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Artículo de método

Evaluación del mecanismo de un jarabe de hierbas tradicional para el tratamiento de la anemia mediante metabolómica hepática

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DOI:

10.3791/67225

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30 de agosto de 2024

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1School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Chinese Medicine, 2School of Chinese Materia Medica, Guangdong Pharmaceutical University, 3Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co., Ltd.

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta principalmente la aplicación de la metabolómica hepática en la investigación de la eficacia del jarabe Shi-Liu-Bu-Xue en el tratamiento de la anemia.

Resumen

Como medicina uigur muy conocida, el jarabe Shi-Liu-Bu-Xue (SLBXS) se ha utilizado ampliamente para tratar la anemia en China durante más de 20 años. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de su eficacia en el tratamiento de la anemia siguen sin estar claros. En este estudio, la metabolómica hepática se empleó principalmente para determinar los posibles mecanismos reguladores de SLBXS en el tratamiento de la anemia. Se llevó a cabo un perfil metabolómico hepático para caracterizar el mecanismo de acción de SLBXS en un modelo murino de anemia inducida por acetilfenilhidracina. Se demostró que SLBXS disminuye el índice hepático, el recuento de glóbulos blancos y el recuento de plaquetas, al tiempo que aumenta el recuento de glóbulos rojos, la hemoglobina y los niveles de hematocrito. Se seleccionaron los objetivos principales para la verificación mediante Western blot. SLBXS demostró un efecto terapéutico significativo sobre la anemia principalmente mediante la regulación del metabolismo de la galactosa y la vía de señalización HIF-1, como lo indica la regulación negativa de las proteínas HIF-1α, NOS3, VEGFA y GLA en los tejidos hepáticos de ratones anémicos. Este estudio clarifica los posibles mecanismos reguladores del metabolismo hepático mediante la administración de SLBXS en el tratamiento de la anemia.

Introducción

La anemia es un problema de salud mundial apremiante y prevalente, que afecta al 25% de la población mundial y a personas de todas las edades, especialmente a adolescentes y mujeres embarazadas 1,2,3. Se asocia con un mayor riesgo de parto prematuro y mortalidad materna y puede provocar trastornos del desarrollo físico y deterioro del rendimiento cardiovascular4. Esta condición también puede afectar negativamente el estado de salud de los adolescentes, lo que resulta en infecciones e insuficiencia cardíaca5. Los tratamientos actuales incluyen principalmente transfusiones de sangre, suplementos de hierro y terapia con eritropoyetina. Sin embargo, estos tratamientos tienen desventajas y efectos secundarios adversos, como anafilaxia, malestar gastrointestinal, sobrecarga de hierro y urticaria1. Por lo tanto, es crucial identificar medicamentos efectivos con menos efectos secundarios para tratar la anemia.

La medicina tradicional china, incluida la medicina uigur, ofrece varias ventajas, como formulaciones de múltiples ingredientes, efectos de múltiples objetivos, interacciones de múltiples vínculos y menos efectos secundarios en la prevención y el tratamiento de enfermedades multifactoriales. El jarabe Shi-Liu-Bu-Xue (SLBXS) es un agente tradicional notable en la medicina uigur utilizado para los tónicos sanguíneos y la producción de sangre. Está reconocido como un fármaco regulador de la sangre que puede reducir el calor hepático y se ha incluido en las directrices para el uso clínico de medicamentos minoritarios para el tratamiento de la anemia. También está autorizado por la Administración Estatal de Alimentos y Medicamentos de China (Z20026094)6,7,8. En las últimas dos décadas, SLBXS se ha utilizado ampliamente en China para tratar afecciones relacionadas con la anemia. Sin embargo, sus posibles mecanismos para tratar la anemia siguen siendo desconocidos y requieren más investigación. La metabolómica, que examina las respuestas metabólicas dinámicas de los sistemas biológicos a las enfermedades, las intervenciones farmacológicas o las condiciones ambientales9, se utiliza cada vez más para dilucidar los mecanismos de acción de la medicina tradicional china mediante la evaluación de los cambios en los biomarcadores metabólicos en muestras biológicas después de estímulos externos 9,10.

En consecuencia, se adoptó un enfoque metabolómico hepático en este estudio para determinar los mecanismos terapéuticos subyacentes de SLBXS en el tratamiento de la anemia. En primer lugar, se estableció un modelo de ratón de anemia inducida por acetilfenilhidracina (APH). A continuación, se investigaron las vías metabólicas de los metabolitos endógenos utilizando metabolómica hepática con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y métodos de datos multivariados tras la administración de SLBXS. Por último, se analizaron experimentalmente los objetivos clave para dilucidar los efectos antianémicos y los mecanismos moleculares de SLBXS.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina China de Hubei (HBUCMS201912015). Los ratones machos C57BL/6 (peso 20-22 g) se alojaron en una habitación específica libre de patógenos con una humedad relativa del 50%-60% y una temperatura de 22 °C ± 2 °C, se sometieron a un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad y se les proporcionó libre acceso a alimentos y agua. Antes de que comenzara el experimento, a todos los ratones se les permitió una semana para aclimatarse al medio ambiente. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a uno de los siguientes cuatro grupos (n = 12): control, modelo, jarabe Fu-Fang-E-Jiao (FFEJS, un fármaco positivo, administrado por vía intragástrica a 7,8 mL/kg) y SLBXS (administrado por vía intragástrica a 11,7 mL/kg). Los ratones de los grupos de control y modelo recibieron volúmenes iguales de solución salina. Los ratones de todos los grupos recibieron administración intragástrica de los fármacos correspondientes una vez al día durante 2 semanas. Los detalles de los medicamentos, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Establecimiento de un modelo de anemia en ratones

  1. Pese 2 g de acetilfenilhidracina (APH) con una balanza electrónica y transfiéralo a un vaso de precipitados de 150 ml. Agregue 100 mL de solución salina y revuelva con una varilla de vidrio hasta que el APH se disuelva por completo.
  2. Establecer el modelo murino de anemia inyectando por vía subcutánea un 2% de APH como se preparó en el paso 1.1 en el1º,4º y7º día a dosis de 200 mg/kg, 100 mg/kg y 100 mg/kg, respectivamente11.
    NOTA: A partir del primer día, los ratones de los grupos FFEJS (7,8 mL/kg) y SLBXS (11,7 mL/kg) recibieron administración intragástrica una vez al día durante 2 semanas. Los ratones de los grupos de control y modelo recibieron volúmenes iguales de solución salina una vez al día durante 2 semanas.

2. Determinación del índice hepático

  1. Al final del experimento, pesa cada ratón con una báscula electrónica.
  2. Anestesiar a los ratones inhalando isoflurano al 2%. Aprieta el globo ocular de los ratones para hacerlo hiperémico y protuberante. Retire rápidamente el globo ocular con pinzas y recoja la sangre en tubos de muestra heparinizados.
  3. Asegure los ratones anestesiados del paso 2.2 a una placa de manipulación quirúrgica.
  4. Haz una incisión completa a lo largo de la línea media del abdomen con un bisturí. Diseccionar y aislar cuidadosamente el tejido hepático intacto12, luego medir su peso con una balanza electrónica.
    NOTA: El índice hepático de cada ratón se calcula utilizando la siguiente fórmula: Índice hepático = peso hepático/peso corporal.

3. Análisis hematológico

  1. Agite suavemente el tubo que contiene la muestra de sangre heparinizada del paso 2.2 para prevenir la coagulación de la sangre.
  2. Coloque la muestra de sangre debajo de la aguja de inyección para asegurarse de que esté completamente sumergida en la aguja.
  3. Haga clic en el botón Detección automática para medir el recuento de glóbulos rojos (RBC), el hematocrito (HCT), el recuento de glóbulos blancos (WBC), los niveles de hemoglobina (HGB) y el recuento de plaquetas (PLT) utilizando un analizador de hemocitos totalmente automático.

4. Estudio de metabolómica hepática

  1. Preparación de la muestra de hígado
    1. Homogeneizar las muestras de tejido hepático (50 mg) del paso 2.4 con 1 mL de metanol preenfriado. Centrifugar a 18.759 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar el precipitado.
    2. Transferir 200 μL del sobrenadante a un vial de muestra con una pipeta y secar al vacío en un liofilizador a 35 °C durante 2 h.
    3. Reaccionar las muestras secas con 40 μL de una solución de 40 mg/mL de clorhidrato de metoxiamina en piridina durante 90 min a 30 °C. A continuación, añadir 80 μL de N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA) con trimetilclorosilano (TMCS) al 1% e incubar durante 60 min a 37 °C.
    4. Añadir 10 μL de n-hexano al vial para finalizar la reacción de derivatización.
  2. Análisis metabólico hepático
    1. Analice las muestras derivatizadas (1 μL) utilizando un sistema GC-MS. Separe los derivados utilizando una columna capilar DB-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).
      NOTA: Las condiciones del programa de temperatura del horno se establecieron de la siguiente manera: 60 °C durante 1 min; aumentar a 325 °C a una velocidad de 10 °C/min y mantener durante 10 min. Las temperaturas del inyector, la fuente de iones y la MS se ajustaron a 250 °C, 230 °C y 150 °C, respectivamente. Se utilizó helio (99,999%) como gas portador a un caudal de 1,1 mL/min, y la relación de división se estableció en 10:1. Se utilizó una energía de haz de electrones de 70 eV y un tiempo de retardo del disolvente de 5,9 min.
  3. Procesamiento y análisis de datos
    1. Adquiera y convierta datos brutos de GC-MS utilizando el software MassHunter compatible.
    2. Realizar análisis espectrales utilizando la herramienta del Sistema Automatizado de Deconvolución e Identificación Espectral de Masas (AMDIS)12.
    3. Identifique todos los metabolitos utilizando las bases de datos NIST y HMDB (consulte la tabla de materiales).
    4. Importe los datos a la herramienta MetaboAnalyst para el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), pruebas t, análisis de rutas y análisis de redes12.

5. Análisis de Western blot

  1. Extraer el total de proteínas del tejido hepático de ratón
    1. Añadir 50 mg de tejido hepático del paso 2.4 y 250 μL de lisado celular a un homogeneizador de vidrio de 1 mL y triturar en hielo durante 5 min.
    2. Transfiera el homogeneizado de tejido hepático del paso 5.1.1 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una pipeta y centrifugar a 18.759 x g durante 10 min a 4 °C. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml con una pipeta.
  2. Determinación de las concentraciones de proteínas y preprocesamiento de muestras de proteínas
    1. Agregue 2 μL de sobrenadante del paso 5.1.2, 18 μL de PBS y 180 μL de solución de trabajo de BCA a una placa de microtitulación de 96 pocillos8.
    2. Oscilar la placa en un oscilador durante 30 s, dejarla durante 30 min a 37 °C y determinar la absorbancia a 562 nm utilizando un lector de microplacas.
  3. Separe las proteínas totales con SDS-PAGE, transfiéralas a membranas de fluoruro de polivinilideno y bloquee con leche descremada al 5%8.
  4. Incubar las membranas del paso 5.3 con anticuerpos primarios contra HIF-1α (1:1000), VEGFA (1:1000), GLA (1:1000), NOS3 (1:1000) y β-actina (1:5000) durante la noche a 4 °C.
  5. Coloque las membranas del paso 5.4 en una caja de incubación de anticuerpos, agregue 10 ml de TBST y agite horizontalmente a 111 x g a temperatura ambiente para lavar los anticuerpos primarios no unidos tres veces durante 5 minutos cada una.
  6. Añadir 200 μL de IgG (H + L)-HRP (1:1000) anti-conejo de cabra a cada membrana a partir del paso 5.5 e incubar durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, repita el paso 5.5 para eliminar el anticuerpo secundario no unido (IgG (H + L)-HRP anti-conejo de cabra).
  7. Agregue 200 μL de solución quimioluminiscente ECL de ultra alta sensibilidad a la superficie de cada membrana a partir del paso 5.6 y visualice inmediatamente las bandas de proteínas utilizando un sistema automático de análisis de imágenes de quimioluminiscencia.

6. Análisis estadístico

  1. Analice los datos utilizando software estadístico y gráfico con ANOVA de un factor seguido de la prueba de Tukey.
  2. Presentar los resultados como media ± desviación estándar (DE) y considerar un valor de P < 0,05 como estadísticamente significativo.

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Resultados

Para confirmar el establecimiento exitoso del modelo murino de anemia y analizar el efecto de SLBXS sobre la anemia, primero se investigaron el índice hepático y los parámetros hematológicos. La Figura 1 ilustra que el grupo modelo mostró una disminución significativa (P < 0,01) en el recuento de glóbulos rojos (RBC), hemoglobina (HGB) y hematocrito (HCT) en comparación con el grupo control. Por el contrario, el índice hepático, el recuento de glóbulos blancos (WBC) y el recuento...

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Discusión

La anemia es una afección común que afecta a muchas personas en todo el mundo, especialmente en los países en desarrollo1. En China, los pacientes utilizan con frecuencia la medicina tradicional china, incluida la medicina uigur, para aliviar los signos y síntomas de la anemia. SLBXS es un medicamento uigur que se ha utilizado en la práctica clínica durante muchos años; Sin embargo, su mecanismo exacto de acción contra la anemia sigue siendo poco conocido

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del Plan Especial de Capacitación para Talentos Minoritarios en Ciencia y Tecnología de la Fundación de Ciencias Naturales de la Región Autónoma Uigur de Xinjiang (2020D03021), los Fondos para el Programa Clave de Medicina Tradicional China de la Universidad de Medicina China de Hubei (2022ZZXZ004) y el Programa del Equipo de Innovación de Tianshan (2020D14030).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetilfenilhidracinaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
Sistema automático de análisis de imágenes de quimioluminiscenciaShanghai Tanon Life Science Co., Ltd.Tanon-5200
Kit de ensayo de ácido bicinconínicoThermoFisher ScientificQPBCA-1KT
Columna capilarAgilent J& W Scientific, Agilent Technologies, Inc.DB-5MS
Tampón de lisis celular para Western e IPBeyotime BiotechnologyP0013
ChlorotrimethylsilanoShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
Balanza electrónicaMettler-Toledo International Inc.ME203E
Báscula electrónicaMettler-Toledo International Inc.LE104E
Fu-fang-e-jiao jarabeDong E E Jiao Co., Ltd.
Analizador de hemocitos totalmente automáticoShenzhen Mindray Animal Care Technology Co., Ltd.Sistema IDEXX ProCyte Dx
GC-MSAgilent Technologies, Inc.7890B-5977B 
Anticuerpo primario GLABioworld Technology BS77041
Homogeneizador de vidrioShanghai Lei Gu Instruments Co., Ltd.B-013001
Varilla de vidrio Shanghái Lei Gu Instrumentos Co., Ltd.B-003904
Software GraphPad Prism  GraphPad, La JollaVersión 9.0
Tubos de muestra heparinizadosChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd.B-ACT1P5
HIF-1 y alfa; anticuerpo primarioBioworld TechnologyBS3514
Base de datos HMDBhttp://www.hmdb.ca/—
IsofluranoHebei Jindafu Pharmaceutical Co., Ltd.
ratones machos C57BL/6Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd.No. SCXK [Liao] 2015-0001
MassHunterAgilent Technologies, Inc.B.08.00
MetaboAnalyst 5.0https://www.metaboanalyst.ca/—
Clorhidrato de metoxiaminaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
n-hexanoShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
base de datos del NISThttp://webbook.nist.gov/chemistry/—
Anticuerpo primario NOS3Bioworld TechnologyBS3625
PiridinaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
solución salinaBIOSHARP LIFE SCIENCES
Jarabe Shi-Liu-Bu-XueXinjiang Uygur Pharmaceutical Co., Ltd.
Placa de manipulación quirúrgicaDIXSGZK-JPB-A
anticuerpo primario VEGFABioworld TechnologyAP0742
β-actinaABclonal (Shanghai) Trading Co., Ltd.AC026
C13979660C10481421402003120231202E1818113C14878803C13026996 2308262009 211277

Referencias

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