Procesamiento eficiente de células foliculares auxiliares T amigdalares y análisis funcional a través de citometría de flujo de alta dimensión

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para recolectar y procesar muestras de amígdalas, fenotipar utilizando citometría de flujo espectral de alta dimensión y realizar análisis no supervisados.

Abstract

Las células foliculares auxiliares T (Tfh) son un subconjunto de células T auxiliares CD4⁺ que ayudan en el cambio de isotipo de las células B, la formación del centro germinal (GC), la hipermutación somática y la maduración de la afinidad, lo que ayuda a orquestar respuestas inmunitarias humorales adaptativas en los tejidos linfoides secundarios durante la infección, la autoinmunidad y la vacunación. Comprender el desarrollo y la función de las células Tfh es crucial para diseñar vacunas efectivas y desarrollar estrategias de tratamiento dirigidas para enfermedades que involucran a esta población. Las células de las amígdalas humanas son órganos linfoides mucosos accesibles. Ofrecen una oportunidad única para perfilar distintas poblaciones inmunitarias como las células Tfh y GC, interrogar las interacciones de célula a célula, evaluar las funciones celulares dinámicas y descubrir sus mecanismos reguladores a nivel de órganos. Además, los cultivos in vitro de células de amígdalas son fáciles de procesar y permiten la evaluación de la biología de las células Tfh en diversas condiciones. Aquí, presentamos un protocolo para la recolección, aislamiento, preservación y cultivo de células de amígdalas humanas. También describimos dos paneles de citometría de flujo espectral optimizados diseñados para la caracterización en profundidad de células Tfh. Por último, utilizando como ejemplo el tratamiento con un inhibidor de la proteína fosfatasa 2A (PP2A), demostramos la eficiencia y el poder de los análisis no supervisados de datos de citometría de flujo de alta dimensión, descubriendo de manera efectiva las diferencias inducidas por el tratamiento a una escala de alta dimensión.

Introduction

Las células foliculares auxiliares T (Tfh) son un subconjunto distinto de células T auxiliares CD4⁺ que son esenciales para la formación y función de los centros germinales (GC) y la producción de anticuerpos de células B. Las células Tfh se originan a partir de células T CD4⁺ vírgenes a través de interacciones con células presentadoras de antígenos y la integración de factores intrínsecos y extrínsecos, incluida la señalización del receptor de células T, las interacciones coestimulatorias con células B, citocinas y quimiocinas¹. Las células Tfh expresan CXCR5 y PD-1, que guían su posición dentro o cerca del GC. BCL-6 es el factor de transcripción maestro crítico para el desarrollo, el mantenimiento y la función de Tfh ^1,2. Las células Tfh son fundamentales para el montaje de las respuestas inmunitarias humorales, especialmente en las respuestas a las vacunas y en la defensa contra patógenos bacterianos y virales. Las respuestas anormales de las células Tfh están implicadas en diversos trastornos, como las enfermedades autoinmunes, la inmunodeficiencia y, potencialmente, algunas formas de cáncer 3,4,5,6. Por lo tanto, comprender su función y regulación es importante para desarrollar estrategias terapéuticas y de vacunas efectivas⁷.

A diferencia de otras células T auxiliares CD4⁺ como Th1, Treg y Th17, para las que los sistemas de diferenciación in vitro están bien establecidos⁸, las células Tfh son más complejas de estudiar porque su desarrollo implica interacciones dinámicas de célula a célula y estructuras anatómicas especializadas⁷. Por lo tanto, los estudios de las células Tfh se han basado en gran medida en el fenotipado ex vivo de células Tfh circulantes periféricas humanas (cTfh) y modelos de ratón in vivo . Por lo tanto, investigar la regulación de moléculas específicas en las células Tfh es un desafío, particularmente para las células Tfh humanas⁹. Por lo tanto, un estudio ex vivo en profundidad de las células Tfh derivadas de tejidos linfoides es esencial para mejorar nuestra comprensión de las células Tfh humanas.

Las amígdalas, como órganos linfoides secundarios, albergan poblaciones celulares únicas que no están presentes en la sangre periférica, como las células pre-Tfh (CXCR5^intPD-1^int CD4⁺) y GC-Tfh (CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺), las cuales son fundamentales en la formación de GC. Además, las amígdalas palatinas son algunos de los tejidos más comúnmente extirpados en las cirugías pediátricas y son fácilmente accesibles, lo que las convierte en una fuente invaluable de tejido humano para explorar mecanismos inmunológicos complejos que involucran a las células Tfh. Debido a que están situadas en las vías respiratorias superiores, un sitio primario para las infecciones virales respiratorias, las amígdalas ofrecen un tejido ventajoso para investigar las respuestas inmunitarias a tales infecciones virales. Por ejemplo, nuestro laboratorio caracterizó previamente células Tfh en amígdalas y adenoides de niños que habían convaleciente de COVID-19 y comparó estos tejidos con los de controles no infectados¹⁰. Aquí, describimos nuestro protocolo para procesar y almacenar las células de las amígdalas. Utilizando amígdalas tratadas con inhibidores de PP2A como ejemplo, detallamos cómo caracterizar estas células a través de citometría de flujo espectral de alta dimensión y analizamos los datos mediante análisis no supervisados.

Protocol

Se siguió el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) en todas las investigaciones en humanos de este estudio. Se obtuvieron muestras de amígdalas humanas de pacientes con hipertrofia adenoamigdalar que causa trastornos respiratorios del sueño o apnea obstructiva del sueño, procedentes de la División de Otorrinolaringología Pediátrica del Hospital Nacional de Niños, Washington, DC, EE. UU. Este estudio recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Children's National Hospital (número de protocolo 00009806 del IRB). El consentimiento informado fue firmado por los padres o tutores de todos los participantes inscritos, y se obtuvo el asentimiento de los participantes menores de 7 años en adelante.

1. Recolección de amígdalas humanas y aislamiento y almacenamiento de una sola célula

1. Aislamiento de células individuales amigdalinas
   1. Recogida de muestras quirúrgicas
      1. Obtener amígdalas de pacientes sometidos a amigdalectomía y recoger los trozos de tejido fresco en el quirófano en un tubo centrífugo de 50 mL lleno de 25-35 mL de medio amígdalo estéril helado: RPMI suplementado con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 5%, 0,05 mg/mL de gentamicina, 10 mM de glutamina y mezcla de antibióticos y antimicóticos (100 unidades/mL de estreptomicina, 100 unidades/mL de penicilina, y 0,25 μg/mL de anfotericina B).
         NOTA: Las amígdalas en el medio anterior pueden almacenarse a 4 °C durante la noche y procesarse al día siguiente. Se observó una pérdida mínima de viabilidad celular con el almacenamiento nocturno en comparación con el procesamiento en el mismo día (Figura 1A). Las amígdalas también se pueden enviar durante la noche en hielo.
   2. Procesamiento de amígdalas
      NOTA: Todos los medios, tampones e instrumentos quirúrgicos deben ser estériles, y el aislamiento de las células de las amígdalas debe realizarse con hielo en una capucha de bioseguridad.
      1. Coloque las amígdalas en una placa de cultivo celular de plástico de 60 mm que contenga 5 mL de medio de amígdalas enfriado. Trabajar sobre hielo. Con pinzas y tijeras estériles o un bisturí, retire con cuidado los coágulos de sangre, la grasa y el tejido conectivo visibles (Figura 1B, C).
      2. Mueva las amígdalas a una nueva placa de cultivo celular de 60 mm con 5 mL de medio de amígdalas helado. Corta los trozos de amígdalas en fragmentos de 3-5 mm.
      3. Prepare una nueva placa de cultivo celular de 60 mm con 10 mL de medio amígdalo frío y coloque un colador de células de 70 μm en la placa.
      4. Mueva los fragmentos de amígdalas al colador y aplaste los fragmentos de amígdalas usando el extremo del émbolo de una jeringa estéril de 3 ml a través del colador.
      5. Recoja el medio que contiene células fuera del colador en el plato y transfiéralo a un tubo cónico de 50 ml.
      6. Agregue 10 ml adicionales de medio para amígdalas al plato con el colador, aplaste los fragmentos de amígdalas con el émbolo y recoja el medio en el tubo cónico. Para amígdalas grandes, repita este paso 2-3 veces más hasta que solo queden fragmentos de tejido conectivo en el colador. Coloque el pañuelo restante y las placas usadas en una bolsa de riesgo biológico y en los desechos médicos.
      7. Llene el tubo cónico de 50 ml hasta la parte superior con medio para amígdalas.
      8. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
         NOTA: Extender la centrifugación a 20 minutos puede aumentar el rendimiento.
      9. Retire el sobrenadante aspirando o pipeteando cuidadosamente y vuelva a suspender el pellet en 5 ml de tampón de lisado de amonio-cloruro-potasio (ACK) a temperatura ambiente (RT) para lisar los glóbulos rojos. Incube durante 5 minutos a RT, luego agregue 35 ml de PBS enfriado para evitar una mayor lisis. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
      10. Lavar una vez con 50 mL de PBS frío y centrífuga. Vuelva a suspender con 10 mL de PBS y cuele las células a través de un colador de plástico de 70 μm. Contar celdas.
2. Criopreservación de células amigdalaras
   1. Prepare el medio de congelación (90% de FBS inactivado por calor y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO)).
      NOTA: Puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   2. Centrifugar la suspensión celular (paso 1.1.2.10) a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con medio de congelación.
      NOTA: Aconsejamos congelar las células a una densidad de 10 × 10⁶ a 50 × 10⁶ células/mL de medio de congelación¹¹.
   3. Alícuota 0,5-1 mL de la suspensión celular en crioviales estériles. Congele los viales en recipientes de congelación con control de velocidad en un congelador de -80 °C. Transfiera los viales a un tanque de almacenamiento que contenga nitrógeno líquido dentro de una semana para su conservación a largo plazo.
3. Descongelación de células congeladas
   NOTA: A continuación se describe un enfoque de descongelación por dilución secuencial al que se hace referencia a partir de un protocolo de preparación de muestras para la secuenciación de ARN de una sola célula¹². Otros métodos de descongelación también pueden funcionar, pero encontramos una mayor viabilidad celular con este enfoque en comparación con la colocación inmediata de células en un tampón de descongelación caliente (Figura 1D). El tampón de lavado se puede preparar con anticipación. El tampón de descongelación se compone de tampón de lavado más 0,1 mg/ml de DNasa I (la DNasa I debe agregarse justo antes de comenzar la descongelación). Aumentar el tiempo de centrifugación a 1 min/mL (para tubos de 15 mL) es opcional para aumentar el rendimiento de la celda.
   1. Calentar un baño de agua a 37 °C. Precalentar el tampón de descongelación y lavado en el baño de agua a 37 °C.
      NOTA: Todos los lavados celulares se realizan en RT.
   2. Descongele los crioviales en el baño de agua a 37 °C durante 2-3 minutos inmediatamente después de retirarlos del almacenamiento. Evite sumergir completamente el vial en el baño de agua. Retire el vial del baño de agua mientras queda visible un pequeño cristal de hielo.
   3. Transfiera suavemente las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml utilizando una punta de pipeta de diámetro ancho en una campana de bioseguridad. Enjuague el criovial con 0,5 mL de tampón de descongelación precalentado y agregue el enjuague gota a gota (1 gota cada 5 s) al tubo cónico de 15 mL, agitando suavemente el tubo para mezclar.
   4. Diluya las células secuencialmente en el tubo cónico de 15 mL agregando gradualmente 2 mL y luego 4 mL de medio con un tiempo de espera de ~ 1 min entre adiciones. Agregue medio a una tasa de 1 mL cada 3-5 s al tubo, girando suavemente para mezclar.
   5. Centrífuga a 400 × g durante 5 min a RT.
   6. Retire el sobrenadante; resuspender el pellet celular en 300 μL de tampón de descongelación; e incubar en RT durante 5 min.
   7. Añadir 10 mL de tampón de lavado (sin DNasa I). Centrifugar de nuevo a 400 × g durante 5 min en RT.
   8. Lavar una vez más: retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 10 mL de tampón de lavado. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a RT.
   9. Filtre las células a través de un colador de 70 μm. Vuelva a centrifugar durante 5 minutos a 400 × g a RT y cuente las células. Volver a suspender en medio de cultivo.

2. Medición de la expresión de citocinas intracelulares y factores de transcripción después del tratamiento ex vivo

NOTA: Aquí, detallamos nuestro método para la caracterización fenotípica de las células Tfh amigdalinas utilizando dos paneles de citometría de flujo de alta dimensión. Dado que la actividad de PP2A es esencial para la expresión óptima de la proteína BCL-6 y la diferenciación de Tfh⁴, ilustramos nuestra evaluación del mantenimiento y la funcionalidad de las células Tfh mediante el examen de células de amígdalas tratadas con el inhibidor de PP2A cantaridina (CAN).

1. Tinción por citometría de flujo
   1. Tinción de citocinas intracelulares
      NOTA: Las incubaciones se realizan en la oscuridad. Los reactivos, anticuerpos y sus respectivas cantidades por pocillo utilizado en ambos paneles se enumeran en la Tabla de Materiales. Para evaluar la degranulación de las células T, se añade el anticuerpo anti-CD107a durante la etapa de tratamiento para minimizar los resultados falsos negativos causados por su internalización¹³.
      1. Placa 2 × 10⁶ células de amígdalas con 200 μL de medio de cultivo (1 × 10⁷ células/mL) en un pocillo de placa inferior de 96 pocillos en U con las siguientes cantidades de inhibidor de PP2A CAN durante 16 h: control del vehículo, 3 μM y 6 μM.
         NOTA: CAN se reconstituyó a 0,1 M con 1% de DMSO.
      2. Añada monensina (0,7 μL/mL), brefeldina (1:1.000), acetato de forbol miristato (50 ng/mL, PMA), ionomicina (1.000 ng/mL) y 2 μL de anti-CD107a a cada pocillo durante 2,5 h en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 ^oC. El volumen total de cultivo es de 200 μL por pocillo.
      3. Centrifugar la tinción de anticuerpos a ~16.000 × g durante 3-5 min a 4 °C para eliminar los agregados de anticuerpos. Prepare la mezcla de anticuerpos de superficie para el paso 2.1.1.8, que incluye todos los anticuerpos de superficie excepto los receptores de quimiocinas, el tampón Brilliant Stain Plus y el tampón FACS (volumen de cada uno anotado en la Tabla de materiales, total 112 μL de mezcla por reacción).
      4. Después de completar 2,5 h en cultivo, lavar las células 2 veces con 200 μL de PBS helado centrifugando a 400 × g durante 2 min a 4 °C. Entre lavados, deseche el sobrenadante invirtiendo la placa rápidamente. Realizar la tinción en la misma placa.
      5. Incubar las células en 100 μL/pocillo de colorante VIVO/MUERTO diluido 1:800 Azul en PBS durante 15 min a RT. Lavar 2 veces con 200 μL de tampón FACS.
      6. Vuelva a suspender las células con el bloqueador de monocitos True Stain (5 μL de bloqueador de monocitos + 45 μL de tampón FACS por pocillo) durante 5 min en RT.
      7. Agregue secuencialmente anticuerpos contra el receptor de quimiocinas directamente a la reacción de tinción (primero, anti-CXCR3 y anti-CCR7 durante 10 minutos cada uno, seguido de una mezcla de anti-CXCR5 y anti-CCR6 junto con 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus durante 5 minutos en RT). Mezcle bien después de cada adición pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Consulte la Tabla de materiales para conocer los volúmenes de anticuerpos.
      8. Añadir la mezcla de anticuerpos de superficie preparada en el paso 2.1.1.3 directamente a la reacción de tinción e incubar durante 30 min en RT. El volumen total de tinción por reacción es de 180 μL: 50 μL de bloqueador de monocitos en tampón (ver paso 2.1.1.6) + 18 μL de anticuerpos anti-receptores de quimiocinas (ver paso 2.1.1.7) + 112 μL de mezcla de anticuerpos de superficie (ver paso 2.1.1.3).
      9. Lavar 2 veces con 200 μL de tampón FACS frío.
      10. Vuelva a suspender las células e incube con 80 μL/pocillo de tampón de fijación a base de paraformaldehído en RT durante 20 min.
      11. Agregue 160 μL de tampón de permeabilización 1x a cada pocillo, que ya contiene tampón de fijación. Centrifugar la placa a 400 × g durante 2 min a RT y lavar 1 vez con 200 μL de tampón de permeabilización.
      12. Prepare la mezcla de anticuerpos contra citocinas intracelulares (ICS), que incluye anticuerpos anticitocinas, tampón Brilliant Stain Plus y tampón de permeabilización (volumen total 50 μL/pocillo, Tabla de materiales). Incubar las células con esta mezcla de anticuerpos de citocinas intracelulares en RT durante 30 min.
      13. Lavar 2 veces con tampón de permeabilización de 200 μL/pocillo. Vuelva a suspender con 200 μL/pocillo de tampón FACS.
      14. Almacene las células teñidas a 4 °C en la oscuridad y adquiera datos en un citómetro de flujo espectral en un plazo de 24 h para minimizar la pérdida de intensidad de tinción¹⁴.
   2. Tinción de factores de transcripción nuclear
      1. Cultive las células con CAN como en el paso 2.1.1.1 (sin estimular las células).
      2. Añadir anticuerpo anti-CD40 humano (0,5 μg/mL) al medio de cultivo y cultivar con células durante 15 min antes de comenzar la tinción. Si se estimulan las células, añadir este anticuerpo 15 min antes de iniciar la estimulación para evitar la internalización de CD40L tras la activación^15,16.
      3. Centrifugar los anticuerpos de tinción y preparar la mezcla de anticuerpos de superficie de forma similar al paso 2.1.1.3: anticuerpos de superficie en la Tabla de Materiales, 10 μL/pocillo de tampón de tinción brillante Plus y 54,1 μL/pocillo de tampón FACS.
         NOTA: El volumen total de tinción por pocillo es de 180 μL: 50 μL de bloqueador de monocitos en tampón + 13 μL de anticuerpos contra el receptor de quimiocinas + 117 μL de mezcla de anticuerpos de superficie.
      4. Lave las celdas y realice la tinción de VIVO/MUERTO Azul y la tinción de superficies y lavados como en los pasos 2.1.1.5-2.1.1.8.
         NOTA: El anticuerpo anti-CXCR3 no está incluido en este panel.
      5. Fije las células con 80 μL de tampón de fijación de factor de transcripción nuclear de FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set. Incubar durante 30 min en RT.
      6. Lave las células con tampón de permeabilización como en el paso 2.1.1.11.
      7. Prepare la mezcla de anticuerpos del factor de transcripción intracelular (TF), que incluye los anticuerpos contra el factor de transcripción enumerados en la Tabla de materiales, 10 μL de tampón de tinción brillante Plus y 16 μl de tampón de permeabilización (volumen total de 40 μL/pocillo). Incubar las células con esta mezcla durante 1 h a 4 °C.
      8. Lavar y adquirir en un citómetro espectral como en los pasos 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Análisis no supervisado de datos de citometría de flujo de alta dimensión

NOTA: El software, los paquetes y sus versiones utilizados para el análisis se enumeran en la Tabla de materiales. Las capturas de pantalla de los pasos 3.2 a 3.4 se encuentran en el archivo complementario 1. Los scripts de ejemplo de los pasos 3.5 a 3.7 se encuentran en elArchivo Complementario 2 y el Archivo Suplementario 3, los pasos 3.8 a 3.9 están en el Archivo Suplementario 4 y el Archivo Suplementario 5. Los archivos sin procesar de ICS y los archivos sin procesar TF para los scripts se proporcionan en el Archivo Suplementario 6 y el Archivo Suplementario 7, respectivamente.

1. Abra el espacio de trabajo del software de análisis de citometría de flujo donde se almacenan los archivos ".fcs" y complete la compuerta como se muestra en la Figura 1E.
2. Haga clic con el botón derecho en el nodo de destino (células T CD4⁺ en este caso). Elija Select Equivalent Nodes (Seleccionar nodos equivalentes).
3. Vuelva a hacer clic con el botón derecho en el nodo de destino. Seleccione Exportar/Concatenar poblaciones.
4. Espere a que se abra la ventana Poblaciones: Exportar o Concatenar, elija los valores del canal CSV y elija el destino de los archivos exportados. Incluya todas las celdas en el cuadro Incluir eventos y seleccione Todos los parámetros compensados en el cuadro Parámetros . Expanda las Opciones avanzadas, escriba un prefijo para cambiar el nombre de los archivos y haga clic en exportar para exportar los archivos a la carpeta de destino (exporte un archivo de .csv para cada muestra).
5. Lea los archivos "*.csv" exportados con R (uno para cada muestra). Asigne un ID de muestra a cada celda y combine las celdas de todas las muestras en un solo marco de datos.
6. Agregue o combine metadatos (información adicional sobre ejemplos) en el marco de datos.
7. Reduzca aleatoriamente la resolución de un número igual de celdas por muestra para el siguiente análisis. Este paso es opcional.
   NOTA: En este ejemplo, se redujeron 8,000 células T CD4⁺ del total de células T CD4⁺ de cada condición, lo que representa al menos 1/7 del número total de células T CD4⁺ .
8. Crear objeto Seurat: interprete los valores del canal para los marcadores de anticuerpos como niveles de expresión génica al crear un objeto Seurat.
   1. Cree un objeto Seurat con el marco de datos generado en el paso 3.6. Omita el paso NormalizeData y guárdelos directamente como ensayo de "datos".
   2. Seleccione los marcadores de superficie en el panel de flujo para utilizarlos como VariableFeatures en el clustering no supervisado.
   3. Ejecute ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP como la canalización estándar introducida desde Seurat, excepto el paso¹⁷ de NormalizeData.
   4. Ajuste el parámetro de resolución en el paso FindClusters para modificar el número de clústeres, asegurándose de que reflejen con mayor precisión el contexto biológico subyacente.
9. Utilice herramientas de visualización como DimPlot y FeaturePlot compatibles con el paquete Seurat. Para comparar grupos que contienen varias muestras por grupo, calcule el porcentaje de cada conglomerado por tema y realice comparaciones estadísticas. Posteriormente, utilizar modelos matemáticos para análisis estadísticos más sofisticados¹⁰.

Results

Para comparar la viabilidad celular general, cortamos la amígdala en tres partes similares y las procesamos utilizando nuestro protocolo bajo tres condiciones: (1) procesamiento en el mismo día, (2) almacenamiento nocturno a 4 °C y (3) almacenamiento nocturno en hielo. La viabilidad entre estas tres condiciones fue bastante similar, sin ninguna diferencia significativa (Figura 1A). También evaluamos el impacto del proceso de descongelación en la viabilidad de las células. El método de descon...

Discussion

En contraste con informes previos de que las amígdalas frescas deben procesarse dentro de las 3 horas posteriores a la cirugía¹⁹, encontramos que las muestras de amígdalas frescas podrían mantener su viabilidad cuando se almacenan a 4 °C y se procesan dentro de las 24 h. Para optimizar la viabilidad celular del tejido de las amígdalas al descongelarse del almacenamiento de nitrógeno líquido, adoptamos el método de descongelación gota a gota recomendado en la secue...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Máquinas e instrumentos
3 mL Jeringa de plástico	BD	309657
96 pocillos U Placa inferior	Thermo Scientific	163320
1.2 mL Viales criogénicos	Corning	430487
Filtro celular 70 µ m Plato de cultivo celular Nylon	Falcon	352350
(60 mm)	VWR	10062-890
Centrífuga	Thermo	Scientific Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Baño de agua digital	Benchmark	B2000-2
Tijeras finas - Sharp	F.S.T	14060-11
de plástico para instrumentos	F.S.T	20830-05
Citómetro de flujo espectral, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Pinzas de patrón estándar	FST	11000-13
Pinzas de patrón estándar	FST	11000-20
Analizador de viabilidad celular Vi-cell Blu	Beckman Coulter	C19201
Reagents
0.5 M EDTA pH 8.0	Quality Biology	351-027-101
2-Mercaptoetanol	Gibco	21985-023
Tampón de lisa ACK	Gibco	A10492-01
Mezcla de antibióticos-antimicóticos (Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B Suspensión, 100x)	Gibco	15240-062
Tampón de tinción brillante Plus (RUO)	BD	566385
Cantaridina	Tampón de fijación Sigma	C7632-25MG
Cytofix	BD	554655
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAasa I	Roche	10104159001
fetal Suero bovino (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/Juego de tampones de tinción de factor de transcripción	eBioscience	00-5523-00
Gentamicina (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Sigma de	ionomicina	I0634-1mg
L-glutamina (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Solución de paraformaldehído al 16%, grado EM (PFA)	Microscopía electrónica   Science	15710	Diluido con PBS
PBS, pH 7,4	Gibco	10010072
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Recipientes de congelación de velocidad controlada	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamina)	Gibco	11875-085
Piruvato de sodio (100 mM)	Gibco	11360-070
Bloqueador de monocitos de tinción verdadera	BioLegend	426103
Buffers
			10% FBS inactivado por calor (VWR), 2 nM de glutamina, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 1% de penicilina/ estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, 10 mM HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales en RPMI (+L-glutamina)
Tampón			2 mM EDTA y 2% de FBS inactivado por calor en PBS
Medio			90% de FBS inactivado por calor y 10% de
DMSO Tampón			Tampón de lavado + 0,1 mg/ml de DNasaI
Medio			de amígdalasRPMI suplementado con FBS inactivado por calor al 5%, 10 mM de glutamina, 0,05 mg/mL de gentamicina, mezcla de antibióticos-antimicóticos al 1%   (penicilina, estreptomicina y anfotericina B).
Tampón			RPMI (+L-glutamina) suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y 10 mM HEPES
anticuerpos y otros regentes para el panel de citoquinas
Biotina anti-CD107a humano (LAMP-1) Anticuerpo	BioLegend	328604	2 μ L en 200 μ L medio de cultivo completo por pocillo. Este anticuerpo se agregó con las células durante la estimulación con PMA/ionomicina.
Tinción de muertos vivos	100 μ L mezcla por pocillo
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0.125 μ L en 100 μ L PBS por pozo.
Bloque de monocitos	50 μ L mezcla por pocillo
Tampón bloqueador de monocitos	BioLegend	426103	5 μ L True Stain bloqueador de monocitos y 45 μ L Tampón FACS por pocillo
< anticuerpos fuertes > superficie para panel de citoquinas< / fuerte >
		receptores de quimiocinas	L/pozo
Antihumano CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Antihumano CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Antihumano CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
Antihumano CXCR5-BV750	BD	747111	1
Tampón de tinción brillante Plus (RUO)	BD	566385	10
	18 μ L mezcla por pocillo para receptores de quimiocinas; Añadir dirigido a las células con el tampón
Other mezcla de anticuerpos de superficie			μ L/pozo
Antihumano CD103-BUV661	BD	749993	2.5
Antihumano CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Antihumano CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Antihumano CD25-BB515	BD	564467	10
Antihumano CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
Antihumano CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Antihumano CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Antihumano CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
Antihumano CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Antihumano CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Antihumano CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
Antihumano CD69-BUV563	BD	748764	1
Antihumano CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Antihumano FAS-BB700	BD	566542	0.6
Antihumano HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-humano PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-humano-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
Tampón			61
			112 μ L mezcla por pocillo para otros anticuerpos de superficie; Añadir directamente al tampón de bloque de monocitos (50 μ L) y la mezcla de receptores de quimiocinas (18 μ L, 50 + 18 + 112 = 180 μ L en total por pocillo)
Anticuerpos de citocinas intracelulares para panel de citocinas			μ L/pozo
Antihumano Granzyme B-PE	BD		561142 1
Antihumano IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
Antihumano IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
Antihumano IL2-BV650	BioLegend	500334	3
Antihumano IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
Antihumano IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
Anti-perforina-APC	BioLegend	353312	2.5
Anti-humano TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
Anti-IFNγ-Pacific Blue	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Tampón de tinción brillante Plus (RUO)	BD	566385	10
1x tampón de permeabilización	eBiociencia	00-5523-00	19.15
	(50 μ L mezcla por pocillo)
Anticuerpos y otros regentes para el panel de factores de transcripción
CD40 Anticuerpo, antihumano	Miltenyi Biotec	130-094-133	0,5 μ g/ml de medio de cultivo para concentración de trabajo
tinción de muertos vivos	100 μ L mezcla por pocillo
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0.125 μ L en 100 μ L PBS por pozo.
Tampón bloqueador de monocitos	BioLegend	426103	5 μ L True Stain bloqueador de monocitos y 45 μ L Tampón FACS por pocillo
Anticuerpos de superficie para panel de factores de transcripción
Mezcla de receptores de quimiocinas			μ L/pozo
Antihumano CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Antihumano CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Antihumano CXCR5-BV750	BD	747111	1
Tampón de tinción brillante Plus (RUO)	BD	566385	10
	13 μ L mezcla por pocillo
Otra mezcla de anticuerpos de superficie			μ L/pozo
Antihumano 4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
Antihumano CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Antihumano CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Antihumano CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
Antihumano CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
Antihumano CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Antihumano CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Antihumano CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
Antihumano CD40L-PE	BD		557299 15
Antihumano CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Antihumano CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Antihumano CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
Antihumano CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Antihumano HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Antihumano ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
Antihumano OX40-APC	BioLegend	350008	5
Anti-humano PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-humano-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
Tampón			54.1
			117  μ L mezcla por pocillo para otros anticuerpos de superficie; Añadir directamente al bloque de monocitos  tampón (50 μ L) y la mezcla de receptores de quimiocinas (13 μ L, 50 + 13 + 117 = 180 μ L en total por pocillo)
Virus del factor de transcripción para el panel del factor de transcripción	μ L/pozo
Antihumano T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
Antihumano Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
Antihumano FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
Antihumano GATA3-BB700	BD	566642	2
Antihumano Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
Antihumano Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Tampón de tinción brillante Plus (RUO)	BD	566385	10
1 x Tampón de permeabilización	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μ L mezcla por well
Software y paquetes para análisis no supervisados
	Software/package	Version	Source
1	data.table	1.16.2	La red integral de archivos de R
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	mapa de referencia	1.0.12	La red de archivos R integral
4	R	4.3.2	La red de archivos R integral
5	readxl	1.4.3	La red de archivos R integral
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	La red de archivos R integral
8	SeuratData	0.2.2.9001	La red integral de archivos R
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	La red integral de archivos R
11	viridis	0.6.5	La red integral de archivos R