Aquí, presentamos un protocolo para recolectar y procesar muestras de amígdalas, fenotipar utilizando citometría de flujo espectral de alta dimensión y realizar análisis no supervisados.
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Artículo de método
Aquí, presentamos un protocolo para recolectar y procesar muestras de amígdalas, fenotipar utilizando citometría de flujo espectral de alta dimensión y realizar análisis no supervisados.
Las células foliculares auxiliares T (Tfh) son un subconjunto de células T auxiliares CD4+ que ayudan en el cambio de isotipo de las células B, la formación del centro germinal (GC), la hipermutación somática y la maduración de la afinidad, lo que ayuda a orquestar respuestas inmunitarias humorales adaptativas en los tejidos linfoides secundarios durante la infección, la autoinmunidad y la vacunación. Comprender el desarrollo y la función de las células Tfh es crucial para diseñar vacunas efectivas y desarrollar estrategias de tratamiento dirigidas para enfermedades que involucran a esta población. Las células de las amígdalas humanas son órganos linfoides mucosos accesibles. Ofrecen una oportunidad única para perfilar distintas poblaciones inmunitarias como las células Tfh y GC, interrogar las interacciones de célula a célula, evaluar las funciones celulares dinámicas y descubrir sus mecanismos reguladores a nivel de órganos. Además, los cultivos in vitro de células de amígdalas son fáciles de procesar y permiten la evaluación de la biología de las células Tfh en diversas condiciones. Aquí, presentamos un protocolo para la recolección, aislamiento, preservación y cultivo de células de amígdalas humanas. También describimos dos paneles de citometría de flujo espectral optimizados diseñados para la caracterización en profundidad de células Tfh. Por último, utilizando como ejemplo el tratamiento con un inhibidor de la proteína fosfatasa 2A (PP2A), demostramos la eficiencia y el poder de los análisis no supervisados de datos de citometría de flujo de alta dimensión, descubriendo de manera efectiva las diferencias inducidas por el tratamiento a una escala de alta dimensión.
Las células foliculares auxiliares T (Tfh) son un subconjunto distinto de células T auxiliares CD4+ que son esenciales para la formación y función de los centros germinales (GC) y la producción de anticuerpos de células B. Las células Tfh se originan a partir de células T CD4+ vírgenes a través de interacciones con células presentadoras de antígenos y la integración de factores intrínsecos y extrínsecos, incluida la señalización del receptor de células T, las interacciones coestimulatorias con células B, citocinas y quimiocinas1. Las células Tfh expresan CXCR5 y PD-1, que guían su posición....
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Se siguió el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) en todas las investigaciones en humanos de este estudio. Se obtuvieron muestras de amígdalas humanas de pacientes con hipertrofia adenoamigdalar que causa trastornos respiratorios del sueño o apnea obstructiva del sueño, procedentes de la División de Otorrinolaringología Pediátrica del Hospital Nacional de Niños, Washington, DC, EE. UU. Este estudio recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Children's National Hospital (número de protocolo 00009806 del IRB). El consentimiento informado fue firmado por los padres o tutores....
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Para comparar la viabilidad celular general, cortamos la amígdala en tres partes similares y las procesamos utilizando nuestro protocolo bajo tres condiciones: (1) procesamiento en el mismo día, (2) almacenamiento nocturno a 4 °C y (3) almacenamiento nocturno en hielo. La viabilidad entre estas tres condiciones fue bastante similar, sin ninguna diferencia significativa (Figura 1A). También evaluamos el impacto del proceso de descongelación en la viabilidad de las células. El método de descon.......
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En contraste con informes previos de que las amígdalas frescas deben procesarse dentro de las 3 horas posteriores a la cirugía19, encontramos que las muestras de amígdalas frescas podrían mantener su viabilidad cuando se almacenan a 4 °C y se procesan dentro de las 24 h. Para optimizar la viabilidad celular del tejido de las amígdalas al descongelarse del almacenamiento de nitrógeno líquido, adoptamos el método de descongelación gota a gota recomendado en la secue.......
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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Esta investigación fue apoyada por la División de Investigación Intramuros del NIAID, NIH.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Máquinas e instrumentos | |||
| 3 mL Jeringa de plástico | BD | 309657 | |
| 96 pocillos U Placa inferior | Thermo Scientific | 163320 | |
| 1.2 mL Viales criogénicos | Corning | 430487 | |
| Filtro celular 70 µ m Plato de cultivo celular Nylon | Falcon | 352350 | |
| (60 mm) | VWR | 10062-890 | |
| Centrífuga | Thermo | Scientific Sorvall Legend XTR | |
| Benchmark B2000-2 MyBath 2L Baño de agua digital | Benchmark | B2000-2 | |
| Tijeras finas - Sharp | F.S.T | 14060-11 | |
| de plástico para instrumentos | F.S.T | 20830-05 | |
| Citómetro de flujo espectral, Aurora | Cytek | 5L 16UV-16V-14B-10YG-8R | |
| Pinzas de patrón estándar | FST | 11000-13 | |
| Pinzas de patrón estándar | FST | 11000-20 | |
| Analizador de viabilidad celular Vi-cell Blu | Beckman Coulter | C19201 | |
| Reagents | |||
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality Biology | 351-027-101 | |
| 2-Mercaptoetanol | Gibco | 21985-023 | |
| Tampón de lisa ACK | Gibco | A10492-01 | |
| Mezcla de antibióticos-antimicóticos (Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B Suspensión, 100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Tampón de tinción brillante Plus (RUO) | BD | 566385 | |
| Cantaridina | Tampón de fijación Sigma | C7632-25MG | |
| Cytofix | BD | 554655 | |
| Dimetil sulfóxido (DMSO) | Sigma | D8418-250ml | |
| DNAasa I | Roche | 10104159001 | |
| fetal Suero bovino (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FoxP3/Juego de tampones de tinción de factor de transcripción | eBioscience | 00-5523-00 | |
| Gentamicina (50 mg/ml) | Gibco | 15750-060 | |
| Golgiplug | BD | 555029 | |
| GolgiSTOP | BD | 554724 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Sigma de | ionomicina | I0634-1mg | |
| L-glutamina (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Solución de paraformaldehído al 16%, grado EM (PFA) | Microscopía electrónica Science | 15710 | Diluido con PBS |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010072 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA) | Sigma | P8139-1mg | |
| Recipientes de congelación de velocidad controlada | Millipore | Corning CoolCell FTS30 | |
| RPMI (+L-Glutamina) | Gibco | 11875-085 | |
| Piruvato de sodio (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Bloqueador de monocitos de tinción verdadera | BioLegend | 426103 | |
| Buffers | |||
| 10% FBS inactivado por calor (VWR), 2 nM de glutamina, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 1% de penicilina/ estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, 10 mM HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales en RPMI (+L-glutamina) | |||
| Tampón | 2 mM EDTA y 2% de FBS inactivado por calor en PBS | ||
| Medio | 90% de FBS inactivado por calor y 10% de | ||
| DMSO Tampón | Tampón de lavado + 0,1 mg/ml de DNasaI | ||
| Medio | de amígdalasRPMI suplementado con FBS inactivado por calor al 5%, 10 mM de glutamina, 0,05 mg/mL de gentamicina, mezcla de antibióticos-antimicóticos al 1% (penicilina, estreptomicina y anfotericina B). | ||
| Tampón | RPMI (+L-glutamina) suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y 10 mM HEPES | ||
| anticuerpos y otros regentes para el panel de citoquinas | |||
| Biotina anti-CD107a humano (LAMP-1) Anticuerpo | BioLegend | 328604 | 2 μ L en 200 μ L medio de cultivo completo por pocillo. Este anticuerpo se agregó con las células durante la estimulación con PMA/ionomicina. |
| Tinción de muertos vivos | 100 μ L mezcla por pocillo | ||
| LIVE DEAD Blue | Thermo | L23105 | 1 : 800, 0.125 μ L en 100 μ L PBS por pozo. |
| Bloque de monocitos | 50 μ L mezcla por pocillo | ||
| Tampón bloqueador de monocitos | BioLegend | 426103 | 5 μ L True Stain bloqueador de monocitos y 45 μ L Tampón FACS por pocillo |
| < anticuerpos fuertes > superficie para panel de citoquinas< / fuerte > | |||
| receptores de quimiocinas | L/pozo | ||
| Antihumano CCR6-BV711 | BioLegend | 353436 | 1 |
| Antihumano CCR7-BV421 | BioLegend | 353208 | 1 |
| Antihumano CXCR3-PE-Cy5 | BD | 551128 | 5 |
| Antihumano CXCR5-BV750 | BD | 747111 | 1 |
| Tampón de tinción brillante Plus (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| 18 μ L mezcla por pocillo para receptores de quimiocinas; Añadir dirigido a las células con el tampón | |||
| Other mezcla de anticuerpos de superficie | μ L/pozo | ||
| Antihumano CD103-BUV661 | BD | 749993 | 2.5 |
| Antihumano CD14-Spark Blue 550 | BioLegend | 367148 | 2.5 |
| Antihumano CD19-Spark NIR 685 | BioLegend | 302270 | 2.5 |
| Antihumano CD25-BB515 | BD | 564467 | 10 |
| Antihumano CD27- Super Bright 436 | Thermo | 62-0279-42 | 5 |
| Antihumano CD3-BV510 | BioLegend | 344828 | 2.5 |
| Antihumano CD38 APC-Fire810 | BioLegend | 303550 | 1 |
| Antihumano CD4 CF YG584 | Cytek | R7-20041 | 2.5 |
| Antihumano CD45RA-BUV395 | BD | 740315 | 0.6 |
| Antihumano CD56-BUV737 | BD | 612766 | 3.5 |
| Antihumano CD57-FITC | BioLegend | 359604 | 1.2 |
| Antihumano CD69-BUV563 | BD | 748764 | 1 |
| Antihumano CD8-BUV805 | BD | 612889 | 1.2 |
| Antihumano FAS-BB700 | BD | 566542 | 0.6 |
| Antihumano HLA-DR APC-Fire 750 | BioLegend | 307658 | 2 |
| Anti-humano PD1-BV785 | BioLegend | 329929 | 1.2 |
| Anti-humano-CD45-PerCP | Thermo | MHCD4531 | 1.2 |
| Brilliant Stain Buffer Plus (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| Tampón | 61 | ||
| 112 μ L mezcla por pocillo para otros anticuerpos de superficie; Añadir directamente al tampón de bloque de monocitos (50 μ L) y la mezcla de receptores de quimiocinas (18 μ L, 50 + 18 + 112 = 180 μ L en total por pocillo) | |||
| Anticuerpos de citocinas intracelulares para panel de citocinas | μ L/pozo | ||
| Antihumano Granzyme B-PE | BD | 561142 1 | |
| Antihumano IL10-PE-Dazzle 594 | BioLegend | 506812 | 1 |
| Antihumano IL17A-BV605 | BioLegend | 512326 | 1 |
| Antihumano IL2-BV650 | BioLegend | 500334 | 3 |
| Antihumano IL21- Alexa Fluor 647 | BD | 560493 | 10 |
| Antihumano IL4-PerCP Cy5.5 | BD | 561234 | 1 |
| Anti-perforina-APC | BioLegend | 353312 | 2.5 |
| Anti-humano TNFa-PE-Cy7 | BioLegend | 502930 | 0.1 |
| Anti-IFNγ-Pacific Blue | BioLegend | 502522 | 1 |
| SAv-BUV615 | BD | 613013 | 0.25 |
| Tampón de tinción brillante Plus (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| 1x tampón de permeabilización | eBiociencia | 00-5523-00 | 19.15 |
| (50 μ L mezcla por pocillo) | |||
| Anticuerpos y otros regentes para el panel de factores de transcripción | |||
| CD40 Anticuerpo, antihumano | Miltenyi Biotec | 130-094-133 | 0,5 μ g/ml de medio de cultivo para concentración de trabajo |
| tinción de muertos vivos | 100 μ L mezcla por pocillo | ||
| LIVE DEAD Blue | Thermo | L23105 | 1 : 800, 0.125 μ L en 100 μ L PBS por pozo. |
| Tampón bloqueador de monocitos | BioLegend | 426103 | 5 μ L True Stain bloqueador de monocitos y 45 μ L Tampón FACS por pocillo |
| Anticuerpos de superficie para panel de factores de transcripción | |||
| Mezcla de receptores de quimiocinas | μ L/pozo | ||
| Antihumano CCR6-BV711 | BioLegend | 353436 | 1 |
| Antihumano CCR7-BV421 | BioLegend | 353208 | 1 |
| Antihumano CXCR5-BV750 | BD | 747111 | 1 |
| Tampón de tinción brillante Plus (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| 13 μ L mezcla por pocillo | |||
| Otra mezcla de anticuerpos de superficie | μ L/pozo | ||
| Antihumano 4-1BB-PE-CY7 | BioLegend | 309818 | 2.5 |
| Antihumano CD14-Spark Blue 550 | BioLegend | 367148 | 2.5 |
| Antihumano CD19-Spark NIR 685 | BioLegend | 302270 | 2.5 |
| Antihumano CD200-PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher | 46-9200-42 | 2.5 |
| Antihumano CD25-PE-Cy5 | BioLegend | 302608 | 5 |
| Antihumano CD3-BV510 | BioLegend | 344828 | 2.5 |
| Antihumano CD38-APC-Fire810 | BioLegend | 303550 | 1 |
| Antihumano CD4-Pacific Blue | BioLegend | 317423 | 1 |
| Antihumano CD40L-PE | BD | 557299 15 | |
| Antihumano CD45RA-BUV395 | BD | 740315 | 0.6 |
| Antihumano CD56-BUV737 | BD | 612766 | 3.5 |
| Antihumano CD69-BUV650 | BioLegend | 310934 | 2.5 |
| Antihumano CD8-BUV805 | BD | 612889 | 1.2 |
| Antihumano HLA-DR APC-Fire 750 | BioLegend | 307658 | 2 |
| Antihumano ICOS-BUV563 | BD | 741421 | 1.2 |
| Antihumano OX40-APC | BioLegend | 350008 | 5 |
| Anti-humano PD1-BV785 | BioLegend | 329929 | 1.2 |
| Anti-humano-CD45-PerCP | Thermo | MHCD4531 | 1.2 |
| Brilliant Stain Buffer Plus (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| Tampón | 54.1 | ||
| 117 μ L mezcla por pocillo para otros anticuerpos de superficie; Añadir directamente al bloque de monocitos tampón (50 μ L) y la mezcla de receptores de quimiocinas (13 μ L, 50 + 13 + 117 = 180 μ L en total por pocillo) | |||
| Virus del factor de transcripción para el panel del factor de transcripción | μ L/pozo | ||
| Antihumano T-bet-BV605 | BioLegend | 644817 | 4 |
| Antihumano Bcl6-PE-CF594 | BD | 562401 | 4 |
| Antihumano FoxP3-Alexa Fluor 488 | BD | 560887 | 1.6 |
| Antihumano GATA3-BB700 | BD | 566642 | 2 |
| Antihumano Ki67-Alexa Fluor 700 | BD | 561277 | 0.4 |
| Antihumano Rorgt-Alexa Fluor 647 | BD | 563620 | 2 |
| Tampón de tinción brillante Plus (RUO) | BD | 566385 | 10 |
| 1 x Tampón de permeabilización | eBioscience | 00-5523-00 | 16 |
| 40 μ L mezcla por well | |||
| Software y paquetes para análisis no supervisados | |||
| Software/package | Version | Source | |
| 1 | data.table | 1.16.2 | La red integral de archivos de R |
| 2 | FlowJO | 10.9.0 | Becton, Dickinson and Company |
| 3 | mapa de referencia | 1.0.12 | La red de archivos R integral |
| 4 | R | 4.3.2 | La red de archivos R integral |
| 5 | readxl | 1.4.3 | La red de archivos R integral |
| 6 | Rstudio | 2023.12.1+402 | Posit PBC |
| 7 | Seurat | 5.1.0 | La red de archivos R integral |
| 8 | SeuratData | 0.2.2.9001 | La red integral de archivos R |
| 9 | SpectroFlo | 3.0 | Cytek |
| 10 | tidyverse | 2.0.0 | La red integral de archivos R |
| 11 | viridis | 0.6.5 | La red integral de archivos R |
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