a 550 nm19. Las recomendaciones son las siguientes:
      1. Utilice el mismo tampón que se utiliza para la NADH deshidrogenasa. Manténgalo en las mismas condiciones.
      2. Si el compuesto probado tiene baja solubilidad en agua, se debe incluir un control adicional de la actividad enzimática en el diseño experimental.
      3. Monitorizar la oxidación del citocromo c a 550 nm y calcular su concentración por su coeficiente de extinción molar de 19,8 mM−1·cm−1, aplicando la ley de Beer. Posteriormente, divida la actividad reportada por la concentración de proteína utilizada para obtener la actividad específica de la enzima.
        NOTA: Se incluye como Archivo Suplementario 1 un archivo de hoja de cálculo que muestra el proceso de cálculo de la actividad específica de las enzimas, medida por el consumo de oxígeno y la espectrofotometría.

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Resultados

Antes de analizar los resultados obtenidos con este protocolo, es fundamental recordar un poco sobre la bioquímica de la cadena de transporte de electrones en las mitocondrias. En primer lugar, el NADH suministra un par de electrones a los centros de oxidorreducción ubicados en el complejo I. Allí comienza el transporte de electrones que pasan del complejo I a la ubiquinona, posteriormente al complejo III, que los dona al citocromo c, y finalmente al complejo IV, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones, reduci...

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Discusión

Se empleó un método espectrofotométrico y polarográfico conO2 de alta resolución para investigar los efectos de los xenobióticos sobre la función mitocondrial. El estudio evaluó específicamente el impacto del aceite esencial y el carvacrol de Cymbopogon flexuosus en la oxidación de NADH y succinato, así como en el transporte de electrones a través de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, utilizando dos modelos biológicos diferentes: mitocondrias aisladas...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE de la Universidad Industrial de Santander por financiar la beca número 3739 correspondiente al proyecto "Formulación de un ixodicida e ixorepelente diseñado en laboratorio y validado en campo para prevenir la infestación de garrapatas en el ganado".

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2,6-diclorofenofenolMerck 119814Prepare el mismo día de su uso.
Reactivo BradfordMerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Citocromo cMerckC2506Conver fotosensible cúbralo con papel de aluminio. En solución, debe almacenarse en el congelador.
D-manitolMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Ácido etilendiaminotetraacético sal tetrasódica dihidratadaMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178En solución funciona bien durante 2 semanas.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC MicroplatePhotometer Thermo Scientific 
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Metosulfato de fenazina MerckP9625Preparar el mismo día de su uso.
Ferricianuro de potasio Merck244023Prepare el mismo día de su uso.
Potter Elvehjem tubo
RotenonaMerck557368Soluble en etanol. Convertidor fotosensible cúbrelo con papel de aluminio. En solución, debe almacenarse en el congelador.
Succinato de sodioMerckS9637En solución debe almacenarse en el congelador.
SacarosaMerckS0389
β-Nicotinamida adenina dinucleótido, reducido Hidrato de sal disódicaMerckN8129Fotosensible conver cúbralo con papel de aluminio. En solución, debe almacenarse en el congelador.
51119100homogeneizador de tejidos

Referencias

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