Artículo de método

Aislamiento de condrocitos y condroprogenitores mediante adhesión de fibronectina y ensayo migratorio

DOI:

10.3791/67160

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4 de octubre de 2024

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1Department of Physiology, Christian Medical College, 2Centre for Stem Cell Research (A unit of InStem, Bengaluru), Christian Medical College, 3Department of Orthopedics, Christian Medical College, 4Faculty of Health and Medical Sciences, The University of Adelaide, 5Department of Orthopedics and Trauma, Royal Adelaide Hospital

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla el aislamiento de condrocitos, condroperogenitores derivados del ensayo de adhesión a la fibronectina (FAA-CP) y condroprogenitores migratorios (MCP) del cartílago articular humano. Abarca la digestión enzimática, la adhesión a la fibronectina y los ensayos basados en la migración para aislar y caracterizar estas células.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células condroprogenitadoras (CPC), recientemente identificadas como una subpoblación distinta, son prometedoras debido a sus propiedades mesenquimales, mayor condrogénesis y rasgos hipertróficos limitados. El enriquecimiento de los progenitores se logra a través de la adhesión diferencial de fibronectina y ensayos de explantes basados en la migración, con condroprogenitores derivados del ensayo de adhesión a fibronectina (FAA-CP) y condroprogenitores migratorios (MCP) que demuestran un potencial superior en comparación con los condrocitos. Este artículo profundiza en los detalles del aislamiento de células derivadas del cartílago residente, a saber, condrocitos y condroprogenitores. Si bien los valiosos conocimientos de la investigación de los condrocitos contribuyen a nuestra comprensión de la reparación del cartílago, los esfuerzos continuos se dirigen hacia el uso de condroprogenitores y la exploración de su potencial como un enfoque terapéutico alternativo. Además, este artículo de metodología proporciona un protocolo detallado paso a paso para aislar tres tipos específicos de células del cartílago: condrocitos, FAA-CP y MCP. Al seguir procedimientos estandarizados, este protocolo facilita la extracción exitosa de estos subtipos de células. Basado en una extensa investigación, el artículo se centra en las intrincadas técnicas utilizadas para aislar los diferentes subconjuntos y las condiciones de cultivo optimizadas necesarias para expandir y mantener sus cultivos. La metodología abarca el aislamiento enzimático de condrocitos derivados del cartílago articular humano, la adhesión diferencial de fibronectina después de la digestión enzimática secuencial y los ensayos de explantes basados en la migración para obtener células residentes en el cartílago.

Introducción

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La aparición de la terapia regenerativa basada en células representa un enfoque importante para el tratamiento de las dolencias relacionadas con el cartílago, como la osteoartritis (OA) y los defectos condrales1. Estos trastornos, caracterizados por la ruptura o lesión del cartílago dentro de las articulaciones, presentan desafíos sustanciales durante el tratamiento. Se ha reportado que la autorreparación del cartílago articular es limitada debido a su arquitectura anenal, avascularidad y baja actividad mitótica2.

Las células más utilizadas para la regeneración del tejido cartilaginoso son las células madre mesenquimales (MSC) y los condrocitos3. Sin embargo, varios estudios han reportado limitaciones en el uso de estas células para la regeneración4. Estas limitaciones incluyen la diferenciación terminal de los condrocitos durante la expansión in vitro extendida para lograr el recuento celular requerido y la tendencia hipertrófica de las MSC. Estos factores pueden dar lugar a la formación de tejido reparador con una combinación subóptima de fibrocartílago e hialina 5,6,7,8.

El descubrimiento de las células condroprogenitadoras (CPC) surgió de la búsqueda de células alternativas en el cartílago articular9. Han generado un inmenso interés debido a su parecido con las MSC y su potencial condrogénico superior, al tiempo que exhiben una hipertrofia reducida, una combinación indispensable buscada por 10,11. A diferencia de los condrocitos, se ha reportado que estas poblaciones progenitoras exhiben una mayor actividad replicativa y de telomerasa, así como una mayor expresión de la proteína homóloga 1 del locus neurogénico notch (NOTCH-1) y el factor de transcripción SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. Existen dos métodos estándar para aislar CPC reportados tanto en cartílago como en menisco, incluido uno basado en su expresión del receptor de integrina (CD49e/CD29), aislado a través de un ensayo de adhesión de fibronectina: Condroprogenitores derivados del ensayo de adhesión a la fibronectina (FAA-CP), y el otro basado en su mayor potencial migratorio de los explantes de cartílago: Condroprogénidores migratorios (MCP)11,13,16,17,Isaías 18,19. Numerosos estudios in vitro demuestran la superioridad condrogénica y la reducción de la hipertrofia tanto de las FAA-CPCs como de las MCPs en comparación con los condrocitos y las MSCs de médula ósea (BM)-20,21,22,23.

Investigaciones recientes in vitro que comparan los FAA-CPC con los MCP han demostrado la mayor capacidad de regeneración del cartílago de esta última población progenitora en condiciones normales de oxígeno24. Estos optimistas resultados in vitro muestran una regeneración similar a la hialina, lo que alienta la realización de nuevos experimentos in vivo. Sin embargo, se ha reportado que ambas poblaciones de CPC reparan y regeneran eficientemente el cartílago en la OA y otros trastornos osteocondrales en modelos animales 25,26,27,28,29.

Nuestro laboratorio ha contribuido activamente a estandarizar las técnicas de aislamiento de CPC y a comparar sus características fenotípicas con condrocitos y MSCs. Este artículo proporcionará un protocolo detallado que explica los pasos involucrados en el aislamiento y cultivo de células residentes de cartílago, a saber, condrocitos, FAA-CPC y MCP.

Protocolo

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El protocolo ha sido aprobado y cumple con las normas y directrices pertinentes del Comité de Revisión Institucional (Comité de Investigación y Ética). Después de obtener el consentimiento informado por escrito, se obtienen articulaciones tibiofemorales humanas de pacientes con osteoartritis (OA) (puntuación radiológica de Kellgren-Lawrence 4)30 que requieren un reemplazo total de rodilla como parte de su tratamiento. Se excluyeron del estudio las articulaciones de los pacientes con cualquier signo de tumores, infecciones o artritis inflamatoria (como artritis reumatoide o gota). Se garantiza que todos los procedimientos se lleven a cabo en condiciones estériles, siguiendo los protocolos estándar de laboratorio durante todo el proceso experimental.

1. Obtención de articulaciones tibiofemorales

  1. Obtener articulaciones de rodilla (articulaciones tibiofemorales) de donantes humanos que requieran una amputación por encima de la rodilla como parte del tratamiento o de aquellos con osteoartritis de grado IV30 (evidencia radiológica que muestra una marcada reducción del espacio articular con esclerosis condral) que se someten a un reemplazo total de rodilla.
    NOTA: Asegúrese de que se obtenga el consentimiento informado de los pacientes siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki. Asegurar el cumplimiento de las reglas del Comité de Ética y de la Junta de Revisión Institucional.
  2. Excluya cualquier articulación que muestre síntomas de infección o inflamación.

2. Procesamiento de las articulaciones cosechadas

  1. Coloque las articulaciones tibiofemorales recolectadas en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) en condiciones estériles.
  2. Prepare un área estéril debajo de la capucha colocando una almohadilla estéril. Transfiera las articulaciones cosechadas a la almohadilla inferior.
  3. Estabilice las articulaciones tibiofemorales seccionadas sosteniendo el hueso subcondral con el cartílago hacia arriba.
  4. Con una hoja de bisturí (n.º 22), extraiga virutas de cartílago de forma rectangular de las zonas que no soportan peso para los pacientes con artrosis dentro de 1-2 h después de obtener la articulación.
  5. Cosecha las secciones de cartílago de 8 mm x 10 mm desde la capa superficial hasta la capa más profunda.
  6. Lave las rodajas de cartílago con 1x solución de PBS y colóquelas en una placa de Petri que contenga 1-2 ml de medio DMEM simple.
  7. Picar el cartílago en rodajas agradables hasta un tamaño de menos de 1 mm x 1 mm x 1 mm con una hoja de bisturí (n.º 22).
    NOTA: Asegúrese de que las rodajas de cartílago o el cartílago picado no se sequen; colóquelos en un medio de cultivo o PBS desprovisto de suero.

3. Aislamiento de condrocitos

  1. Colocar el cartílago picado en un matraz T-25 vertical que contenga 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) con 0,15% de colagenasa tipo II para digestión enzimática. Deje el matraz sin tocar durante 12-14 h en una incubadora deCO2 , garantizando las condiciones normalesde cultivo 31.
    NOTA: Se debe utilizar un medio DMEM-F12 simple sin trazas de suero, ya que el suero inactiva la acción enzimática.
  2. Después de la digestión durante la noche, transfiera el medio que contiene las células liberadas a un tubo de centrífuga fresco y estéril que contenga un volumen igual de DMEM-F12 + 10% de suero fetal bovino (FBS), utilizando un colador de células para separar las células de los desechos. Las células liberadas son los "condrocitos".
  3. Centrifugar las células filtradas a una velocidad de 1200 x g durante 5 minutos a 37 °C.
  4. Deseche el sobrenadante sin alterar la pellet. Reconstituya el pellet obtenido en 1 mL de medio y cuente las células viables liberadas mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano.
  5. Cargue los condrocitos en un matraz T-25 a una concentración de 10.000 células/cm² y amplíe hasta el número de paso requerido utilizando DMEM-F12 que contenga un 10% de FBS. Los componentes adicionales en el medio incluyen ácido ascórbico (62 μg/mL), L-glutamina (2,5 mM/L), penicilina-estreptomicina (100 UI/mL) y anfotericina-B (2 μg/mL).
  6. Refresque el medio cada 3 días y recoja las células en subconfluencia utilizando ácido etilendiaménico tetraacético (EDTA) al 0,125% que contiene tripsina.

4. Aislamiento de condroprogenitores derivados del ensayo de adhesión a fibronectina (FAA-CP)

  1. 12 h antes de la liberación de los condrocitos, preparar 10 mL de 1x PBS que contenga 1 mM de MgCl2 (10 μL) y 1 mM de CaCl2 (10 μL), y 100 μL de Fibronectina (10 μL/mL)32.
  2. Cubra el número requerido de pocillos de una placa de 6 pocillos (1,5 mL/9,3 cm2) con la solución preparada.
  3. Selle la placa herméticamente y refrigere durante la noche a 4 °C.
  4. Además, obtenga virutas de cartílago de una manera similar a la explicada para el aislamiento de condrocitos (pasos 2.1-2.5).
  5. Someter las virutas de cartílago a una digestión enzimática secuencial durante la noche (0,2% de Pronase durante 3 h; seguida de 0,04% de Colagenasa tipo II durante 12 h) en un baño de agua agitado mantenido a 37 °C para obtener condrocitos individuales.
  6. Al día siguiente, retire la placa de 6 pocillos recubierta de fibronectina del refrigerador y elimine el exceso de fibronectina.
    NOTA: El exceso de fibronectina debe eliminarse lenta y suavemente sin alterar el recubrimiento en el fondo del pozo. La presencia de MgCl2 (10 μL) y 1 mM de CaCl2 es crucial para asegurar la adhesión de las células.
  7. Agregue 2-3 mL de medio DMEM-F12 simple en los pocillos recubiertos.
  8. Siembre los condrocitos liberados en los pocillos recubiertos a una densidad de carga de 4000 células/pocillo y deje la placa sin tocar durante un período de 20 min.
  9. Después de la incubación, retire el exceso de medios y las células no adherentes. Agregue 2-3 mL de medio de crecimiento estándar como se usa para los condrocitos (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. Mantener las células adherentes en condiciones de cultivo estándar durante 10-12 días para obtener clones de CPC (colonias de >32 células).
  11. Aislar con tripsina-EDTA al 0,125% durante 180 s, replatear los clones en una proporción de 1 clon/5 cm² y expandir los CP policlonales enriquecidos hasta la confluencia requerida. Estas células obtenidas se denominan "FAA-CPC".
  12. Cultivo adicional de las células en medio DMEM-F12 + 10% FBS + factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFβ2: 1 ng/mL) + factor de crecimiento de fibroblastos (FGF2: 5 ng/mL).
    NOTA: La incubación de las células en placas recubiertas de fibronectina no debe exceder los 20 minutos, ya que los condrocitos también pueden comenzar a adherirse. Durante el período de adherencia de 20 minutos, el medio debe estar desprovisto de suero. A continuación, las células que se adhieren a formar clones deben cultivarse en un medio que contenga adicionalmente FBS. Los clones deben aislarse solo después de asegurarse de que cada clon tenga más de 32 células; Esto es para evitar los amplificadores de tránsito. Una mayor expansión de los clones después de la tripsinización debe incluir los factores de crecimiento adicionales mencionados. Una densidad de carga de 4000 condrocitos/9,3cm2 de una placa recubierta de fibronectina, después de una incubación de 20 minutos seguida de un lavado, da como resultado la adhesión de 80-100 células en total. De estos, alrededor de 20 clones progresarán para crecer y lograr una duplicación de la población de 5 en 10-12 días.

5. Aislamiento de condroprogenitores migratorios

  1. Afeitar los explantes de cartílago (10 mm x 5 mm x 1 mm) de la articulación extraída y colocarlos en una placa estéril de 6 pocillos que contenga medios DMEM-F12 con 10% de FBS y 10 mM de Glutamax (2-3 explantes/pocillo)33.
  2. Deje la placa con los explantes sin tocar durante 48 h en una incubadora deCO2 mantenida a 37 °C.
  3. Después de 2 días, transfiera los explantes a un tubo de centrífuga que contenga 10 mL de solución de colagenasa al 0,1% para digestión enzimática. Incubar el tubo a 37 °C durante 2 h.
    NOTA: Los explantes requieren ser enjuagados con 1x PBS antes de la digestión enzimática, ya que las trazas de suero pueden inactivar la acción enzimática. Para el lavado, sumerja los explantes en una placa de Petri llena de 2-3 mL de 1x PBS; Esto también es para garantizar la no contaminación con los condrocitos liberados. El manejo de los explantes debe mantenerse al mínimo, y esto es para evitar estresar a los progenitores que han comenzado a migrar.
  4. Después de la digestión, enjuague los explantes con 1x PBS y vuelva a colocarlos en los mismos pocillos de la placa que contiene medios DMEM-F12 frescos con 10% de FBS y 10 mM de medio Glutamax.
  5. Mantenga la placa en condiciones de cultivo estándar en la incubadora. Observe la migración de condroprogenitores en los días siguientes.
  6. Al llegar a la subconfluencia, coseche los MCP utilizando 0,125% de tripsina que contenga EDTA.
  7. Amplíe los MCP utilizando el medio de expansión estándar, que incluye DMEM-F12, que contiene un 10% de FBS y 10 mM de Glutamax.

6. Caracterización fenotípica de condrocitos, FAA-CPs y MCPs

  1. Análisis de citometría de flujo (FACS)
    NOTA: Se siguen los siguientes pasos para el análisis FACS de los grupos de células cosechadas.
    1. Tripsinizar las células según el protocolo estándar utilizando tripsina al 0,125% y centrifugar a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente para obtener el pellet de la célula.
    2. Deseche el sobrenadante, lave y vuelva a suspender el pellet con 1x PBS.
    3. Transfiera la suspensión a tubos etiquetados para FACS.
    4. Divida la suspensión en partes iguales en dos tubos: un tubo "sin teñir" que actúa como control (suspensión celular sin anticuerpo) y tubos "teñidos" que actúan como pruebas (suspensión celular con anticuerpo).
    5. Siga la ficha técnica de los anticuerpos individuales/Cluster de marcadores de diferenciación (CD) para la tinción. Los anticuerpos para la comparación incluyen CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (marcadores de expresión positivos); CD34-PE, CD45-FITC y CD14-FITC (marcadores de expresión negativos)34,35; CD166-BB515 y CD146-PE (potenciales marcadores condrogénicos)36,37.
      NOTA: Los marcadores de CD son sensibles a la luz. Para asegurarse de que los pasos se realicen en la oscuridad.
    6. Incubar la suspensión celular con anticuerpos durante 30 minutos en la oscuridad.
    7. Después de la tinción, agregue 1 mL de 1x PBS a los tubos y centrifugue a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente para obtener el pellet de celda.
    8. Deseche tres cuartas partes del sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en el contenido sobrenadante restante mediante una trituración suave.
    9. Proceda al análisis FACS.

7. qRT-PCR

NOTA: El análisis qRT-PCR de la expresión génica implica la evaluación del colágeno tipo I (COL1A1), el colágeno tipo X (COL10A1) y el factor de transcripción relacionado con Runt (RUNX2) para la expresión hipertrófica, y SOX-9, Aggrecan (ACAN) y colágeno tipo II (COL2A1) para la condrogénesis.

  1. Extraiga el ARN de los grupos celulares utilizando kits disponibles comercialmente según las instrucciones del fabricante.
  2. Después de la extracción, evalúe la relación A260/A280 y la concentración de ARN.
  3. Utilice 280 ng del ARN extraído para construir ADN complementario (ADNc).
  4. Inicie la qRT-PCR con Sybr Green, cada reacción contiene una concentración final de 7 ng de ADNc en un termociclador.
  5. Normalice la expresión relativa del ARNm de cada gen al gen de mantenimiento de referencia GAPDH (ΔCt).
  6. Calcular la expresión relativa de cada gen utilizando la técnica 2-ΔΔCt comparando el valor de ΔCt de cada gen individual con el de los FAA-CPs (ΔΔCt)37.

8. Diferenciación multilinaje

NOTA: Los medios diferenciales disponibles en el mercado inducen la diferenciación trilineal en linajes adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos.

  1. Para la diferenciación adipogénica, se deben utilizar células de siembra a una densidad de carga de 1000 células/cm2 en una placa de cultivo celular y cultivar utilizando un medio de diferenciación adipogénico (cambio medio, una vez cada 3 días) hasta una subconfluencia del 80% durante 3 semanas.
  2. Para la diferenciación osteogénica y condrogénica, siga el sistema de cultivo de pellets de 28 días38.
  3. Centrifugar 0,5 x 106 celdas a 400 x g durante 12 min a 37 °C para formar gránulos e iniciar la diferenciación utilizando un medio de diferenciación osteogénico y condrogénico.
  4. Fije, incruste y seccione los gránulos para una tinción confirmatoria (paso 9).

9. Tinción confirmatoria

  1. En el caso de células de linaje adipogénico, fije las células con formol tamponado, lave y tiña con Oil Red O (0,5%). Tiña también los controles (cultivados en un medio DMEM estándar con 10% de FBS).
  2. Observar bajo un microscopio y adquirir las imágenes.
  3. Para las células de linaje osteogénico diferenciado, teñir con rojo de alizarina (2%).
    NOTA: Se aplican múltiples protocolos de tinción confirmatoria para las células diferenciadas condrogénicas.
  4. Tinción con azul alcián: Teñir las células fijas con azul alcián durante 5 min y contrateñir con rojo neutro.
  5. Para evaluar el contenido de glicosaminoglicanos (GAG), realice la tinción de safranina O: tiñir los portaobjetos con hematoxilina de hierro de Wiegert seguido de una incubación posterior con alcohol ácido (1 %), solución verde rápida (0,05 %), ácido acético (1 %) y solución de safranina O (1 %).
  6. Tinción con azul de toluidina: Tiñe los portaobjetos con azul de toluidina (0,1%) durante 5 min.
  7. Tinción PicroSirius Red: Teñir los portaobjetos con Picrosirius Red (0,1%) y contratinción con colorante de hematoxilina.
    NOTA: Después de la tinción, deshidrate los portaobjetos con alcohol graduado y aclare con xileno. Monte portaobjetos con un montante de dibutilftalato de poliestireno xileno (DPX), obsérvelos bajo un microscopio y adquiera imágenes.
  8. Para la tinción inmunohistoquímica (colágeno tipo II) del pellet diferenciado condrogénico, se someten las secciones de pellets a la recuperación enzimática del antígeno utilizando las enzimas pronasa (1 mg/mL) e hialuronidasa (2,5 mg/mL).
  9. Incubar las secciones con el anticuerpo anticolágeno monoclonal primario de ratón tipo II, seguido de un anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con HRP secundario a escala 1:250.
  10. Teñir los portaobjetos con cromógeno 3,3′-diaminobenzidina (DAB) y contrateñirlos con hematoxilina.
  11. Observe bajo un microscopio y capture imágenes.

10. Determinación del contenido de GAG/ADN

  1. Digiera los gránulos diferenciados condrogénicos con una solución de papaína-cisteína a 65 °C durante 16 h.
  2. Estime la concentración de ADN utilizando el reactivo Picrogreen38 y adquiera la intensidad de fluorescencia en longitudes de onda: excitación: 480 nm, emisión: 520 nm utilizando un lector de placas ELISA.
  3. Evalúe el contenido total de GAG utilizando el método del colorante azul de dimetilometileno 38.
  4. Mida la densidad óptica a 525 nm utilizando un lector de placas ELISA.
  5. Normalice los valores de GAG a los valores de ADN y calcule la relación total de GAG/ADN.

Resultados

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A partir de 86,9 mg de cortes de cartílago, se observó un rendimiento de células condrocitos de 1,72 x 105 células. Al cargarse, los condrocitos se adhieren rápidamente, presentando un aspecto inicial de adoquín redondeado y transformándose en un estado fibroblástico al expandirse más (Figura 1 A,B). La siembra de estos condrocitos en placas de fibronectina generalmente da como resultado una adhesión del 2%, con cada célula experimentando un crecimiento clonal (Figura 2 C,D), alcanzando una población que se duplica de 5 en los días 10-12 (32 células/clon). Los clones dentro del área de 10 cm² se combinan y se expanden hasta el paso necesario para producir FAA-CPs. Los explantes de cartílago, sostenidos en cultivo después de la incubación de la colagenasa, exhiben un aflojamiento de la matriz extracelular, y la migración se observa generalmente ya al7º día (Figura 2E). Tanto los FAA-CP como los MCP muestran una estructura en forma de huso, una característica comúnmente asociada con los BM-MSC, adquiriendo una estructura en forma de panal antes de la confluencia (Figura 1E, F).

Los tres tipos de células aisladas, a saber, condrocitos, FAA-CP y MCP, se monitorean de cerca mediante imágenes de contraste de fase. Los FAA-CP se transfieren solo después de la confirmación de cinco duplicaciones de población.

La caracterización fenotípica de las células aisladas y expandidas suele incluir el análisis de citometría de flujo para los marcadores putativos de condrogénesis, a saber, CD146 y CD166, así como el análisis de la expresión génica para los marcadores de condrogénesis (SOX-9, ACAN, COL2A1), el marcador de fibrocartílago COL1A1 y los marcadores de hipertrofia (RUNX2 y COL10A1). Los tres grupos celulares muestran una alta expresión (>95%) de CD105, CD73 y CD90; expresión baja a negativa de CD34 y CD45; y alta expresión (>98%) de CD166, con expresión moderada de CD146 dependiente del donante (40%-75%)(Figura 2A).

Los resultados de la qRT-PCR muestran una expresión comparable y alta de SOX-9, ACAN y también COL1A1, un marcador de fibrocartílago, ya que las células se cultivan antes de la evaluación (Figura 2B). Para confirmar la condrogénesis, se observa una absorción positiva de complejos de color rojo anaranjado en las áreas que contienen GAG después de la safranina O, y complejos de color azulado a violáceo después del azul alcián y el azul de toluidina en todos los grupos celulares, con una mayor proporción en los grupos FAA-CP y MCP. El análisis inmunohistoquímico de los pellets condrogénicos diferenciados para el colágeno tipo II muestra una captación fibrilar pardusca en los tres grupos (Figura 3). Además, el análisis de GAG/ADN también mostró la confirmación de la diferenciación condrogénica con los grupos FAA-CP que mostraron una mayor expresión (Figura 2C).

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Figura 1: Aislamiento y caracterización de condrocitos y condroperogenitores. El algoritmo de estudio describe el aislamiento de tres grupos celulares y sus características morfológicas bajo un microscopio de contraste de fase inmediatamente después del aislamiento y después de unos días de expansión. (A) Los condrocitos recién aislados se adhieren a los cultivos adherentes durante los primeros días del cultivo, adquiriendo un aspecto fibroblástico con mayor expansión (B). (C) Los condrocitos sometidos a un ensayo de adhesión de fibronectina muestran un crecimiento clonal, alcanzando una población que se duplica de 5 para el día 10 (D). (E) Los condroprogenitores migran desde el borde del explante hacia el día 10 de cultivo y exhiben un patrón de crecimiento en forma de huso con mayor expansión (F). Aumento de imagen de contraste de fase: 10x; Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Datos de caracterización molecular. (A) Análisis de citometría de flujo para marcadores MSC positivos y negativos y posibles marcadores de condrogénesis. (B) Datos de expresión de RT-PCR para los tres grupos celulares para el análisis de expresión génica de marcadores condrogénicos e hipertróficos. (C) Análisis de GAG/ADN total de los pellets diferenciados condrogénicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Tinción confirmatoria tras la diferenciación condrogénica. Safranina O y análisis inmunohistoquímico de colágeno tipo II entre los tres grupos celulares. Barras de escala: para aumento de 10x, 50 μm; Aumento de 40x, 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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La regeneración potencial del cartílago articular, que contiene tejido hialino, puede lograrse mediante la optimización de sus dos tipos de células nativas: condrocitos y condroprogenitores. Si bien la investigación exhaustiva sobre los condrocitos ha proporcionado información valiosa sobre su papel en la reparación del cartílago, las preguntas sobre la naturaleza del tejido regenerado han impulsado esfuerzos para mejorar su fenotipo y explorar terapias alternativas. Los condroprogenitores, identificados como una subpoblación celular relativamente reciente, se muestran prometedores debido a sus propiedades mesenquimales inherentes, condrogénesis aumentada y rasgos hipertróficos limitados12. Las dos técnicas principales para la recolección y mejora de los progenitores involucran la adhesión diferencial de fibronectina y el ensayo de explante basado en la migración18,32. También se ha descrito el aislamiento de FAA-CPs humanas utilizando tejido meniscal, reportando un alto potencial proliferativo y multipotente16,17. Los estudios de caracterización in vitro que comparan los FAA-CPs y MCPs con los condrocitos indican un potencial superior para que los FAA-CPs y los MCPs exhiban fenotipos condrogénicos más altos y menos hipertróficos, lo que refleja un perfil favorable con una mayor acumulación y producción de GAG 15,24,31,39. Estudios in vivo limitados sugieren que los condroprogenitores pueden atenuar la progresión de la osteoartritis y demostrar resultados beneficiosos en la reparación de defectos osteocondrales cuando se usan junto con bioandamios. En los últimos años, se han realizado importantes esfuerzos de investigación para mejorar y descubrir todo el potencial de los condroprogenitores.

Este artículo proporciona un protocolo detallado para el aislamiento de células residentes en cartílago. Las células primarias y más comunes liberadas del cartílago son los condrocitos. Sin embargo, el cartílago digerido enzimáticamente es una población heterogénea de células que no solo contiene condrocitos sino también progenitores a una concentración muy baja, lo que requiere un enriquecimiento en condiciones in vitro .

Observando la evidencia circunstancial que indica la participación de estas células en el impulso del crecimiento aposicional, Dowthwaite et al. llevaron a cabo el aislamiento y caracterización de los condroprogenitores. Estos progenitores se derivaron de la capa superficial del cartílago articular mediante la utilización de un ensayo de adhesión de fibronectina10. Esta población distinta se extrajo de terneros fetales a través de un proceso que involucra la adhesión selectiva a la fibronectina. Se demostró que posee flexibilidad fenotípica y una alta capacidad para formar colonias, junto con la expresión del gen selector del destino celular Notch-1. Además de estas investigaciones iniciales, la caracterización de los progenitores del cartílago articular humano reveló niveles elevados de expresión de SOX9 y Notch1, una preferencia por CD49e/CD29 y un aumento de la actividad de la telomerasa en comparación con los condrocitos maduros12,32. Este protocolo también se ha establecido en tejido de cartílago humano osteoartrítico, con reportes que muestran su presencia no solo en el cartílago superficial sino también en las capas más profundas del cartílago, con muchos grupos que emplean cultivos policlonales a cultivos monoclonales 11,12.

Por otro lado, Koelling et al. investigaron la posible participación de los condroprogenitores en la localización y la migración en respuesta a la lesión del cartílago, contribuyendo así a la reparación de los tejidos18. Además, Seol et al. demostraron que, en respuesta a la lesión del cartílago, los progenitores exhibieron una mayor migración a través de la proteína Box 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) y la quimiotaxis mediada por RAGE19. Elsaesser et al. también observaron la capacidad migratoria superior de los condroprogéniores nasales en comparación con los condrocitos y las BM-MSCs22. Un estudio realizado por Joos et al. encontró que la liberación del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) y el factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) mejoró la migración de condroprogenitores, mientras que la interleucina 1 beta (IL-1β) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) inhibieron el movimiento de los progenitores después de una lesión40. Se realizó un informe reciente en el que se compararon cuatro métodos diferentes de aislamiento de MCP en términos de sus métodos de aislamiento y condiciones de cultivo, y el método recomendado se explica en este artículo33. El enfoque de aislar a los progenitores en función de sus capacidades migratorias dio como resultado células que no solo exhibían un alto potencial condrogénico, sino que también mostraban características similares a las células madre mesenquimales.

En el laboratorio, siguiendo protocolos estandarizados, se ha logrado un aislamiento exitoso de los tres subtipos. Además, estudios comparativos pioneros han demostrado los atributos superiores de los FAA-CPs en comparación con los condrocitos 12,15,41. También se han explorado comparaciones entre condroprogenitores, revelando que los MCPs exhiben un mayor potencial24. Hay que tener en cuenta que, dado que los tres subtipos se aíslan del mismo tejido y el progenitor en su forma nativa tiene muy poca presencia en su liberación inicial del cartílago articular -que contiene principalmente condrocitos-, es necesario enriquecerlos mediante cultivos in vitro.

Los métodos de evaluación integrales abarcaron la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), el análisis microscópico electrónico, los estudios de titulación de factores de crecimiento, las técnicas de etiquetado celular, el inmunoperfil y la evaluación de su potencial terapéutico para el tratamiento de la osteoartritis y los defectos condrales utilizando modelos in vivo 12,24,42.

Los hallazgos actuales indican que el aislamiento de los tres subtipos es factible incluso en las articulaciones artríticas, aunque requiere una duración de expansión prolongada. En particular, enfatizamos la importancia de evitar la adición de factores de crecimiento durante el crecimiento clonal, destacando la necesidad crucial de introducir factores adicionales durante la expansión de estas células. Los pasos cruciales, como el tiempo para la incubación en placas recubiertas de fibronectina, la adición de factores de crecimiento en diferentes puntos de tiempo y el manejo mínimo de los explantes, entre otros elementos esenciales mencionados, juegan un papel importante en el cultivo y la expansión de las células cosechadas. También es esencial asegurarse de que las células alcancen una confluencia de no más del 75%-80% en un momento dado.

El potencial de los condroprogenitores ha suscitado un gran interés debido a su superioridad sobre las terapias celulares comúnmente utilizadas en el campo de la reparación del cartílago, a saber, las BM-MSC y los condrocitos. Estos progenitores son prometedores, con varios experimentos in vivo que demuestran su eficiencia para reemplazar el estándar de atención actual. Al tratarse de un subconjunto descubierto recientemente, la caracterización y la información sobre su fenotipo aún están en curso, y el primer ensayo clínico que utiliza FAA-CP para el tratamiento de defectos condrales está previsto que comience en 2024. Por lo tanto, el aislamiento y la expansión de las células derivadas del cartílago, en particular los condroprogenitores, son cruciales y prometedores para la reparación basada en células en el campo de la regeneración del cartílago.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a la Sra. Bhavini Krishnan y a la Sra. Merin Mary Zachariah por su aporte intelectual y al Centro de Investigación de Células Madre (una unidad de inStem Bengaluru), Departamento de Fisiología, Christian Medical College, Vellore, por su apoyo a la infraestructura. Los proyectos en curso cuentan con el apoyo del Departamento de Biotecnología (BT/PR32777/MED/31/415/2019), el Gobierno de la India, la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (CRG/2022/004277), el Gobierno de la India y Fluid Research Grants, Christian Medical College, Vellore.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hoja de 22 bisturíes FURGONETA
Placa de 6 pocillos CORNING3516
Azul AlciánTHERMO SCIENTIFICJ6012
Rojo Alizarina SIGMA130223
Anfotericina-B (2 μ g/mL).GIBCO15240062
Ácido ascórbico (62 μ g/mL)Citómetro de flujo SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX BECKMAN COULTERCYTExpert Software versión 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH  C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE
561443 CD106-APCBD BIOSCIENCE
551147 CD14-FITCBD BIOSCIENCE
555397 CD29-APCBD BIOSCIENCE
CD34-PEBD BIOSCIENCE
CD45-FITC BD 347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC  MACS 130/100337
CD49E-PEBD BIOSCIENCE
CD73-PEBD BIOSCIENCE
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Contador de célulasDE NOVIXCell Drop BF
Colador de célulasHIMEDIATCP024
CentrífugaBECKMAN COULTERAllegra X-30R
Incubadora <> CO2MODELO THERMOSCIENTIFIC-371
Colágeno tipo X (COL10A1), factor de transcripción relacionado con Runt (RUNX2), factor de transcripción SRY-Box 9 (SOX-9), agrecano (ACAN) y colágeno tipo II (COL2A1) EUROGENTEC, BÉLGICA
Colagenasa tipo IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L Lector
placas ELISADEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Suero Fetal BovinoGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLON CORPAPA551Hu01
Fibronectina (10 µ L/mL)SIGMA ALDRICHF1141
Sistema de síntesis de primera cadenaTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxilinaQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Aceite Rojo OSIGMA1320065
PBS (solución salina tamponada con fosfato)GIBCO10010023
PCR thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSTermociclador Quantstudio 12K Flex 
Penicilina-estreptomicina (100 UI/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Anticuerpo primario (colágeno de ratón tipo II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen reactivo de dsDNA THERMOSCIENTIFICP7589
FrigoríficoELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranina OQUALIGENSQ39962
Anticuerpo secundario (anticuerpo IgG anti-ratón de cabra, conjugado HRP)THERMO SCIENTIFIC31430
Baño de agua agitado REMI
StemPro GIBCO1007201, A1007001 y A1007101
matraz T-25 CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Azul EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Cultivo de tejidos PetridishTARSONS960010
Azul de toluidinaQUALIGENS2040
Azul de tripán GIBCO15250061
Tripsina EDTAGIBCO25200072
DE VIDRIO559883348057 555617 550257 de MOLECULAR Kits diferenciadores

Referencias

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