Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).
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Artículo de método
Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano
En este artículo
Resumen
Resumen
La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) ha remodelado la cara del tratamiento del cáncer, lo que ha llevado a tasas de remisión récord en cánceres hematológicos previamente incurables. Estos éxitos han estimulado el interés en adaptar la plataforma CAR a un subconjunto pequeño pero fundamental de células T CD4+ responsables principalmente de regular e inhibir la respuesta inmunitaria, las células T reguladoras (Tregs). La capacidad de redirigir la actividad inmunosupresora de las Tregs a cualquier objetivo extracelular tiene enormes implicaciones para la creación de terapias celulares para enfermedades autoinmunes, rechazo de trasplantes de órganos y enfermedad de injerto contra huésped. Aquí, describimos en detalle las metodologías para el aislamiento de Treg de buena fe a partir de sangre periférica humana, la modificación genética de Tregs humanas utilizando lentivirus o CRISPR/Cas9 asistida por knock-in utilizando la entrega de plantillas de reparación dirigida homóloga (HDR) mediada por virus adenoasociados, y la expansión ex vivo de Tregs CAR humanas estables. Por último, describimos la evaluación de la estabilidad fenotípica de las Treg CAR humanas y la función supresora in vitro , que proporciona información sobre cómo se comportarán las Treg CAR humanas en aplicaciones preclínicas y clínicas.
Introducción
Las terapias de células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) han revolucionado el tratamiento de las neoplasias malignas hematológicas, logrando tasas de remisión notablemente altas en cánceres previamente intratables 1,2. Los resultados preliminares alentadores del uso de células T con CAR para tratar el glioblastoma 3,4,5 destacan la versatilidad y el potencial futuro de la tecnología CAR para tratar una amplia gama de neoplasias malignas. A medida que el campo explora nue....
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Protocolo
1. Aislamiento humano de Treg
- Procesamiento de Leukopak
- Transfiera el contenido del leukopak a un tubo cónico de 50 ml. Añada un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco +2% de suero fetal bovino (FBS) mezclando suavemente con una pipeta.
- Centrifugar a 300 × g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Aspire cuidadosamente el sobrenadante. Reconstituya el pellet de la célula en 2 mL de DPBS + 2% de FBS. Añadir 8 mL de solución de cloruro de amonio por pipeta a la suspensión celular en una proporción de 4:1, mezclar por inversión suave y dejar la lisis de los glóbulos rojos re....
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Resultados
El protocolo descrito aquí proporciona una línea simplificada y estandarizada para evaluar nuevas construcciones de receptores de antígenos quiméricos (CAR) en células T reguladoras humanas (Tregs), con el objetivo de crear terapias vivas para enfermedades autoinmunes, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante de órganos y alergia. La Figura 1 muestra cómo obtenemos Tregs humanas de alta pureza a partir de sangre periférica utilizando FACS (Figura 1A
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Discusión
Este protocolo proporciona una metodología simplificada y completa para generar y evaluar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs). El éxito de la tecnología CAR en el tratamiento de los cánceres hematológicos ha inspirado su aplicación al subconjunto inmunosupresor de las células T, las Tregs. A diferencia de las células T convencionales, las Tregs inhiben las respuestas inmunitarias, ofreciendo tratamientos potenciales para las afecciones que resultan.......
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Divulgaciones
LMRF es un inventor y ha recibido regalías de patentes sobre células inmunitarias modificadas y es consultor para Guidepoint Global y McKesson. El resto de los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
LMRF está financiado por la subvención de Líder Emergente en Diabetes Tipo 1 de la Red de Investigación de Islotes Humanos (HIRN) U24DK104162-07, la Subvención de Investigación Institucional de la Sociedad Americana Contra El Cáncer (ACS) IRG-19-137-20, la Subvención de Descubrimiento del Proyecto Piloto de Investigación Clínica y Traslacional de Carolina del Sur (SCTR) 1TL1TR001451-01, la Subvención de la Conexión de Investigación de la Diabetes (DRC) IPF 22-1224 y la Subvención de Swim Across America 23-1579. RWC cuenta con el apoyo de la beca de capacitación en Ciencias Celulares, Bioquímicas y Moleculares T32GM132055 y la beca de ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Virus adenoasociados ( AAV) | Charles River Laboratories | ||
| Células | , por ejemplo, CD19-K562 | ||
| cesio-137 | |||
| Anti-humano CD8 PerCP (clon SK1) | Biolegend | 344708 | |
| Anti-humano CD4 PE/Cy7 (clon SK3) | Biolegend | 344612 | |
| Imán DynaMag-15 | ThermoFisher | 12301D | |
| Ghost BV510 tinte de viabilidad | TONBO | 13-0870-T100 | |
| K562 células | Tipo Americano Colección de Cultivo | CCL-243 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Gibco | ||
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| solución de cloruro de amonio | STEMCELL Technologies | 7850 | |
| Anti-humano CD127 PE (clon hIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | |
| Anti-humano CD25 APC (clon BC96) | Biolegend | 302610 | |
| Anti-humano CD4 FITC (clon SK3) | Biolegend | ||
| Anti-humano CD71 PE (clon SK1) | Biolegend | 334106 | |
| Anti-humano CD8 PerCP (clon SK1) | Biolegend | ||
| CTLA-4 antihumano PerCP-e710 | ThermoFisher | 46-1529-42 | |
| EGFR antihumano APC (clon AY13) | Biolegend | 352905 | |
| antihumano FOXP3 eFluor 450 | ThermoFisher | 48-4776-42 | |
| Antihumano HELIOS PE | Biolegend | 137216 | |
| Ca2+ y Mg2+ sin Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Contador de células (TC20 Automated Cell Counter) | Bio-Rad | 1450102 | |
| Portaobjetos de recuento de células | Bio-Rad | 1450016 | |
| CellTrace Kit de proliferación celular violeta | ThermoFisher | C34571 | |
| DNA LoBind Tubos | Eppendorf | 22431021 | |
| Easy 50 EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Kit de enriquecimiento de células T humanas CD4+ | STEMCELL Technologies | 19052 | |
| EasySep Human CD8+ Kit de enriquecimiento de células T | STEMCELL Technologies | 19053 | |
| EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| eBioscience Foxp3 juego de tampones de tinción con factor de transcripción | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Falcon Tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión para filtro de células, 5 mL | Fisher Scientific | 08-771-23 | 40μ m |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Citómetro de flujo | Beckman Coulter | CytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2 | |
| Clasificador de células activado por fluorescencia | BD Biosciences | FACS Aria III Clasificador de células | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Células T humanas CD3/28 Expansión y activación Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Sistema de transfección de neón Invitrogen | ThermoFisher | 10431915 | |
| Sistema de transfección de neón Invitrogen 100 μ L Kit | ThermoFisher | 10114334 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | ||
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140050 | |
| Myc Tag anticuerpo A647 (clon 9B11) | Cell Signaling Technologies | 2233S | |
| Opti-MEM I Medio sérico reducido | ThermoFisher | 31985062 | |
| solución de penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2) | Peprotech | 200-02 | |
| RPMI 1640 medio, sin glutamina | Gibco | 11875093 | |
| piruvato de sodio | Gibco | 11360070 | |
| Citómetro de flujo espectral | Cytek | Northern Lights | |
| TRAC gRNA | Synthego | Sequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT) | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | ThermoFisher | A36496 | |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154-100ML | |
| 1/10 Leukopak | STEMCELL Technologies | 200-0092 | 1-2 mil millones de PBMC |
Referencias
- Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153(2022).
- Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell thera....
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Reimpresiones y permisos
