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Muestreo de daño en la retina de rata inducido por N-metil-N-nitrosourea y evaluación multiíndice de cambios patológicos

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DOI:

10.3791/67159

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13 de septiembre de 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, School of Pharmacy, Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras de retina en ratas y la utilización de la tinción con hematoxilina-eosina, el ensayo TUNEL y el Western blot para detectar cambios patológicos y apoptosis en la retina después de la inyección intraperitoneal de N-metil-N-nitrosourea.

Resumen

La retinopatía se puede observar en la mayoría de las enfermedades oculares y las complicaciones tardías de la diabetes mellitus. El daño y la degeneración de las células epiteliales pigmentarias específicas y las células ópticas son las principales características de la retinopatía. Muchas medicinas tradicionales han demostrado una eficacia clínica sustancial en el tratamiento de la retinopatía. Cómo obtener una retina de forma rápida y completa es un paso clave en la investigación de la medicina tradicional para el tratamiento de la retinopatía. En este estudio, nuestro objetivo es proporcionar un procedimiento estandarizado y ejercitable para la toma de muestras del daño en la retina de rata inducido por N-metil-N-nitrosourea (MNU) y la evaluación multiíndice de los cambios patológicos. A las ratas se les inyectó por vía intraperitoneal 60 mg/kg de MNU una vez para inducir daño en la retina, y se obtuvieron muestras de retina después de 7 días. Además, realizamos una tinción de hematoxilina-eosina para evaluar los cambios patológicos de la retina. Determinación de la tasa de apoptosis y de la proteína de apoptosis por TUNEL y Western blot. Estos protocolos estandarizados para la toma de muestras de retina y la evaluación de cambios patológicos son útiles para promover la exploración del mecanismo de la retinopatía y el descubrimiento de hierbas tradicionales novedosas y efectivas.

Introducción

La retinosis pigmentaria (RP) es una enfermedad hereditaria y cegadorade la retina 1. La incidencia de RP es de entre 1/3500 y 1/5000, afectando a la función visual de unos 2,5 millones de personas en el mundo. Es una de las enfermedades más conocidas que conducen a la discapacidad visual en los seres humanos, imponiendo una carga significativa a toda la sociedad2. La enfermedad se caracteriza por la pérdida gradual de la función de las células epiteliales pigmentarias de la retina y la apoptosis progresiva de los fotorreceptores. En la etapa inicial, los pacientes experimentan ceguera nocturna, que se manifiesta como defectos del campo visual periférico y, finalmente, conduce a la pérdida de la visión central3. Por lo tanto, la inhibición de la apoptosis de los fotorreceptores de la retina es el punto de referencia para la prevención y el tratamiento de la RP.

La apoptosis de las células de la retina es una característica común de la RP humana y de los animales modelo4. La inyección intraperitoneal de 60 mg/kg de N-metil-N-nitrosourea (MNU) en ratas durante 7 días puede inducir apoptosis y pérdida de células fotorreceptoras de la retina, y es un modelo animal de RP 5,6 comúnmente utilizado. El análisis de los cambios en la estructura patológica, la apoptosis celular específica y la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis del tejido de la retina en animales modelo puede proporcionar datos experimentales efectivos y apoyo teórico en el estudio de la patogénesis de la RP humana y los fármacos de cribado 7,8. Por lo tanto, la calidad de los especímenes de retina determina la fiabilidad de los datos experimentales. Sin embargo, debido a la particularidad del tejido ocular, existen muy pocos reportes sobre cómo obtener la retina de rata9.

Este documento proporciona un procedimiento simple, rápido, estandarizado y operable para el muestreo de retina en ratas para superar las deficiencias anteriores. La tinción con hematoxilina-eosina (HE), la tinción con desoxinucleotidil transferasa terminal mediada por desoxinucleotidil transferasa desoxiuridina trifosfato-digoxigenina (TUNEL) y Western blot se utilizan para analizar los cambios patológicos en el daño tisular de la retina y la apoptosis en las ratas. Todos los métodos se derivan de la experiencia de nuestro grupo de investigación con los procesos operativos específicos.

Protocolo

Todos los protocolos y procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Ningxia (Número de ética: NO. 2020-Q066). Se compraron ratas macho SPF Sprauge-Dawley (SD), de 7-8 semanas de edad y con un peso de 200-220 g, de la Universidad Médica de Ningxia con el número de licencia animal SCXK (Ning) 2020-0001. Todos los animales fueron criados en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Ningxia. La temperatura y la humedad eran adecuadas, el ciclo de luz día-noche se mantenía y la comida y el agua eran gratuitos y suficientes.

1. Preparación preoperatoria

  1. Preparación de materiales
    1. Prepare placas para ratas, dispositivos de anestesia inhalatoria, cajas incrustadas, tubos de almacenamiento congelados, guantes y mascarillas quirúrgicas desechables, botellas de boca ancha, paraformaldehído al 4%, bolsas de hielo, tijeras oftálmicas, pinzas oftálmicas, cuchillas quirúrgicas y mangos de cuchillos, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y esterilícelos con anticipación (consulte la tabla de materiales).
  2. Preparación animal
    1. Divida aleatoriamente 20 ratas SD macho en un grupo modelo (n = 10) y un grupo de control (n = 10). Inyectar a las ratas modelo por vía intraperitoneal 60 mg/kg de MNU e inyectar a las ratas de control por vía intraperitoneal el mismo volumen de solución salina.
    2. Después de 7 días de la inyección, ayune las ratas y déjelas beber libremente la noche anterior a la toma de muestras.
    3. Al día siguiente, coloque la rata en decúbito supino en la mesa de operaciones y use una máscara para administrar la anestesia con isoflurano al 4% y oxígeno 2 L/min. Mida la profundidad de la anestesia pellizcando el centro del pie para observar las reacciones de las ratas.

2. Toma de muestras de retina para la detección de factores proteicos

  1. Fije la cuenca del ojo de la rata con la mano izquierda y retire el ojo con fuerza moderada con la mano derecha utilizando una pinza de flexión oftálmica. Coloque el globo ocular en posición sagital en un plato de vidrio frío.
  2. Con la mano izquierda sosteniendo pinzas rectas oftálmicas para fijar el globo ocular y la mano derecha sosteniendo la cuchilla quirúrgica, haga una incisión longitudinal de 2 mm cerca del sitio de la lente.
  3. Corte la córnea con las tijeras oftálmicas a lo largo de la incisión y retire suavemente el cristalino, el vítreo y exponga la copa del ojo.
  4. Coloque la parte inferior del ocular en la punta del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, gire el ocular sobre el tubo y exponga la retina (la retina es de color amarillo tenue).
  5. Extraiga toda la retina a lo largo de la pared escleral del globo ocular con pinzas oftálmicas de flexión, luego colóquela en un tubo congelado y guárdela en un tanque de nitrógeno líquido para uso futuro (Figura 1).

3. Toma de muestras de retina para examen anatomopatológico y tinción de células específicas

  1. Con la mano izquierda, usa las pinzas para levantar el rabillo del ojo de la rata. Con la mano derecha, use una cuchilla quirúrgica para cortar una abertura de 4 mm a lo largo de la esquina del ojo de la rata.
  2. Use las pinzas para sujetar el borde del globo ocular en la abertura de la mano izquierda. Use tijeras oftálmicas para cortar los tejidos circundantes a lo largo del borde del globo ocular mientras presta atención a la limpieza de los tejidos circundantes del globo ocular.
  3. Separe los tejidos alrededor del nervio óptico en el polo posterior del globo ocular con pinzas para los ojos, corte el nervio óptico y preste atención a preservarlo. A continuación, retira el globo ocular.
  4. Lave el globo ocular extraído con solución salina para eliminar la sangre restante, enróllelo sobre papel de filtro para absorber el exceso de agua y colóquelo sobre papel de aluminio frío.
  5. Fijar el ojo con pinzas oftálmicas. Realice una incisión longitudinal de 4 mm a lo largo de la unión de la córnea y la retina con una cuchilla quirúrgica.
  6. Retire la córnea con unas tijeras oftálmicas, haga un corte circular a lo largo de la incisión y retire suavemente el cristalino y el cuerpo vítreo.
  7. Coloque el ocular restante con un nervio óptico en una caja de inclusión y fíjelo en paraformaldehído al 4%.
  8. Incrustar muestras fijadas con paraformaldehído en parafina y cortar en rodajas de 4 μm para la tinción HE y la tinción TUNEL7.

4. Tinción de HE en retina de rata

  1. Desparafinado e hidratación: Coloque las rodajas en xileno durante 10 minutos, repita el proceso durante otros 10 minutos, seguido de etanol absoluto durante 5 minutos, repita el tratamiento con etanol durante otros 5 minutos, seguido de un tratamiento con alcohol al 95% durante 5 minutos, luego con alcohol al 85% durante 5 minutos y finalmente con alcohol al 75% durante 5 minutos.
  2. Tinción con hematoxilina: Enjuague la rodaja con agua desionizada durante 5 min. Utilice 100 μL de solución de tinción de hematoxilina y tinte durante 5 minutos, enjuague con agua desionizada durante 5-10 s. Añadir 100 μL de etanol de ácido clorhídrico al 1% durante 30 s, enjuagar con agua desionizada durante 20 min y añadir 100 μL de agua amoniacal al 0,2% durante 1 min. Enjuague con agua desionizada durante 5 min.
  3. Tinción con eosina: Utilice 100 μL de solución de tinción con eosina para teñir durante 5 min y enjuague con agua desionizada durante 30 s.
  4. Deshidratación y sellado: Sumerja las rodajas en alcohol al 70% durante 5 minutos, luego al 85% de alcohol durante 5 minutos, seguido de alcohol al 90% durante 5 minutos y etanol absoluto durante 5 minutos. Repita el tratamiento con etanol absoluto durante otros 5 minutos, luego sumérjalo en xileno durante 5 minutos y repita el proceso durante otros 5 minutos. Por último, selle añadiendo aproximadamente 100 μL de resina neutra a la superficie de las lonchas y luego cúbralo con un cubreobjetos.
  5. Obtención de imágenes de los portaobjetos: Coloque las rodajas teñidas en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio hasta que la imagen sea claramente visible, ajuste el aumento a 400x y capture la imagen.
  6. Mida el grosor total de la retina y el grosor externo de la retina: Mida el grosor total de la retina y el grosor externo de la retina (espesor de la capa nuclear externa y la capa fotorreceptora) y calcule el porcentaje de espesor de la retina externa
    Espesor de la retina externa (%) = (espesor de la retina externa/espesor total de la retina) x 100.

5. Determinación de la tasa de apoptosis de las células fotorreceptoras de la retina con el método TUNEL

  1. Desparafinado e hidratación: Coloque las rodajas en xileno durante 10 minutos, repita el proceso durante otros 10 minutos, luego colóquelas en etanol absoluto durante 5 minutos y repita este paso durante otros 5 minutos. Realice la deshidratación colocando alcohol al 95% durante 5 minutos, alcohol al 90% durante 5 minutos, alcohol al 80% durante 5 minutos, alcohol al 70% durante 5 minutos y enjuague con agua desionizada durante 5 minutos.
  2. Enjuague con solución de cloruro de sodio al 0,85% durante 5 min y PBS durante 5 min. Fijar con paraformaldehído usando paraformaldehído al 4% durante 15 min. Enjuague con PBS durante 5 minutos y repita el proceso durante otros 5 minutos.
  3. Incubación y equilibrio7: Incubar con 20 μg/mL de proteinasa K solución para digestión durante 15 min, equilibrar en el tampón de equilibrio durante 10 min e incubar con tampón de desoxinucleotidiltransferasa terminal recombinante (rTdT) a 37 °C durante 60 min.
  4. Reacción de parada: Añadir 100 μL de la solución de citrato estándar (2x solución de SSC) durante 15 min. Enjuague con PBS durante 5 minutos y repita el proceso durante otros 5 minutos.
  5. Colorante nuclear: Agregue 100 μL 4 ', reactivo de 6-diamidina-2-fenindl (DAPI) durante 5 min. Lavar con agua desionizada durante 5 minutos y repetir el proceso durante otros 5 minutos.
  6. Sellado: Limpie el exceso de xileno alrededor de las rodajas y selle agregando aproximadamente 100 μL de resina neutra a la superficie de las rodajas, y luego cúbralo con un cubreobjetos.
  7. Microscopía: Coloque las rodajas teñidas en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para una visibilidad clara, establezca el aumento en 400x y capture la imagen. Observe la fluorescencia verde a 520 ± 20 nm utilizando un filtro de fluorescencia estándar. Observe el DAPI azul a 460 nm.
  8. Calcule la tasa de apoptosis: mida los valores de fluorescencia verde y los valores de fluorescencia azul de la capa externa del núcleo de la retina. Calcule la tasa de apoptosis como
    Tasa de células de apoptosis = valor de fluorescencia verde/valor de fluorescencia azul x 100.

6. Análisis de Western blot 10

  1. Tratamiento con tampón de lisis: Picar y homogeneizar una retina congelada con 50 μL de tampón de lisis en frío (1 mL de tampón de lisis que contiene 5 μL de inhibidor de la fosfatasa, 1 μL de inhibidor de la proteasa y 5 μL de 100 mM de PMSF).
  2. Sujeto a una sonicación de 28 kHz durante 5 s en un baño de hielo; Repita 3 veces. Centrifugar a 4 °C durante 5 min a 10.000 x g para eliminar los residuos celulares. Conserva el sobrenadante.
  3. em>6.3Cuantificación de proteínas: Determine la concentración de proteínas utilizando un kit de reactivos de ensayo de proteínas BCA.
  4. em>6.4Electroforesis: Cargue una muestra de proteína de 50 μg y sepárela en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio al 12% (SDS-PAGE).
  5. Transferencia a membrana: Transferencia electroforética a membranas de PVDF mediante un sistema de transferencia electroforética.
  6. Subdividir membranas: Subdividir las membranas y analizar cada proteína de interés, β-actina y GAPDH de una sola transferencia.
  7. Bloqueo: Bloquear las membranas durante 1 h en TBST que contenga un 5% de leche descremada a temperatura ambiente.
  8. Incubar el anticuerpo primario: Incubar con el anticuerpo primario de caspasa-9 escindida (dilución 1:200), caspasa-3 escindida (dilución 1:200), caspasa-7 escindida (dilución 1:200) y β-actina (dilución 1:1000) durante la noche a 4 °C. Lave las membranas con TBST durante 5 minutos, repita 3 veces.
  9. Incubar el segundo anticuerpo: Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:2000) durante 2 h a temperatura ambiente. Lave las membranas con TBST durante 5 minutos, repita 3 veces.
  10. Exposición: Visualice las proteínas marcadas utilizando el sustrato Western blot y, por último, exponga las membranas para visualizar las bandas de proteínas en un modo de exposición automático.
  11. Calcule el contenido de proteína7 midiendo la densidad de bandas de proteína.

7. Análisis estadístico

  1. Analice los datos con el software SPSS 19.0 y preséntelos como la media ± la desviación estándar. Realice análisis estadísticos de los valores observados utilizando el análisis de varianza unidireccional. Tome p< 0.05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Después de la tinción de HE, todas las capas de la retina de las ratas en el grupo de control tenían una estructura de tejido clara, una disposición ordenada de las células y una tinción uniforme, mientras que la estructura de la retina de las ratas en el grupo modelo estaba significativamente dañada, la capa externa de la retina era más delgada, la capa nuclear externa estaba casi completamente integrada con la capa central interna, la disposición de las células en la capa era extremadamente desordenada, El número de capas celulares se redujo significativamente y el grosor de la capa celular fotosensible y la capa nuclear externa fue significativamente más delgado. El grosor de la capa retiniana externa en el grupo control y en el grupo modelo fue de 48% y 23%, respectivamente (p < 0,01; Figura 2).

El método TUNEL mostró que no se detectaron células apoptóticas en el grupo control, pero sí algunas células apoptóticas en la capa nuclear externa de las ratas del grupo modelo (p < 0,01), y la relación TUNEL-positivo fue del 9,6% (Figura 3).

La familia de proteínas caspasas es una de las principales familias que ejecutan la apoptosis. Entre ellos, la caspasa 3 escindida, la caspasa 7 escindida y la caspasa 9 escindida son indicadores clásicos utilizados para evaluar la apoptosis celular7. Los resultados del Western blot mostraron que, en comparación con el grupo control, la expresión de caspasa 3 escindida, caspasa 7 escindida y caspasa 9 escindida en la retina del grupo modelo aumentó significativamente (p<0,01; Figura 4). Esto indicó que la MNU puede causar claramente la apoptosis celular en la retina.

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Figura 1: El flujo de trabajo experimental. Después de la inyección intraperitoneal de MNU durante 7 días (7d), se obtuvo la retina de ratas anestesiadas para la tinción de HE y TUNEL. Abreviaturas: MNU = N-metil-N-nitrosourea; HE = hematoxilina-eosina; TUNEL = deoxiuridina trifosfato-digoxigenina mediada por desoxinucleotidil transferasa terminal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes representativas de tinción histopatológica de HE en el día 7 después de la inyección de MNU. (A) Tinción de HE a los 7 días (7d) después de la administración de MNU. (B) Relación retiniana externa. Los datos se presentan como media ± DE (n=6). El análisis estadístico de los valores observados se realizó mediante el análisis de varianza unidireccional. ** P < 0,01 vs control. Abreviaturas: GCL = capa de células ganglionares; IPL = capa plexiforme interna; INL = la capa del kernel; OPL = capa plexiforme externa; ONL = capa nuclear externa; PRL = capa fotorreceptora; MNU = N-metil-N-nitrosourea; HE = hematoxilina-eosina. n = 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: El ensayo TUNEL muestra la apoptosis de los fotorreceptores inducida por MNU en ratas. (A) A los 7 días (7d) después de la inyección de MNU, se presentaron células TUNEL-positivas (verde) en la ONL en ratas tratadas con MNU. (B) Relación TUNEL-positiva. Los datos se presentan como media ± DE (n=6). El análisis estadístico de los valores observados se realizó mediante el análisis de varianza unidireccional. ** P < 0,01 vs control. Abreviaturas: GCL = capa de células ganglionares; IPL = capa plexiforme interna; INL = la capa del kernel; OPL = capa plexiforme externa; ONL = capa nuclear externa; PRL = capa fotorreceptora; MNU = N-metil-N-nitrosourea; TUNEL = deoxiuridina trifosfato-digoxigenina mediada por desoxinucleotidil transferasa terminal. n = 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Expresión de caspasa 3 escindida, caspasa 7 escindida y caspasa 9 escindida en retinas de rata el día 7 después de la inyección de MNU. (A) Datos representativos de la expresión de caspasa escindida. (B) Proporción de caspasa escindida 3/β-actina. (C) Proporción de caspasa escindida 7/β-actina. (D) Proporción de caspasa escindida 9/β-actina. Los datos se presentan como media ± DE (n=6). El análisis estadístico de los valores observados se realizó mediante el análisis de varianza unidireccional. ** P < 0,01 vs control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La RP es una enfermedad de la retina común en las clínicas. El inicio, la gravedad y la progresión de la RP están relacionados con los genes y los modos genéticos y se ven afectados por el medio ambiente 8,11. La RP incluye la RP familiar y la RP ocasional, de las cuales la RP familiar representa alrededor del 60% de los pacientes. A través del rastreo de los antecedentes genéticos familiares, hasta el momento se han identificado 83 genes relacionados con la RP, mientras que la RP ocasional representa alrededor del 40%, lo que significa que este tipo de pacientes carece de antecedentes familiares y tiene un patrón genético irregular2. A pesar de que la apoptosis de las células fotorreceptoras de la retina, que causa la pérdida de la función visual en los pacientes con RP, es un reconocimiento general, el mecanismo subyacente de la muerte de los fotorreceptores en la RP sigue siendo poco claro 12,13,14. Debido al acceso limitado al tejido retiniano humano, que se obtiene principalmente durante la vitrectomía, la extracción de tejido retiniano de animales modelo sigue siendo un método común en la investigación básica de la PR14,15.

La retina es una membrana transparente situada en la capa interna del bulbo del ojo, con la cavidad vítrea en el interior y la membrana coroidea cerca del exterior. La retina comienza desde el borde dentado en la parte delantera y termina en el disco óptico en la parte posterior. Es la parte inicial de la formación de la visión16. Las muestras de retina de animales modelo se utilizan principalmente para el análisis de PCR de retina, la detección de Western blot, la observación de la estructura patológica del tejido, la tinción inmunohistoquímica, el examen de inmunofluorescencia, la evaluación de la densidad microvascular, el aislamiento celular y el cultivo, etc.17,18. Los requisitos de la toma de muestras de retina para diferentes índices de prueba son diferentes. El muestreo de retina para la detección de factores proteicos en animales modelo y el muestreo de retina para secciones incluidas en parafina son técnicas operativas comunes para el cribado de fármacos para RP8. Sin embargo, debido a la estructura muy fina y compleja del globo ocular del animal modelo, el proceso de eliminación de los tejidos interferentes en el ojo y la obtención de muestras de retina es complicado. Durante el proceso de muestreo, puede haber pérdida de tejido de la retina, contaminación, degradación de proteínas y desprendimiento de retina. Estos factores tendrán un impacto en la calidad y cantidad de la extracción de proteínas de la retina, así como en el efecto de la tinción de secciones y en los resultados de detección de indicadores experimentales. Por lo tanto, se necesita un procedimiento adecuado de muestreo de retina.

Es fundamental simplificar lo complejo y comprender el eslabón clave de la recolección para mejorar la técnica de recolección de retina en animales modelo. La exposición rápida de la retina y la extirpación completa de la retina en la medida de lo posible son los pasos clave del muestreo de retina para la detección del factor proteico en ratas modelo. En este estudio, los globos oculares se extrajeron directamente después de la anestesia para ahorrar tiempo de muestreo. Un truco para exponer la retina es girar el ocular sobre un tubo de 1,5 ml, que era rentable y práctico y podía despegar completamente la retina de la pared escleral. Este procedimiento de operación es simple, rápido, ahorra costos y conduce a la práctica experimental de operación de personal, por lo que se puede completar en 5 minutos. En el proceso de muestreo de retina para el examen patológico y la tinción de células específicas, mantener la frescura y la integridad estructural de la retina es un paso clave para obtener una tinción de alta calidad. La perfusión con formaldehído de la aurícula izquierda y luego obtener la retina es uno de los métodos que los investigadores utilizan a menudo, pero requiere mucho tiempo y el formaldehído huele mal y causa molestias al operador19. En este estudio, el tejido alrededor del globo ocular se separa en un anillo después de la anestesia para mantener su integridad. Después de que el nervio óptico haya sido cortado y retenido, separe el tejido que lo rodea en el polo posterior del globo ocular y retire el globo ocular. Diferentes partes del globo ocular se ubicaron con precisión con el nervio óptico. Finalmente, con el apoyo del contenido del ojo, se realizó la incisión, se cortó la córnea en un anillo, se despegaron el cristalino y el vítreo, y se obtuvo la copa ocular que conecta el nervio óptico (la retina se encuentra en la pared escleral dentro de la copa ocular). En este proceso, la operación debe ser suave para mantener la integridad de la retina. El procedimiento de operación no solo mejora en gran medida la velocidad de recolección de materiales, sino que también puede mantener la estructura y la forma normales completas del globo ocular y se puede ubicar con precisión en las diferentes partes del globo ocular después de sacarlo. Después de una operación hábil, la operación se puede completar en 8 minutos. Mediante el uso de los métodos de muestreo de retina anteriores, nuestro grupo de investigación obtuvo resultados relativamente ideales de detección de factores proteicos, resultados de tinción HE y resultados de tinción TUNEL.

Aunque el método actual de muestreo de retina tiene algunas ventajas, aún debe mejorarse. En el proceso de muestreo de retina para la detección de factores proteicos, después de exponer la retina, también existe el riesgo de disección incompleta de la retina o pérdida al tomar la retina con pinzas dobladas debido al punto de apoyo limitado de las pinzas dobladas. Por lo tanto, es necesario mejorar las herramientas para la disección de la retina. Por otro lado, en el proceso de extracción de retina para el examen patológico y la tinción de células específicas, después de aislar el globo ocular, durante el proceso de extracción del cristalino y el vítreo, la pared del globo ocular colapsará debido a la pérdida de soporte del ojo, lo que es fácil de causar la extracción de retina. Por lo tanto, la operación debe ser rápida, suave y de la fuerza adecuada, y el operador debe practicar con frecuencia. Por lo tanto, nuestros procedimientos de muestreo de retina aún deben mejorarse para promover en mayor medida la investigación sobre el efecto protector y el mecanismo de la medicina tradicional contra la RP.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Investigación Científica del Departamento de Educación Superior de Ningxia (NYG2022029).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Amersham ImagerGE680
Persulfato de amonio  Boster Biological Technology Co., LtdA8090
Balanza analíticaMettler ToledoME104E
BCA kit de cuantificación de proteínas  Ken Gen Biotecnología. Co. LtdKGP902
anticuerpo de caspasa-3 escindidoTecnología de señalización celular#9664
Tecnología de señalización celularde anticuerpos de caspasa-7 escindidos#8438
de señalización celularde anticuerpos contra caspasa-9 escindidos#9507
Sistema TUNEL fluorométrico sin salidaPromegaG3250
Glicina  Boster Biological Technology Co., LtdAR1200
Cabra Anti-Conejo IgG H& L (HRP)Bioss Antibodiesbs-80295G-HRP
Suero de cabraBiosharpBL210A
Trituradora de alta velocidad Thermo Fisher  ScientificAG22331
Membranas de transferencia Immobilon-P SQ MerckMillipore. LtdISEQ00010
IsofluranoRWD Life ScienceR510-22-10
MetanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
Lector de microplacasThermo Fisher  Microscopio científico1510
OlympusIX73
Portaobjetos de microscopioCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
Mini-PROTEAN TetraBIO-RAD1658001
N-Metil-N-Nitrosoureasigma-AldrichN4766– Horno de 100G
Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Página Pre-solución (30% )Doublehelix Biology Science and Technology Co.,LtdL3202A
PageRuler Escalera de proteínas preteñidaThermo Fisher Scientific26617
PBS TampónBiosharpG4202
SDS-PAGE Tampón de carga de proteínas (5& veces;)Beyotime BiotechnologyP0015
Leche descremada en polvoBioFroxx1172GR500
Ratas Sprague DawleyUniversidad Médica de NingxiaSCXK (Ning) 2020-0001
TEMED  Boster Biological Technology Co., LtdAR1165
Kit de extracción de proteínas totales  Ken Gen Biotecnología. Co. LtdKGP2100
Módulo Trans-BlotBIO-RAD1703935
Tris base  Boster Tecnología Biológica Co., LtdAR1162
Pinza  Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
β-tecnología de señalización celular#4970
Tecnología de actina

Referencias

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