Artículo de método

Visualización de la respuesta al daño del ADN en células de Purkinje mediante cultivos organotípicos cerebelosos

DOI:

10.3791/67167

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27 de diciembre de 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

En este artículo

Resumen

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Las células cerebelosas de Purkinje (PC) son particularmente sensibles a las deficiencias en la respuesta al daño del ADN. Se presenta un protocolo para la evaluación visual de la dinámica de la respuesta de la PC al daño del ADN, que implica la tinción de cadenas de poli(ADP-ribosa) unidas a proteínas dentro de cultivos organotípicos cerebelosos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células cerebelosas de Purkinje (PC) exhiben una interacción única de altas tasas metabólicas, arquitectura específica de cromatina y una amplia actividad transcripcional, lo que las hace particularmente vulnerables al daño del ADN. Esto requiere una respuesta eficiente al daño del ADN (DDR) para prevenir la degeneración cerebelosa, a menudo iniciada por la disfunción o pérdida del PC. Un ejemplo notable es el síndrome de inestabilidad del genoma, ataxia-telangiectasia (A-T), caracterizado por depleción progresiva de PC y deterioro cerebeloso. La investigación de los mecanismos de DDR en los CP es vital para dilucidar las vías que conducen a su degeneración en estos trastornos. Sin embargo, la complejidad de aislar y cultivar PCs in vitro ha obstaculizado durante mucho tiempo los esfuerzos de investigación. Los cultivos organotípicos cerebelosos murinos (en rodajas) ofrecen una alternativa factible, que imita de cerca el entorno de tejido in vivo . Sin embargo, este modelo se limita a los indicadores de DDR susceptibles de imágenes microscópicas. Hemos refinado el protocolo de cultivo organotípico, demostrando que las imágenes fluorescentes de las cadenas de poli(ADP-ribosa) (PAR) unidas a proteínas, un indicador rápido y temprano de DDR, revelan efectivamente la dinámica de DDR en PC dentro de estos cultivos, en respuesta al estrés genotóxico.

Introducción

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La integridad del ADN celular está constantemente amenazada por agentes que dañan el ADN, predominantemente subproductos metabólicos como las especies reactivas de oxígeno, que infligen decenas de miles de lesiones de ADN por célulaal día. El mantenimiento persistente de la estabilidad del genoma es esencial para la homeostasis celular 2,3. La piedra angular de este mantenimiento es la respuesta al daño del ADN (DDR), una intrincada red de señalización en capas que inicia vías específicas de reparación del ADN mientras ajusta cuidadosamente muchos otros procesos celulares. Los déficits en el DDR se manifiestan comúnmente como "síndromes de inestabilidad del genoma", caracterizados por inestabilidad cromosómica, deterioro progresivo del tejido, deterioro del crecimiento o desarrollo, predisposición al cáncer y mayor sensibilidad a determinados agentes dañinos para el ADN 6,7,8,9. En particular, la neurodegeneración, que a menudo incluye la atrofia cerebelosa, es una característica distintiva de muchos síndromes de inestabilidad genómica 7,10,11,12.

El trastorno autosómico recesivo, ataxia-telangiectasia (A-T), es un ejemplo bien documentado de trastorno de inestabilidad genómica 13,14,15. Esta condición surge de mutaciones nulas en el gen ATM (A-T, mutado), responsable de codificar la proteína quinasa fundamental, ATM, que se conoce principalmente como movilizador de DDR en respuesta a las roturas de doble cadena de ADN (DSB)16,17. La A-T se manifiesta como un trastorno multisistémico, caracterizado predominantemente por una degeneración cerebelosa progresiva, que conduce a deficiencias motoras agudas, inmunodeficiencia, atrofia gonadal, predisposición al cáncer y sensibilidad extrema a la radiación ionizante. Las células cultivadas de individuos con A-T muestran inestabilidad cromosómica y una mayor sensibilidad a los agentes genotóxicos, especialmente a los causantes de DSBs 15,18,19. Es importante destacar que la ATM también desempeña un papel en la reparación de otras lesiones del ADN, lo que subraya su amplia importancia en el mantenimiento de la estabilidad del genoma 20,21,22.

A pesar de la investigación exhaustiva sobre las numerosas funciones de la ATM, el mecanismo específico que conduce a la degeneración cerebelosa en la A-T sigue siendo un tema de debate activo, con varios modelos propuestos para dilucidar este proceso 23,24,25,26,27,28,29,30. Nuestro modelo28 sugiere que la degeneración cerebelosa en pacientes con A-T comienza con la disfunción y eventual pérdida de células de Purkinje (PC). Teniendo en cuenta el papel fundamental de la ATM en la preservación de la estabilidad del genoma frente a los daños continuos en el ADN, las PC son particularmente vulnerables a la ausencia de ATM. Atribuimos esta vulnerabilidad a la combinación de su alta actividad metabólica, su estructura distintiva de cromatina y su extensa actividad transcripcional. En última instancia, se sugiere que la pérdida de la función de las CP y, por lo tanto, su degeneración, se debe a la inactivación estocástica y funcional de los genes, una consecuencia de la producción de transcripciones defectuosas28.

El estudio de la biología del CP en el laboratorio se ve obstaculizado por los desafíos en el cultivo de PC aislados, ya que estas células dependen en gran medida de su entorno natural y de las células vecinas para sobrevivir y funcionar, lo que las hace incompatibles con el crecimiento de cultivos disociados. No obstante, los PC pueden permanecer viables durante períodos prolongados en cultivos de cortes de tejido. Los cultivos organotípicos cerebelosos, que son cortes de tejido típicamente derivados del cerebelo de roedores, mantienen la organización estructural del tejido y apoyan varias manipulaciones experimentales análogas a las posibles con células cultivadas. Por lo tanto, estos cultivos permiten estudios cerebelosos dentro de un entorno controlado 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Específicamente, en el contexto de A-T, los cultivos organotípicos cerebelosos murinos han demostrado ser fundamentales en la exploración de la DDR en CP deficientes en Atm 40,41,42,43. Mientras que los ratones deficientes en ATM muestran solo un fenotipo cerebeloso sutil 44,45,46,47, presumiblemente debido a las diferencias entre la fisiología cerebelosa humana y de ratón, la suposición es que las funciones de ATM se conservan en gran medida en estas especies. Esta noción está respaldada por nuestras observaciones de que la respuesta deficiente a los DSB de ADN en los CP mat-/- murinos se alinea con la observada en otros tipos de células murinos y humanos deficientes en ATM/Atm 40,41,42,43.

Una limitación en el análisis de las respuestas de la CP a diversos estímulos o tensiones dentro de los cultivos organotípicos es la necesidad de confiar en imágenes microscópicas para las lecturas. La DDR generalmente se estudia utilizando lecturas bioquímicas masivas, aunque también se utilizan marcadores inmunofluorescentes comunes, como el seguimiento de la dinámica de formación y resolución de focos nucleares de la histona H2AX fosforilada (γH2AX) y la proteína 53BP1, que se consideran indicadores de DSB48,49. Una medida más amplia es la obtención de imágenes fluorescentes de la formación de la cadena de poli(ADP-ribosa) (PAR) en las proteínas, una respuesta rápida y robusta al daño temprano del ADN, particularmente a las roturas de hebras 7,50. Modificamos el protocolo de Komulainen et al.51 para la tinción de PAR en cultivos organotípicos cerebelosos. Observamos una respuesta pronunciada a la PAR en los núcleos considerables de los PCs. Aquí se presenta nuestro protocolo refinado para establecer cultivos organotípicos cerebelosos murinos y para visualizar la respuesta de la PAR bajo estrés genotóxico.

Protocolo

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Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los materiales, el equipo y los anticuerpos. Los procedimientos con animales se emplearon bajo las directrices éticas del Comité de Ética de la Universidad de Tel Aviv después de la aprobación. El procedimiento se lleva a cabo en cachorros de ratón de 10 días de edad, independientemente de su sexo. Si es necesario, el genotipado se realiza el día anterior mediante una biopsia de cola y métodos estándar. Las soluciones son estériles y se almacenan a 4 °C, a menos que se indique lo contrario; véase la Tabla 1.

1. Preparación de los cultivos

NOTA: Realice el procedimiento dentro de un ambiente estéril y desinfecte la superficie de trabajo con anticipación con etanol al 70%.

  1. Agregue 1 mL de BME a cada pocillo de placas de 6 pocillos. Con pinzas estériles, colocar un único inserto de cultivo celular en cada pocillo e incubar las placas en una incubadora de CO2 a 37 °C/5% durante un mínimo de 2 h antes del procedimiento de disección.
  2. Establezca un área de disección dentro de una campana biológica, que contenga el picador de tejidos, placas de cultivo de 30 mm, un microscopio binocular y una fuente de luz.
  3. Sumerja las herramientas quirúrgicas en etanol al 70% durante todo el proceso. Use un recipiente urinario lleno de etanol al 70% para la inmersión, y un recipiente urinario separado con 1x PBS para lavar el etanol antes de usar.
  4. Para cada disección (es decir, para cada cerebelo), prepare dos placas de cultivo de 30 mm llenas de medio de disección frío y déjelas en hielo.
  5. Rocíe al animal con etanol al 70%.
  6. Con unas tijeras afiladas, decapita rápidamente al animal. Para exponer el cerebro, haga una pequeña incisión con unas tijeras lejos del cerebelo. Con unas pinzas con extremos redondeados, despegue suavemente el cráneo. Retire el cráneo en pedazos pequeños para evitar dañar el tejido cerebeloso.
  7. Transfiera inmediatamente el cerebro a un medio de disección frío o retire directamente el cerebelo del interior del cráneo. Para ello, expone el cerebelo y separa la corteza cerebelosa del tronco encefálico desconectando los tres pares de pedúnculos, utilizando una espátula de iris curvada fina. Para identificar los pedúnculos, vista desde el rostral hasta el caudal: los pedúnculos cerebelosos superiores emparejados conectan el mesencéfalo a cada lado del cerebelo; los pedúnculos cerebelosos medios emparejados conectan la protuberancia a cada lado del cerebelo; y los pedúnculos cerebelosos inferiores emparejados se conectan a la médula a cada lado del cerebelo. Una vez que el cerebelo sea visible, sepáralo del cerebro con la misma espátula: desliza la espátula entre el cerebelo, el colículo superior y el tronco encefálico.
    NOTA: No haga un esfuerzo especial para quitar las meninges, ya que se desprenden fácilmente después de cortar el cerebelo.
  8. Ajuste el picador de papel a un grosor de corte de 350 μm.
  9. Antes de colocar el cerebelo en la base del picador, retire el exceso de tampón de disección del tejido. Esto mejorará la adherencia del tejido a la base del picador.
  10. Coloque el cerebelo en la plataforma de corte en orientación vertical y realice el corte parasagital con un grosor de corte de 350 μm. Separe suavemente las rodajas con una espátula de iris fina y colóquelas en un medio de disección frío.
  11. Transfiera el tejido cortado nuevamente a un tampón de disección frío fresco. Utilice una punta de 1.000 μL para guiar delicadamente las rodajas de tejido en el plato que contiene tampón de disección en frío.
  12. Debajo de los binoculares, use dos espátulas de iris curvadas para separar cuidadosamente las rodajas de tejido entre sí. Para los cultivos, utilice cortes derivados del vermis cerebeloso situado en la zona corticonuclear medial del órgano.
  13. Transfiera cada corte de tejido a un inserto de cultivo con una espátula ancha y mueva cada inserto que lleve un corte de tejido a un pocillo en las placas de 6 pocillos que contienen el medio precalentado. Deje las placas en la incubadora.
  14. Reemplace el medio cada dos días: aspire el medio usado con una pipeta de vidrio estéril y, con una pipeta serológica de 5 mL, agregue 1 mL de MBE fresco con la punta de la pipeta apoyada en la pared del pocillo. Asegúrese de no dirigir el flujo del medio sobre el pañuelo.
    NOTA: El corte de tejido exhibirá una apariencia similar a la inflamación durante los primeros 5-7 días en cultivo y estará listo para experimentos tan pronto como este fenómeno desaparezca y hasta 2 semanas después del establecimiento del cultivo.

2. Tratamiento con agentes dañinos para el ADN, fijación, tinción e imágenes microscópicas

  1. Agregue productos químicos que dañan el ADN directamente al medio de cultivo en concentraciones finales apropiadas, durante períodos predeterminados. Después del período de exposición, elimine los productos químicos reemplazando el medio con un medio de cultivo fresco.
  2. Si la lectura de DDR implica tinción PAR, agregue un inhibidor de la poli(ADP-ribosa) glicohidrolasa (PARG) al medio de cultivo a una concentración final de 10 μM, 30 min antes de la fijación.
    NOTA: Este tratamiento es crítico ya que la modificación de PAR es de corta duración y se degrada continuamente por PARG.
  3. Inmediatamente antes de la fijación, aspire el medio y reemplácelo con 1 mL de tampón de fosfato 0,1 M a temperatura ambiente.
    NOTA: El tampón frío puede provocar el desprendimiento de las rodajas de tejido del inserto.
  4. Fije inmediatamente las lonchas sustituyendo el tampón por una mezcla de acetona:metanol preenfriada (-20 °C) (1:1) de forma que la loncha de tejido se sumerja en esta mezcla y se deje actuar durante 20 minutos a -20 °C.
    NOTA: Es posible detenerse en esta etapa y continuar con la inmunotinción más tarde. Para ello, lave los pañuelos 3 veces con tampón de fosfato 0,1 M preenfriado a 4 °C, asegurándose de que el tejido esté sumergido en el tampón. Los tejidos pueden almacenarse ahora en tampón de fosfato de 0,1M durante un máximo de 2 semanas a 4 °C.
  5. Transfiera la rebanada de tejido a un pocillo en una placa de 48 pocillos.
  6. Use un bisturí y una tabla de cortar para quitar los márgenes del inserto, cortando alrededor de la rebanada de tejido. Coloque cada rebanada en un plato de 48 pocillos. Añadir 100 μL de tampón de fosfato 0,1 M.
  7. Para la permeabilización, aspirar el tampón, añadir al pocillo 100 μL de tampón de fosfato 0,1 M que contenga Triton X-100 al 1% y dejar actuar 5 min a temperatura ambiente.
  8. Aspire la solución y agregue 100 μL de solución de bloqueo (ver Tabla 1) por pocillo. Agitar suavemente a temperatura ambiente durante 2 h.
  9. Durante la etapa de bloqueo, diluya el anticuerpo primario o el reactivo anti-PAR (1:800) en la solución de bloqueo.
  10. Retire la solución de bloqueo (no es necesario lavarla) y agregue 100 μL de mezcla de anticuerpos primarios a cada pocillo. Aplicar una agitación suave durante 2 h a temperatura ambiente.
  11. Diluir los anticuerpos secundarios en un tampón de fosfato 0,1 M que contenga Triton X-100 al 0,2% (1:500) minimizando su exposición a la luz.
  12. Aspirar la solución de anticuerpos primarios y lavar las rodajas 3 x 5 min con tampón de fosfato 0,1 M que contenga Triton X-100 al 0,2%, a temperatura ambiente, agitando suavemente.
  13. Sustituya la solución de lavado por 100 μL de solución de anticuerpos secundarios (dilución 1:500). Continúe agitando suavemente durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad (cubra las placas con papel de aluminio).
  14. Para preparar una solución de DAPI, diluya la solución madre (2 mg/mL) a 1 μg/mL en 1x PBS.
  15. Veinte minutos antes del final de las 2 h de incubación con el anticuerpo secundario, añadir 20 μL de la solución final de DAPI a cada pocillo y continuar agitando durante 20 min. Aspirar el líquido y lavar con la solución de lavado durante 3 x 5 min agitando suavemente.
  16. Para el montaje, coloque el pañuelo en un portaobjetos de vidrio para microscopio con el pañuelo hacia arriba, agregue medio de montaje y cúbralo con un cubreobjetos. Coloque las diapositivas sobre una superficie plana y déjelas secar durante la noche en la oscuridad, a temperatura ambiente (evite usar medio de montaje que contenga DAPI para evitar la borrosidad).
  17. Guarde los portaobjetos a 4 °C en una caja resistente a la luz.
  18. Capture imágenes microscópicas utilizando un microscopio confocal y filtros adecuados.

Resultados

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La Figura 1 ilustra el aspecto general de los cultivos organotípicos cerebelosos. La fila superior de la Figura 1A muestra la foliación cerebelosa, que se mantiene en cultivo, mientras que la fila inferior muestra los PCs teñidos para Calbindin D-28k (verde) y los núcleos neuronales teñidos para NeuN (rojo). En la Figura 1B, los astrocitos de los PCs (rojo) se tiñen para GFAP (verde), una proteína de filamento intermedio de tipo III. Las Figuras 2 y 3 muestran la tinción de PAR observada después de tratar estos cultivos con dos agentes dañinos para el ADN, ambos oxidantes fuertes: bromato de potasio (una concentración final de 10 mM durante 12 h) y paraquat. La respuesta a la PAR fue marcada en los CP tratados en el folio cerebeloso en comparación con el control.

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Figura 1: Descripción general de los cultivos organotípicos cerebelosos murinos. (A) La fila superior ilustra la foliación cerebelosa, que se mantiene en cultivo. La fila inferior se centra en la capa de PC. Los PC están resaltados por Calbindin D-28k (verde). La tinción de NeuN (rojo) identifica los núcleos neuronales a través de las capas. (B) Una mirada más cercana a las PC (rojo). GFAP (verde), una proteína de filamento intermedio tipo III, que destaca en los astrocitos. Barras de escala = 968,8 μm (A, fila superior), 42,1 μm (A, segunda fila), 72,7 μm (B, fila superior), 18,2 μm (B, segunda fila). Abreviaturas: PC = células de Purkinje; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Tinción de PAR en un corte cerebeloso tratado con bromato de potasio. El corte cerebeloso se trató con bromato de potasio (KBrO3), un potente agente oxidante, a una concentración final de 10 mM durante 12 h. Barras de escala = 775 μm. Abreviaturas: PAR = poli(ADP-ribosa); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Respuesta PAR en cortes cerebelosos expuestos al paraquat, un fuerte productor de aniones superóxido. (A) Una vista general de un folio cerebeloso. Obsérvese la robusta respuesta PAR, especialmente en PC, en comparación con el control. (B) Un examen más detallado muestra la respuesta PAR en PC y otros tipos de células. Barras de escala = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abreviaturas: PAR = poli(ADP-ribosa); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Soluciones y tampones
Solución  Ingredientes
Medio de disecciónSolución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene 0,5% de D-glucosa. Añadir 0,5 mL de solución de D-glucosa al 50% a 50 mL de HBSS sin Mg2+ y Ca2+.
Medio de cultivo BMEMezcle 100 mL de Basal Medium Eagle (BME) que contiene rojo de fenol pero no L-glutamina ni HEPES, con 50 mL de HBSS con rojo de fenol, 50 mL de suero de caballo inactivado por calor, 2 mL de D-glucosa al 50% y 1 mL de L-glutamina 200 mM. Mezclar y filtrar a través de un filtro de 0,22 μm en un entorno estéril. Almacenar a 4 °C
Solución bloqueante para la inmunotinciónen 0,1 M Tampón de fosfato: añadir 0,5% Triton X-100, 10% Suero de cabra
Tampón de dilución de anticuerpos secundarios0,1 M tampón de fosfato, 0,2%Triton X-100
Tampón de lavado0,1 M tampón de fosfato, 0,2%Triton X-100
Solución fijadoraActenoe:metanol (1:1 v:v)
Solución de permeabilizaciónTampón de fosfato 0,1 M, 1%Triton X-100
Solución DAPISolución madre (2 mg/mL) diluida a 1 μg/mL en 1x PBS
Tampón de fosfatoPrepare dos soulutions A y B (ver más abajo). Mezcle las soluciones de acuerdo con las proporciones especificadas a continuación para formar un tampón de fosfato de 0,2 M. A continuación, diluir la solución 0,2M con DDW (1:1) para hacer un tampón de fosfato 0,1 M (solución de trabajo).
solución A (para 0,2 M)12 g de Fosfato Sódico Monobásico Anhidro (Na2HPO4 FW 141.96)
500 mL de DDW
Solución B (para 0,2 M)14,2 g de Fosfato sódico diabásico anhidro (Na2HPO4 FW 141.96)
500 mL de DDW
Soluciones mixtas para hacer 0,2 MPreparar 1 L: 230 mL de solución A y 770 mL de solución B
Tampón de fosfato de 0,1 MDiluir la solución mezclada con DDW (1:1)

Tabla 1: Soluciones y su composición.

Discusión

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Observaciones generales
La principal ventaja del sistema de cultivo organotípico es que facilita los estudios utilizando el tejido de la corteza cerebelosa, preservando su organización estructural durante varias semanas en la configuración de la placa de cultivo. Este sistema es útil para realizar análisis morfológicos en profundidad de las células de Purkinje (PC), incluidos exámenes detallados de las espinas dendríticas y las características ultraestructurales 52,53,54,55,56,57,58,59. Nuestras observaciones indican que la respuesta al daño del ADN (DDR) es notablemente activa en los CP dentro de estos cultivos. Sin embargo, las principales limitaciones de este sistema incluyen la duración limitada de su uso y su dependencia de la imagen microscópica para monitorear los procesos celulares, lo que pone de relieve la necesidad continua de desarrollar o adaptar técnicas de imagen adecuadas.

Otra palabra de precaución se refiere a la porción cerebelosa que se disecciona para preparar las rodajas de tejido. Hemos observado que diferentes lóbulos cerebelosos pueden producir cultivos con una organización interna y una calidad general marcadamente diferentes. Por lo tanto, preferimos establecer cultivos a partir de cortes obtenidos a través de secciones sagitales medias del vermis cerebeloso. En estos cortes, las folias de la corteza cerebelosa son convenientemente visibles.

Es aconsejable utilizar cortes de tejido obtenidos del vermis cerebeloso, que exhiben la foliación característica de la corteza cerebelosa. Estos sectores mantienen su estructura organizativa en cultura durante varias semanas. Además, se recomienda iniciar los procedimientos experimentales con los cultivos aproximadamente 7-12 días después del establecimiento. Un experimento típico diseñado para evaluar la respuesta al daño del ADN en estos cultivos consiste en iniciar el daño por irradiación o por la adición de productos químicos que dañan el ADN al medio de cultivo. Posteriormente, la fijación y tinción del tejido se realizan en varios intervalos de tiempo. Para evaluar la recuperación del daño inducido por productos químicos, se incluye un período de incubación en medio fresco. Es aconsejable iniciar experimentos a largo plazo lo antes posible, idealmente alrededor de los 7 días después del establecimiento del cultivo.

Los cultivos organotípicos cerebelosos se mantienen en un medio desprovisto de antibióticos; Por lo tanto, es imperativo mantener un entorno estéril durante su establecimiento. La edad de las crías de las que se cosecha la cerebela es crítica, con un rango recomendado de 9-12 días. Este rango de edad es óptimo ya que la corteza cerebelosa está lo suficientemente desarrollada para la sección. En particular, en los animales mayores, los tejidos tienden a adherirse a la hoja. Es crucial mantener el cerebelo sumergido en una solución de disección fría hasta que se diseccione.

Durante los primeros 5-7 días en cultivo, los cortes de tejido pueden mostrar signos que recuerdan a la inflamación, caracterizada por hinchazón y decoloración lechosa. Estos atributos pueden afectar potencialmente la medición de los parámetros fisiológicos y la eficacia de las técnicas de inmunotinción.

Se recomienda encarecidamente no cortar el cerebelo a menos de 350 μm para evitar inconsistencias en el grosor durante el corte. Tenga en cuenta que un tejido de 350 μm se vuelve mucho más delgado después de 7 días en cultivo a alrededor de 90 μm (según la medición de la pila Z).

Aquí, introducimos la tinción PAR 7,50 en el kit de herramientas utilizado para investigar el DDR en PC. Esta lectura es rápida, sensible y captura la naturaleza dinámica de la DDR, lo que resulta especialmente útil en nuestro análisis de la DDR en PC de tipo salvaje y deficientes en ATM. Los protocolos descritos aquí deberían ser particularmente beneficiosos para los investigadores que estudian los síndromes de inestabilidad genómica que afectan al cerebelo.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses relacionados con este estudio.

Agradecimientos

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El trabajo en nuestro laboratorio cuenta con el apoyo de la Fundación de Investigación Médica Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson y la Asociación Israelí para la Lucha contra la Enfermedad A-T.

Materiales

Anticuerpos

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo y equipo
150 x 30 cm Placade Petri Corning Inc.3261
Placa de Petri de 35 x 10 mmCorning Inc.3294
AcetonaInvitrogen25030081
AcetonaSigma-Aldrich270725-1L
Portaobjetos adhesivos para microscopioMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Cuchillas para picadoraTED PELLAModelo TC752-1  Referencia Hojas de Afeitar
BMEGIBCO41010-026 500ml. Sin L-Glut
Insertos de cultivo celularMilliporePICM0RG50
D-GlucosaBiológico Indo.02-015-1A
HBSS sin rojo fenolSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+,No Mg+
HBSS con rojo fenolSartorius02-015-1A
Suero de caballo GIBCO26050088inactivada por calor
CellPathGZX-0100-00Airis dentada roma de 130 mm
F.S.T10092-12
L-Glutamina (200 mM)Gibco41010026
MetanolSigma-Aldrich322412-1L
Metanol Microscopio Sigma-AldrichG5767
Olympus
Medio de montaje sinGRIGENE. Ltd, IsraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGDicloruro de paraquat (viológeno de metilo)
PARG- Inhibidor de la glicohidrolasa poli(ADP-ribosa)Tocris Bioscience, Reino UnidoPDD 00017273sensible a la luz 
Tampón de fosfatoBiológico Indo.02-018-1A
Tijeras, tejido
Placas de seis pocillosCorning incorporadasCLS3516
discos de corte de repuesto TED PELLAModelo 10180-01
Picadora de tejidosMcIlwainModelo TC75210180-220
Pinzas puntiagudas
Tazas urinarias
Alexa fluor 488 burro anti Conejo IgG 
Invitrogen		A212061:500; ab secundario; Tampón de dilución secundario;   Incubación durante 2 h a temperatura ambiente
Anti glial fibrilar ácido protienMilliphoreMAB34021:1500; ab primario; bloqueo; Anfitrión:ratón
Anti-calbindina-D-28KSwant CB3001:2000; ab primario; bloqueo; huésped: conejo 
Anti-calbindina-D-28KSwantCB-38a1:2000; ab primario; bloqueo 
Reactivo anti-pan-ADP-ribosaMilíforoMABE10161:800; ab primario; bloqueo; incubación durante 2 h a temperatura ambiente
DAPI (4',6-diamidina-2'-fenilindol diclorhidrato)Señalización celular40841:1000; tampón de dilución secundario; incubación durante 20 min a temperatura ambiente
pinza de iris Espátula de cutáneo

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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