Evaluación del Efecto de los Factores de Crecimiento sobre la Producción de Clorofilas a y b a partir de Microalgas

Resumen

El presente estudio destaca las ventajas de emplear el método desarrollado por Jeffrey y Humphrey para extraer y cuantificar pigmentos liposolubles de microalgas. Este método sirve como una herramienta valiosa para evaluar la influencia de los factores de crecimiento en la producción de clorofila y el contenido celular en estos organismos.

Resumen

Las microalgas contienen dos grupos principales de pigmentos: clorofilas y carotenoides. La clorofila es un pigmento verde que absorbe la energía lumínica y la transforma en energía química para facilitar la síntesis de compuestos orgánicos. Este pigmento sirve como una valiosa fuente primaria para productos biotecnológicos en las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética debido a sus altas propiedades antioxidantes y capacidades colorantes. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de los factores de crecimiento (concentración de CO₂ , color de la luz e intensidad de la luz) a través de un diseño experimental de Taguchi L₄ sobre el crecimiento celular y el contenido celular de clorofila a y b en Chlorella sorokiniana, seguido de la validación del método utilizando Haematococcus pluvialis microalgas como modelo de estudio adicional. El crecimiento celular se cuantificó mediante la técnica espectrofotométrica de densidad óptica a una longitud de onda de 550 nm. Para la cuantificación de las clorofilas, se obtuvo un extracto celular utilizando una solución de acetona pura al 90% y, posteriormente, se cuantificaron las concentraciones de clorofilas a y b mediante técnicas espectrofotométricas a longitudes de onda de 647 nm y 664 nm, según el método descrito por Jeffrey y Humphrey. Los resultados experimentales indicaron que el control de las condiciones de baja adición de CO₂ , luz púrpura y baja intensidad de luz aumenta tanto el crecimiento celular como la concentración de clorofilas a y b dentro de las células. La implementación de este método de cuantificación de clorofila permite determinar de forma rápida, sencilla y precisa el contenido de clorofila, ya que las longitudes de onda utilizadas se encuentran en los picos de absorbancia de ambos tipos de clorofilas, lo que hace que esta técnica sea fácilmente reproducible para cualquier microalga en estudio.

Introducción

En los últimos años, los crecientes problemas ambientales causados por las actividades antropogénicas y sus efectos adversos sobre la salud y el equilibrio de los ecosistemas han impulsado la búsqueda de sistemas de producción más eficientes y respetuosos con el medio ambiente. Esto ha acelerado los procesos en las industrias y ha fomentado la implementación de tratamientos de biorremediación y el desarrollo de biocompuestos para mitigar estos efectos nocivos¹.

Este contexto ha propiciado un importante crecimiento en el estudio de las microalgas, impulsado por la necesidad de encontrar soluciones innovadoras a los retos medioambientales y económicos actuales. Las microalgas prosperan en ambientes acuáticos, utilizando la luz solar y el dióxido de carbono como fuentes de energía y carbono, respectivamente. Esta característica los convierte en una alternativa sostenible y prometedora para la producción de diversos productos valiosos. La investigación en este campo se ha centrado en la comprensión de la fisiología y el metabolismo de estas células, así como en el desarrollo de tecnologías eficientes para su cultivo y procesamiento².

Existe una clara necesidad de desarrollar herramientas accesibles y fiables para el estudio de las microalgas con el fin de acelerar los procesos de investigación y profundizar en la comprensión de su fisiología, metabolismo y posibles aplicaciones. Estas herramientas deberían permitir un análisis rápido del efecto de los factores ambientales y de producción sobre parámetros clave, como la concentración de clorofila, que es un indicador fundamental de la salud y el desarrollo de estos organismos. Una disminución en el contenido de clorofila puede indicar estrés ambiental, deficiencias nutricionales o enfermedades.

Estos pigmentos verdes juegan un papel crucial en la fotosíntesis, capturando la energía de la luz solar para convertir el dióxido de carbono y el agua en glucosa y oxígeno y constituyen entre el 0,5% y el 5% de la biomasa de las microalgas³. Más allá de su papel esencial en el mantenimiento de los procesos vitales, las clorofilas han encontrado aplicaciones en diversas industrias. Los extractos de clorofila se utilizan en el procesamiento de alimentos y bebidas como colorantes naturales, impartiendo tonos verdes vibrantes a los productos y al mismo tiempo proporcionando propiedades antioxidantes. Además, los suplementos a base de clorofila están ganando popularidad en el sector de la salud y el bienestar debido a sus supuestos efectos desintoxicantes y antiinflamatorios. Al aprovechar las propiedades multifacéticas de la clorofila, las industrias pueden desarrollar productos innovadores que contribuyan tanto al atractivo visual como^{al bienestar del} consumidor.

En este sentido, una microalga de gran relevancia biotecnológica es C. sorokiniana. Este microorganismo destaca por su rápida tasa de crecimiento, lo que lo hace altamente eficiente en la producción de biomasa. Además, C. sorokiniana exhibe un contenido diverso de compuestos altamente nutricionales, incluidas proteínas, lípidos y vitaminas, lo que la hace valiosa para diversas aplicaciones en^{la producción de} alimentos, piensos y biocombustibles. Además, se ha descubierto que esta especie de microalga produce enzimas extracelulares con diversas funciones, lo que abre posibilidades para aplicaciones biotecnológicas como el tratamiento de aguas residuales, la biorremediación y los productos farmacéuticos⁴. Además de su rápido crecimiento y aplicaciones versátiles, C. sorokiniana también demuestra un potencial significativo para la producción de clorofila. Como microorganismo fotosintético, C. sorokiniana posee la maquinaria necesaria para la síntesis de clorofila, que constituye entre el 0,5% y el 5% de la biomasa de microalgas³. Esta capacidad hace que C. sorokiniana sea un candidato atractivo para la producción de clorofila a escala comercial y promete ser una solución sostenible a los desafíos ambientales y nutricionales urgentes⁵.

Por otro lado, otra especie de microalga de gran interés es H. pluvialis. Esta microalga es conocida por su producción de astaxantina, un potente pigmento antioxidante con numerosas aplicaciones industriales. La astaxantina sirve como mecanismo protector del fotosistema de H. pluvialis , protegiéndolo del estrés oxidativo inducido por factores ambientales. Este pigmento es muy buscado en las industrias de cosméticos, nutracéuticos y acuicultura, debido a sus propiedades antioxidantes y posibles beneficios para la salud. Con su abundante capacidad para producir astaxantina, H. pluvialis presenta una vía prometedora para el desarrollo de productos innovadores que satisfacen diversas necesidades industriales y de los consumidores⁶.

Estudios recientes también han puesto de relieve el potencial de H. pluvialis¹ para la producción de clorofila, lo que aumenta aún más su importancia industrial. Por ejemplo, un estudio investigó el contenido de clorofila de H. pluvialis en diferentes condiciones de crecimiento y encontró que, bajo parámetros óptimos de cultivo, H. pluvialis exhibió tasas de producción de clorofila notables, superando a las de otras especies de microalgas⁷. Este hallazgo subraya el potencial de H. pluvialis como fuente sostenible de clorofila, ofreciendo nuevas oportunidades para su utilización en diversos sectores industriales.

Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo y preparación de inóculo

1. Prepare 1 L de medio de crecimiento 3N-BBM+ V(CCAP) (Macronutrientes: NaNO₃ [0,75 g ^L-1], CaCl₂ [0,019 g ^L-1], MgSO₄ [0,019 g ^L-1], K₂HPO₄ [0,057 g ^L-1], NaCl [0,025 g ^L-1], KH₂PO₄ [0,175 g ^L-1]; micronutrientes: Na₂ EDTA [0,0186 g ^L-1], FeCl₃ [0,0024 g ^L-1], MnCl₂ [0,001 g ^L-1], ZnCl₂ [1,25 x ^10-4 g ^L-1], CoCl₂ [5 x ^10-5 g ^L-1], Na₂MoO₄ [9,98 x ^10-5 g ^L-1])⁸ y esterilizarlo durante 15 min a 121 °C y 1,5 psi.
2. Inocular un matraz con 1 L de medio de crecimiento a una concentración aproximada de 3 x 10⁶ células ^mL-1 para la microalga C. sorokiniana; o agregue del 5% al 10% (v/v) de inóculo al medio de crecimiento.
   NOTA: Para mantener las condiciones estériles, se recomienda utilizar una capucha de flujo laminar, guantes, bata de laboratorio y mascarilla.
3. Incubar el matraz inoculado bajo fuentes de luz roja con una intensidad aproximada de 3.600 a 4.200 lux, a una temperatura comprendida entre 22 y 26 °C, con un fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad para C. sorokiniana y un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad para H. pluvialis, y agitar manualmente cada 24 h. Aproximadamente durante 7 días para ambas cepas.
   NOTA: Mantener en condiciones de crecimiento durante al menos 7-10 días (hasta obtener un color verde intenso) para C. sorokiniana y 10-12 días para H. pluvialis. Para obtener el concentrado de microalgas que servirá como inóculo en la cinética, es necesario eliminar el medio sobrenadante de las algas producidas.
4. En un entorno estéril, llene los tubos de centrifugación cónicos estériles de 15 mL con aproximadamente 10 mL de medio inoculado y centrifugue a 3.000 x g durante 20 min a 25-30 °C.
5. En condiciones estériles, extraer el sobrenadante con una micropipeta o vertiendo y concentrando la biomasa en un tubo de centrifugación cónico estéril de 50 mL.
6. Repita este proceso según sea necesario hasta obtener el volumen requerido de inóculo para la cinética.
7. Mida la densidad óptica (OD₅₅₀ nm) del inóculo para determinar la concentración celular de las microalgas y almacene a una temperatura de 3-4 °C hasta que esté listo para su uso.
   NOTA: Inicialmente se realizó un recuento celular directo para correlacionar la concentración celular con la absorbancia. Una vez contado, el inóculo puede almacenarse en refrigeración durante no más de 4 días.

2. Estudio de la cinética de crecimiento

1. Preparar el volumen requerido de 3N-BBM+ V (CCAP) adecuado para cada experimento (8 L para las pruebas de nivel del fotobiorreactor para C. sorokiniana y 0,5 L para las pruebas de nivel de matraz para H. pluvialis) de acuerdo con los procedimientos estándar de laboratorio, asegurando una esterilización adecuada.
2. Tanto para el fotobiorreactor como para los matraces, configure la fuente de luz en el espectro de color deseado (azul a 460 nm, morado, mezcla de 460 nm y 630 nm para C. sorokiniana y rojo a 630 nm para H. pluvialis); Cubra ambos sistemas para evitar interferencias de luz externa.
   NOTA: Debido a la variación en la longitud de onda emitida por cada diodo emisor de luz, la espectrorradiometría se realizó utilizando un espectrorradiómetro en las fuentes de luz para determinar la longitud de onda y la potencia de emisión de cada diodo⁹. La luz púrpura se logró combinando LED rojos y azules, lo que resultó en longitudes de onda de 460 nm con una potencia de emisión de 1,65 W ^nm-1 para los LED azules y de 630 nm con una potencia de emisión de 0,6 W ^nm-1 para los LED rojos. Estas mediciones se utilizaron para las pruebas realizadas únicamente bajo luz azul y roja.
3. Programe el temporizador para alternar entre ciclos de luz de 12 h y 12 h de oscuridad para C. sorokiniana y ciclos de luz de 16 h y 8 h de oscuridad para H. pluvialis.
4. Conecte el sistema de aireación de_CO2 al recipiente de cultivo del fotobiorreactor para proporcionar suministro de dióxido de carbono en intervalos de 12 h para C. sorokiniana.
5. Inocular el recipiente de cultivo con un volumen suficiente de preinóculo para lograr una densidad celular inicial de 3 x 10⁵ células ^mL-1 o su equivalente en densidad óptica (OD₅₅₀ nm) = 0,180.
   NOTA: Asegurar la técnica aséptica durante la inoculación para evitar la contaminación.
6. Muestrear el cultivo a intervalos regulares de 12 h para C. sorokiniana y 8 h para H. pluvialis para monitorear el crecimiento celular y los parámetros fisiológicos. Recolectar muestras utilizando técnicas estériles para mantener la integridad del cultivo.

3. Cuantificación de clorofilas

NOTA: Los datos para la cuantificación celular se proporcionan en el Archivo Complementario 1.

1. Coloque 40 mL de la muestra en tubos de centrifugación cónicos de plástico.
2. Centrifugar a 3.000 x g durante 20 min a 15 °C y desechar el sobrenadante por decantación o con una pipeta Pasteur.
3. Transfiera el pellet de celda a un tubo de vidrio cubierto con papel de aluminio y un tapón de rosca para evitar la oxidación.
4. Vuelva a suspender el pellet celular con 3 mL de solución de acetona pura al 90% usando un vórtice.
5. Sonicar la muestra suspendida en un baño de hielo durante dos ciclos de 5 min cada uno y dejar reposar a 4 °C durante 16 h¹⁰.
6. Después de 16 h, vuelva a sonicar en las mismas condiciones mencionadas en el paso anterior (paso 3.5) y vuelva a centrifugar en las condiciones descritas anteriormente (paso 3.2).
7. Separe el extracto de pigmento con una pipeta Pasteur y transfiéralo a otro tubo limpio y protegido de la luz.
8. Coloque el extracto de pigmento en una celda de cuarzo para leerlo en un espectrofotómetro a longitudes de onda de 630 nm, 647 nm y 664 nm.
   NOTA: Calibrar previamente el espectrofotómetro con acetona al 90%.
9. Para calcular las concentraciones de clorofila, utilice las siguientes ecuaciones¹¹:
   Clorofila A = 11,93 A₆₆₄ - 1,93 A₆₄₇
   Clorofila b = 20,36 A₆₄₇ - 5,50 A₆₆₄
   NOTA: Los resultados se expresan en μg ^mL-1 de extracto, que se multiplican por el volumen del extracto y se dividen por el número de mL de muestra para obtener concentraciones de clorofila en μg ^mL-1 de cultivo.
10. Para obtener valores en μg chl ^cell-1, utilice la siguiente fórmula:
    μg de chl ^célula-1 = μg de chl en 1 mL de concentración de células de cultivo / [células ^mL-1] en el cultivo.

Resultados

Para observar la eficiencia de la técnica de detección de variaciones en la concentración celular de clorofila y evaluar el efecto de los factores de crecimiento en C. sorokiniana, se estableció un diseño experimental Taguchi L₄ , evaluando la adición de volumen de CO₂ , el color de la luz y la intensidad de la luz. Cada factor se evaluó en niveles bajos y altos, como se muestra en la Tabla 1, bajo las condiciones definidas por el diseño experimental en la Tabla 2

Discusión

El estudio comparativo entre H. pluvialis y C. sorokiniana reveló diferencias significativas en la dinámica de producción de clorofila. Mientras que H. pluvialis mostró una disminución en la concentración de clorofila a lo largo del experimento, C. sorokiniana mostró un aumento constante. Además, inicialmente hubo una menor proporción de clorofila a en ambas especies, pero esta proporción se invirtió en condiciones particulares de crecimiento,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C3H6O	Meyer	67-64-1	Acetona 90%
15 mL	tubo Biologix	10-9502	Tubo de ensayo
2510-DTH	Branson	D-73595	Sonicator
5 mL tubo de ensayo con tapón de rosca	Kimax	45066-13100	Tubo
ensayo 50 mL tubo de centrífuga	Biologix	10-9151	Tubo de ensayo
Papel de aluminio	Reynolds	611 estándar, 12" x 1000 pies	Tapa del tubo de ensayo
CaCl2	Meyer	0925-250	Centrífuga de cloruro de calcio
	Centrífuga Dynamica	14 R	Refrigerada
CoCl2	Merck	1057-100	Dicloruro de cobalto
FeCl3	Merck	157740	Cloruro de hierro (III)
K2HPO4	Meyer	2051-250	Fosfato dipotásico
KH2PO4	Meyer	2055-250	Fosfato monopotásico
MgSO4	Meyer	1605-250
Micropipeta	LabNet	Micropipeta	Beta-Pette
MnCl2	Merck	429449	Cloruro de manganeso (II)
Na2 EDTA	Merck	200-449-4	Edatamil, Edetato Sal disódica Dihidratado
Na2MoO4	Merck		243655 Molibdato de sodio
NaCl Meyer		2365-500	Cloruro de sodio
NaNO3	Meyer	2465-250	Nitrato de sodio
Tira de LED RGB	Steren	GAD-LED2	Light fuente
Espectrofotómetro	PerkinElmer	modelo Lambda35	Espectrofotómetro
espectrorradiómetro	Gigahertz-Optik	modelo BTS256
Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie® 2	Vortex
ZnCl2	Merck	208086	Cloruro de zinc

de de sulfato de magnesio modelo