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Artículo de método

Modelo de coma isquémico cerebral inducido por oclusión modificada de cuatro vasos

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DOI:

10.3791/67161

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5 de julio de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, 2School of Medicine, Foshan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el proceso para inducir un modelo de coma isquémico cerebral utilizando un método de oclusión modificado de cuatro vasos.

Resumen

El coma por isquemia cerebral es la complicación más grave de la isquemia cerebral. La oclusión de cuatro vasos puede establecer un modelo de coma isquémico cerebral para la investigación de enfermedades y el desarrollo de fármacos. Sin embargo, el método de oclusión de cuatro vasos comúnmente utilizado consiste principalmente en insertar una pluma de electrocoagulación en el agujero pterigoideo bilateral de la primera vértebra cervical detrás del cuello para electrocoagular las arterias vertebrales. Este proceso conlleva el riesgo de electrocoagulación incompleta, sangrado y daño al tronco encefálico y la médula espinal. Veinticuatro horas después de la cirugía, las ratas reanestesiadas se someten a una ligadura de la arteria carótida por delante del cuello. Dos cirugías exponen a las ratas a un mayor riesgo de infección y aumentan el período experimental. En este estudio, durante un solo procedimiento quirúrgico, se utilizó una incisión cervical anterior para localizar el sitio clave donde la arteria vertebral penetra en la primera vértebra cervical. Las arterias vertebrales bilaterales se electrocauterizaron en condiciones visuales, mientras que las arterias carótidas comunes bilaterales se separaron para colocar nudos sueltos. Cuando las extremidades de las ratas comenzaron a temblar, las arterias carótidas comunes bilaterales se ligaron rápidamente para inducir el coma isquémico. Este método puede evitar el riesgo de infección causado por dos operaciones quirúrgicas y es fácil de realizar con una alta tasa de éxito, proporcionando una referencia útil para los profesionales relevantes.

Introducción

El daño cerebral isquémico es la lesión cerebral más común en la práctica clínica, representando aproximadamente el 75% de los casos de enfermedad cerebrovascular. La isquemia puede conducir a lesiones y enfermedades cerebrales secundarias graves 1,2, y el coma es el síntoma más grave causado por la lesión cerebral hipóxica isquémica. También es el camino final para muchas condiciones críticas3. El coma es una enfermedad crítica y grave en la práctica clínica de difícil manejo4. Cuanto más dure el coma, mayor será el peligro potencial. El despertar temprano es el objetivo principal para prevenir el deterioro y la progresión de la afección. Aunque la inyección de naloxona tiene una amplia gama de aplicaciones clínicas en la promoción de la vigilia, todavía tiene algunos efectos secundarios5. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos seguros y eficaces que promuevan la vigilia es un problema urgente que debe abordarse. Establecer un modelo de coma isquémico cerebral simple y fácil de operar es esencial para dilucidar la patogenia del coma isquémico y para el desarrollo de fármacos 6,7,8.

El propósito de este estudio es presentar un modelo de inducción de coma isquémico global a través de la electrocoagulación de las arterias vertebrales bilaterales (AV) y la ligadura temporal de las arterias carótidas comunes bilaterales (CCA), que sea simple y fácil de usar para los principiantes. El protocolo anterior consistía en exponer el foramen pterigoideo bilateral de la primera vértebra cervical posterior durante la primera operación y quemar eléctricamente el foramen pterigoideo para bloquear los AV bilaterales. Se realizó una segunda intervención 24 h después para inducir un coma isquémico total mediante ligadura de los ACC bilaterales 9,10,11,12. Sin embargo, debido a la invisibilidad, existe el riesgo de electrocoagulación incompleta, hemorragia, lesión del tronco encefálico y de la médula espinal, así como un período experimental prolongado. Por lo tanto, es necesario abordar estas cuestiones.

Aquí, presentamos un método mejorado para modelar el coma isquémico. El procedimiento principal consiste en hacer una incisión en la parte anterior del cuello mediano, realizar una resección eléctrica de los AV bilaterales en condiciones visuales y ligar brevemente los ACC bilaterales durante una sola operación para bloquear el suministro de sangre a todo el cerebro, lo que provoca una inhibición rápida del electroencefalograma (EEG) y conduce al coma. Este método también induce un breve coma continuo después de la reperfusión. Este procedimiento es fácil de realizar, apto para principiantes y reduce el riesgo de infección por trauma secundario en los animales, acortando así el período experimental.

El protocolo es adecuado para el estudio del coma isquémico global causado por parada cardíaca. También es ideal para el estudio de la demencia isquémica, principalmente porque el área del cerebro del hipocampo es extremadamente sensible a la isquemia; Por lo tanto, la isquemia cerebral transitoria puede provocar daño o incluso pérdida de las neuronas del hipocampo13, lo que resulta en una disfunción cognitiva. Por lo tanto, el protocolo puede proporcionar una referencia para los profesionales que estudian la isquemia cerebral, el coma isquémico y la demencia isquémica.

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Protocolo

El protocolo experimental se llevó a cabo de acuerdo con los requisitos del Comité de Uso de Animales de Laboratorio y del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Foshan (Número de registro: 2023-643656). Para este estudio se utilizaron ratas macho Sprague Dawley (SD) (200 g ± 20 g, de 6 a 8 semanas de edad). Todos los datos de investigación con animales se han redactado de acuerdo con las directrices ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Implantación de electrodos EEG

  1. Inyectar 0,05 mg/kg de atropina por vía subcutánea 15 min antes de la anestesia para prevenir la obstrucción respiratoria y la asfixia causada por las secreciones. Administrar una inyección intramuscular de 20 mg/kg de zoletil y 5 mg/kg de xilacina para anestesiar a las ratas14. Use pinzas para sujetar los dedos de los pies de la rata para confirmar la anestesia profunda.
  2. Retira el pelo de la cabeza de la rata con una afeitadora de pelo. Fije la cabeza de la rata en un dispositivo estereotáxico cerebral usando barras auditivas no penetrantes. Use bolas de algodón estériles para aplicar etanol y povidona yodada tres veces en el sitio quirúrgico para desinfectar la piel.
  3. Corta la piel de la cabeza de la rata a lo largo de la sutura decapitada con una cuchilla quirúrgica. Retire el músculo que cubre el cráneo y exponga completamente el cráneo. Use hisopos de algodón estériles para detener el sangrado durante todo el proceso.
  4. Seca la superficie del cráneo con una bola de lavado de orejas para ayudar a que el cemento dental se adhiera firmemente al cráneo. Marque la posición de instalación del clavo de cráneo (diámetro 1,2 mm, longitud 3 mm) con un marcador negro (Figura 1, paso 1). Las posiciones específicas son la punta de la fontanela anterior y otros cuatro sitios.
  5. Use la aguja de una jeringa de 10 ml para rotar y perforar cuatro áreas en secuencia. Inserte cuatro clavos de cráneo en el cráneo en secuencia, asegurando el contacto con la corteza cerebral (Figura 1, pasos 2-3).
    NOTA: Utilice hisopos de algodón estériles para absorber la sangre en caso de sangrado para evitar la oxidación de las uñas óseas.
  6. Envuelve el alambre plateado del electrodo de EEG alrededor de la uña del cráneo. Incruste el electrodo electromiográfico en el músculo y fíjelo con una sutura 6-0.
  7. Mezcle la resina de la base de la dentadura postiza con polvo para dentaduras postizas autoendurecibles y fije el electrodo al cráneo. Use una bola de lavado de oídos para soplar aire sobre la superficie del cemento dental para acelerar el curado.
  8. Inyectar 10,000 unidades de penicilina para prevenir la infección. Coloque cada rata en una jaula separada para evitar desgarros mutuos y daños a los electrodos. Inyectado por vía subcutánea 0,2 mg/kg de meloxicam durante tres días consecutivos para aliviar el dolor postoperatorio. Espere 3 días para la recuperación de las heridas de rata y la fijación del electrodo (Figura 1, paso 4).

2. Proceso quirúrgico del modelo de coma isquémico cerebral

  1. Tres días después, vuelva a anestesiar a las ratas y colóquelas en posición supina. Use bolas de algodón estériles para desinfectar el sitio quirúrgico a través de tres aplicaciones repetidas de yodo seguidas de un enjuague / toallita con alcohol. Realice una incisión de unos 2-3 cm de largo con un bisturí desde el margen superior del esternón a lo largo de la mitad del cuello (Figura 1, paso 5).
  2. Separe sin rodeos el tejido subcutáneo y el músculo esternohioideo, exponiendo completamente la tráquea y los músculos largos del colli a ambos lados de la tráquea15.
    NOTA: Evite estimular la tráquea durante todo el procedimiento.
  3. Separe sin rodeos los músculos longus colli del nivel de la glándula tiroides hacia abajo, exponiendo la primera y segunda vértebras cervicales. Expanda el área del cuello con un dilatador de tejido de rata, exponiendo completamente el sitio quirúrgico.
  4. Utilice pinzas finas para separar cuidadosamente los músculos y tejidos visibles en el espacio intervertebral cervical, exponiendo la ubicación característica donde la arteria vertebral ingresa a la primera vértebra cervical. Se puede observar que la arteria vertebral pasa a través de la primera vértebra cervical (Figura 1, paso 6).
    NOTA: La colocación de una jeringa de 1 mL debajo del cuello proporciona un espacio de manipulación quirúrgica más despejado.
  5. Precaliente la pluma de electrocoagulación e insértela en el área durante 3-5 segundos para asegurarse de que la arteria vertebral esté electrocoagulada y cortada. Separe los músculos y la fascia a lo largo del borde interno del músculo esternocleidomastoideo, exponga y libere los CCA bilaterales y haga un nudo suelto.
    NOTA: La pluma de electrocoagulación debe estar precalentada; de lo contrario, no puede coagular rápidamente la arteria vertebral, lo que provoca una hemorragia. Ambas arterias vertebrales están electrocoaguladas y se atan nudos sueltos alrededor de las CCA.
  6. Apriete rápidamente el primer nudo suelto para bloquear el flujo sanguíneo en el CCA cuando las ratas recuperen la conciencia y muestren espasmos en las extremidades, mientras que el detector de EEG detecta las señales activas de EEG y EMG. Las ratas lucharán durante unos segundos y luego perderán gradualmente el conocimiento (Figura 1, paso 7).
  7. Después de soltar la fijación, observe que las extremidades de la rata están rígidas, el reflejo de enderezamiento desaparece, pero se mantiene la respiración. En este punto, el electromiograma (EMG) presenta una línea recta y el EEG se suprime rápidamente, lo que indica que el modelo de isquemia cerebral inducida por 4-VO fue exitoso16.
    NOTA: La depresión respiratoria ocurre en algunas ratas durante la ligadura bilateral de CCA. La estimulación mecánica rápida puede restaurar la respiración espontánea en algunas ratas.
  8. De acuerdo con el "método de amarre de control de aguja16", ate el CCA con una aguja de jeringa de 0,5 mm de diámetro utilizando hilo de nailon 6-0 a aproximadamente 1,5 cm de distancia de la bifurcación del CCA, ICA y ECA. Saca la aguja con cuidado; este segundo nudo hará que la arteria carótida se estreche posteriormente (Figura 1, paso 8).
    NOTA: La ligadura utilizada para la estenosis CCA debe estar hecha de material de nailon, que sea estable. El hilo de nailon no se ve afectado por la sangre y no se engrosa; de lo contrario, puede causar estenosis extrema del CCA en ratas y aumentar la tasa de mortalidad.
  9. Después de 30 min de isquemia, desatar el primer nudo y el CCA experimentará reperfusión, pero el segundo nudo dará lugar a una estenosis del CCA, induciendo un coma sostenido (Figura 1, paso 9). Cerrar el tejido subcutáneo con suturas monofilamento reabsorbibles y la piel con suturas monofilamento no reabsorbibles.

3. Recuperación de animales

  1. Coloque a las ratas en almohadillas aislantes e inyecte 10,000 unidades de penicilina para prevenir la infección. Inyectar por vía subcutánea 0,2 mg/kg de meloxicam durante tres días consecutivos para aliviar el dolor postoperatorio.
  2. Después de 60 minutos de reperfusión, asegúrese de que las ratas se recuperen gradualmente.

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Resultados

Debido a la inflamación y otros estímulos causados por la implantación de electrodos, el EEG puede ser inestable, por lo que las ratas necesitan recuperarse durante 3 días. Las ratas con EEG y EMG normales después de 3 días podrían incluirse para la preparación del modelo de coma. Cuando las ratas fueron anestesiadas, la actividad de EEG y EMG se suprimió ligeramente, pero procedió sin problemas. No hubo cambios significativos en la actividad del EEG y EMG después de la electrocoagulación que bloqueó los AV bilaterales. ...

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Discusión

La oclusión de cuatro vasos induce una lesión cerebral isquémica e hipóxica global, que puede simular un coma agudo, un paro cardíaco, asfixia, shock, arritmia grave y otras condiciones clínicas críticas causadas por la isquemia cerebral en la práctica clínica. Por su parte, la oclusión de cuatro vasos puede provocar daños principalmente en el hipocampo17,18, que es el área funcional principal del cerebro responsable de la memori...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82173781 y 82373835), el proyecto de investigación postdoctoral (BKS212055), el Proyecto de Innovación Científica y Tecnológica de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Foshan (2320001007331), la Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (2019A1515010806), los Proyectos de Campo Clave (Fabricación Inteligente) de las Universidades Generales de la Provincia de Guangdong (2020ZDZX2057) y los Proyectos de Investigación Científica (Innovación Característica) de General Universidades en la provincia de Guangdong (2019KTSCX195).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matriz de fotoelectrodos de microfibra de 16 canalesJiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd2605
4-0 Sutura quirúrgicaNantong Holycon Medical Devices Co., Ltd.B-104
6-0 Sutura quirúrgicaNingbo MEDICAL Needle Co., Ltd.JM1216-742417
Electrodo de EEGKedou Brain machine Technology Co., LtdKD-EEGEMG
Pluma de electrocoagulaciónCONPUVON Company465
Lunion Stage Automatic Sleep Staging SystemShanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.1336
Taladro de cráneo de mano en miniaturaRayward Life Technology Co., Ltd87001
Penicilina sódicaChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
SD ratasSPF ( Pekín ) Biotecnología Co., Ltd.180-220g
Clavo de calaveraGLOBALEBIO,LTD/
Instrumento estereotáxicoRayward Life Technology Co., Ltd68801
Zoletil 50Vic Trading (Shanghai) Co., LTDBN 88SHA

Referencias

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