Artículo de método

Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón

DOI:

10.3791/67234

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20 de septiembre de 2024

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1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para aislar exosomas derivados del bazo de ratón utilizando una combinación de digestión con colagenasa tipo I y ultracentrifugación.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los exosomas (Exo) son estructuras bicapa lipídica secretadas por varias células, incluidas las de animales, plantas y procariotas. Estudios previos han revelado que los Exo derivados del sobrenadante humoral o celular son objetivos prometedores para nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico, lo que subraya su importante papel en la patogénesis de la enfermedad. Los Exo derivados del tejido (Ti-Exo) han atraído cada vez más la atención debido a su capacidad para reflejar con precisión la especificidad del tejido y el microambiente. Los Ti-Exo, presentes en el espacio intersticial, desempeñan un papel crucial en la comunicación intercelular y la señalización entre órganos. A pesar de su reconocido valor para dilucidar los mecanismos de la enfermedad, el aislamiento de Ti-Exo sigue siendo un desafío debido a la complejidad de las matrices de tejidos y la variabilidad en los métodos de extracción. En este estudio, desarrollamos un protocolo práctico para aislar exosomas del tejido del bazo de ratones, proporcionando una técnica reproducible para el análisis de identificación posterior y estudios funcionales. Utilizamos la digestión de colagenasa tipo I combinada con ultracentrifugación diferencial para aislar Exo derivado del bazo. Las características de Exo aislado se determinaron mediante microscopía electrónica, el citómetro de nanoflujo y el western blot. El Exo aislado derivado del bazo mostró la morfología típica de las vesículas bicapa lipídica, con tamaños de partícula que oscilaron entre 30 nm y 150 nm. Además, el perfil de expresión de los marcadores de exosomas confirmó la presencia y pureza de los exosomas. En conjunto, establecimos con éxito un protocolo práctico para aislar Exo derivado del bazo en ratones.

Introducción

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Los exosomas (Exo) son un subgrupo de vesículas extracelulares (VE), de 30 a 150 nm de tamaño, que encapsulan una amplia gama de biomoléculas, incluidas proteínas, ácidos nucleicos y lípidos1. Estas biomoléculas se derivan de las células parentales y se liberan en el espacio extracelular. Exo facilita el intercambio de información biomolecular entre las células y su microambiente circundante, desempeñando funciones tanto en el sistema procariota como en el eucariota2. Las características de los exosomas, como el contenido, el tamaño, los componentes de la membrana y el origen celular, son muy variables y están influenciadas por el tipo de célula de origen, el estado celular y las condiciones ambientales.

Los exosomas se clasifican comúnmente en tres categorías según su fuente: derivados de cultivos celulares, derivados de fluidos corporales y derivados de tejidos (Ti-Exo). Si bien los exosomas derivados de cultivos celulares han sido ampliamente estudiados debido a su accesibilidad y rendimiento constante, su uso está limitado por posibles alteraciones en las características celulares después de un cultivo prolongado, lo que puede tergiversar sus funciones biológicas 3,4,5. Además, la mayoría de los cultivos celulares se mantienen en entornos bidimensionales que no imitan las complejas interacciones intercelulares in vivo, lo que puede afectar a la interpretación de los datos6. Por el contrario, los exosomas aislados de fluidos biológicos ofrecen una opción mínimamente invasiva para monitorizar la progresión de la enfermedad en tiempo real7. Sin embargo, estas muestras a menudo contienen una mezcla de exosomas de varios orígenes, lo que complica la identificación precisa de su fuente primaria8. Dados estos desafíos, existe un creciente interés en los Ti-Exo, que residen en el intersticio extracelular y son mediadores clave de la señalización intercelular.

El bazo desempeña un papel crucial en la función inmunitaria y en el mantenimiento de la homeostasis interna. A pesar de los protocolos existentes para aislar el Ti-Exo de órganos como el cerebro, el hígado y los tumores, los métodos prácticos para los exosomas derivados del bazo se han reportado de manera limitada 9,10. Este estudio tuvo como objetivo establecer un protocolo práctico para el aislamiento de exosomas del tejido del bazo en ratones modificados a partir de un informe previo11. Detallamos un método que implica la digestión de la colagenasa seguida de ultracentrifugación, que minimiza la disrupción de la membrana celular y garantiza una alta pureza y rendimiento de Exo derivado del bazo. Las características de Exo aislado utilizando este protocolo establecido se validaron a través de microscopía electrónica (TEM), el citómetro de nanoflujo (Nano-FCM) y Western blot, lo que confirma la eficacia del protocolo para futuras investigaciones experimentales.

Protocolo

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Las muestras se obtuvieron de ratones, con la aprobación ética otorgada por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Guangdong. Las descripciones detalladas de los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla de Materiales. Los detalles de la preparación previa a la extracción se ilustran en la Figura 1, mientras que el proceso de extracción y enriquecimiento de Spleen-Exo se describe en la Figura 2.

1. Preparación

  1. Enfríe previamente las centrífugas de alta velocidad y ultra alta velocidad a 4 °C y ajuste la temperatura de un agitador de escritorio a 37 °C.
  2. Prepare placas de cultivo celular (figure-protocol-1100 mm), tubos de centrífuga estériles de 50 mL, hielo y colador de células estériles (figure-protocol-270 μm) como se muestra en la Figura 1A, B.
  3. Esterilice las tijeras y las pinzas con alcohol en aerosol al 75 %, seguido de una esterilización a alta temperatura. Estas herramientas se muestran en la Figura 1C.
  4. Coloque el tejido del bazo en una placa de Petri estéril figure-protocol-3de 100 mm sobre hielo y lave la sangre de la superficie con 1 solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) helada. Seque los tejidos del bazo con una gasa estéril y péselos después del secado.
    NOTA: Si el pañuelo está congelado, descongélelo en un plato durante 15 minutos sobre hielo antes de continuar.
  5. Hidrate el filtro de células (figure-protocol-470 μm) dejando caer 1 mL de PBS estéril en el filtro con una pipeta de transferencia estéril.
  6. Prepare el tampón digestivo (0,1% de colagenasa tipo I) utilizando 1x PBS con un mezclador de vórtice.
    NOTA: Use 10 mL de tampón digestivo por cada 100 mg de tejido del bazo. La concentración de colagenasa se eligió en este estudio con base en las instrucciones del producto. Para otros tipos de tejido, es posible que los investigadores deban ajustar estos parámetros en función de la densidad y la composición del tejido. Se recomiendan experimentos preliminares con diferentes concentraciones y tiempos de digestión para determinar las condiciones óptimas para cada tipo de tejido.

2. Digestión de tejidos

  1. Picar el tejido en trozos pequeños uniformes con unas tijeras en una placa de cultivo con hielo (Figura 3A) y transferirlo a un tubo de centrífuga de 50 ml con una pipeta de transferencia estéril.
  2. Agregue tampón de digestión al tubo de acuerdo con el peso del tejido del bazo como se indicó anteriormente (Figura 3B), luego agite el tubo con un ángulo de 45° en un agitador horizontal a 37 °C. Controle el progreso de la digestión y detenga la digestión cuando los trozos de tejido se hayan dispersado y la mayoría hayan perdido su forma. El tiempo de digestión debe variar entre tejidos. En las condiciones experimentales de este estudio, el tiempo de digestión es de aproximadamente 30 min.
  3. Transfiera la mezcla digerida a un colador de células (Ф70 μm) a temperatura ambiente (RT) para eliminar los restos de tejido fibroso y más grandes.
    NOTA: Filtración completa inmediatamente después de la digestión.
  4. Recoja el filtrado en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL.

3. Aislamiento de exosomas por centrifugación diferencial

  1. La centrífuga filtra a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Se puede ver un pellet que contiene células residuales, restos celulares y núcleos después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3C.
  2. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugue a 3000 x g durante 20 min a 4 °C. Se puede ver un pellet que contiene cuerpos apoptóticos y microsomas después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3D.
  3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifuga a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Los gránulos que contienen microvesículas y membrana plasmática se pueden ver después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3E.
  4. Ultracentrífuga el sobrenadante resultante a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C. Se puede ver un pellet en la parte inferior del tubo después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3F.
  5. Deseche el sobrenadante, lave el pellet con PBS y vuelva a ultracentrífugar a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C para obtener exosomas. Se puede ver un pellet en el fondo del tubo después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3G.
  6. Disuelva los exosomas aislados con PBS estéril (200 μL por bazo) y almacene los exosomas aislados en un nuevo tubo de centrífuga de 2 mL a -80 °C.

4. Caracterización de exosomas por microscopía electrónica de transmisión (TEM)

NOTA: Se utilizó TEM para determinar si el Exo extraído mostraba características vesículas. Las muestras Exo identificadas por microscopía electrónica deben ser muestras frescas o almacenadas brevemente a 4 °C durante un breve período de tiempo.

  1. Fije los exosomas (2-6 μg/μL) con paraformaldehído de grado de microscopía electrónica (EM) al 2% en RT durante 2 h.
  2. Coloque 10 μL de solución de exosomas en una malla de cobre, incube a RT durante 10 minutos, enjuague con agua destilada estéril y seque el exceso de líquido con papel absorbente.
  3. Tiñe la malla de cobre con acetato de uranilo al 2% durante 1 min, seca el exceso de líquido con papel de filtro y seca bajo una lámpara incandescente durante 2 min.
  4. Observar la muestra preparada bajo un microscopio electrónico de transmisión a 80 kV.

5. Distribución de tamaño y medición de la concentración de partículas de exosomas

  1. Cargue las nanopartículas de poliestireno estándar (250 nm) en el citómetro de nanoflujo.
  2. Mida la concentración de proteínas de las muestras Exo utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA. Diluya la muestra Exo con PBS de acuerdo con los resultados del ensayo de proteínas BCA (diluya los exosomas a 1-10 ng/μL), luego cargue las muestras Exo en el nanoflujo para medir la intensidad de dispersión lateral (SSI).
  3. Calcule la concentración de Exo de acuerdo con la relación entre SSI y concentración de partículas en las nanopartículas de poliestireno estándar.
    NOTA: Para la medición del tamaño, se genera una curva estándar cargando nanopartículas de sílice estándar con tamaños de gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) en el citómetro de nanoflujo. La carga de la muestra Exo sigue a esto. La distribución de tamaños de Exo se calculó de acuerdo con la cura estándar.

6. Confirmación de lisis e inmunotransferencia de proteínas exosomas

  1. Añada 100 μL de tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) al gránulo de exosomas para el análisis de proteínas.
  2. Vórtice vigorosamente, cúbralo con parafilm, muévase durante 20 minutos en RT, luego vuelva a vórtice.
  3. Centrifugar brevemente a 1000 x g durante 30-60 s para recoger la muestra, transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a -20 °C a -80 °C hasta el análisis.
  4. Para el inmunoblot, mezcle las muestras con un tampón de carga 5x para lograr una concentración 1x y prepárese para la electroforesis en gel.
  5. Si se desean controles de homogeneización de tejido completo, utilice un tampón de lisis fuerte con un inhibidor de la proteasa para lisar el tejido, como se detalló anteriormente. A continuación, centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 10 minutos y desechar el resto de la matriz extracelular, las células enteras o los restos celulares intactos.
  6. Hervir el tampón de muestra que contiene exosomas u homogeneizado de tejidos a 95 °C durante 5-10 min. Cargue la misma proteína por carril en un gel SDS-PAGE al 10%. La carga es igual a la proteína del homogeneizado del tejido como control.
  7. Proceda con la electroforesis en gel a una tensión de 80 V durante aproximadamente 2 h utilizando el tampón de electroforesis convencional. Realice el análisis de Western blot para confirmar la expresión de la proteína Exo en los lisados purificados y comparar la abundancia relativa de Exo en fracciones.

Resultados

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Aislamiento y purificación de exosomas derivados del bazo
Para aislar los exosomas del tejido del bazo de ratón, empleamos una combinación de digestión de colagenasa y ultracentrifugación diferencial (Figura 2). Los pasos iniciales consistieron en el tratamiento previo del tejido del bazo para eliminar la sangre de la superficie, seguido de la digestión con colagenasa tipo I. Este tratamiento enzimático facilitó la descomposición de los componentes de la matriz extracelular, liberando así los exosomas y preservando su integridad. Después de la digestión, se emplearon una serie de pasos de centrifugación para eliminar secuencialmente los desechos celulares, los cuerpos apoptóticos y las vesículas más grandes, culminando con la ultracentrifugación del sobrenadante a 120.000 x g para granular los exosomas. Los procedimientos de aislamiento posteriores produjeron gránulos solubles en PBS enriquecidos con Exo derivado del bazo, como se muestra en la Figura 3G.

Resultados de TEM
La morfología de los exosomas aislados se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión, un método de referencia para estudiar la caracterización de exosomas. TEM se usa comúnmente para validar la presencia de exosomas, evaluar la calidad de los exosomas y observar la morfología de los exosomas. Las imágenes TEM (Figura 4A) revelaron la presencia de vesículas en forma de copa, que son características de los exosomas. Estas vesículas mostraron una clara estructura de bicapa lipídica, lo que confirma el aislamiento exitoso de los exosomas del tejido del bazo.

Distribución del tamaño de Spleen-Exo
La distribución del tamaño y la concentración de los exosomas se determinaron utilizando un citómetro de nanoflujo. Los resultados (Figura 4B) indicaron que el diámetro de los exosomas aislados osciló entre 30 y 150 nm, con una concentración máxima de aproximadamente 60 nm. El diámetro de las partículas aisladas fue predominantemente de 50-80 nm, con una concentración media de partículas de 4,6 x 109 partículas/mL. Este rango de tamaño es consistente con las características previamente reportadas de los exosomas, lo que valida aún más el protocolo de aislamiento.

Análisis de Western blot
Para confirmar la presencia de marcadores exosomales, se realizó un análisis de Western blot. Los marcadores exosomales TSG101 y CD9 se detectaron en las muestras de Bazo-Exo, mientras que GM130, una proteína de la matriz de Golgi utilizada como control negativo, no se detectó (Figura 4C). En comparación, la proteína de estos marcadores se expresó en los tejidos del bazo de ratón (Spleen-T). Esto indica la alta pureza de los exosomas aislados, ya que estaban desprovistos de contaminantes celulares.

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Figura 1: Preparación de suministros. (A) Se colocaron tubos de centrífuga de 50 mL, placas de cultivo, hielo y herramientas quirúrgicas en un gabinete de bioseguridad. (B) Un filtro de células estériles (figure-results-270 μm). (C) Herramientas quirúrgicas esterilizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Procedimiento de aislamiento del bazo-exo. Prepare el tejido del bazo y córtelo en trozos pequeños en PBS helado, seguido de la digestión con colagenasa tipo I y la centrifugación según se indique. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes representativas del aislamiento de Spleen-Exo. (A) Pequeños bloques de bazo listos para su posterior digestión. (B) Bloques de tejido del bazo con tampón de digestión. (C) Pellets después de una centrifugación de 500 x g . (D) Pellets después de una centrifugación de 3.000 x g . (E) Pellets después de la centrifugación de 10.000 x g . (F) Pellets después de una centrifugación de 120.000 x g . (G) Pellets de exosomas después de una centrifugación de 120.000 x g . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Identificación de Spleen-Exo. (A) Resultados de TEM que muestran partículas aisladas como vesículas membranosas redondas u ovaladas con morfología en forma de copa. Barra de escala = 200 nm y 50 nm, respectivamente. (B) El análisis de la distribución de tamaño realizado por Flow Nano Analyzer mostró que el diámetro de Spleen-Exo osciló predominantemente entre 50 nm y 80 nm, con una concentración media de partículas de 4,6 × 109 partículas/mL. (C) Análisis de Western blot que muestra la expresión de proteínas marcadoras específicas de exosomas (TSG101 y CD9) en Spleen-Exo, con expresión negativa de GM130. Estos marcadores fueron detectables en muestras de proteínas extraídas de bazos de ratón (grupo Spleen-T). Se mostraron las imágenes representativas de Western blot (n = 6 tejidos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Investigaciones recientes han reportado que los exosomas derivados del bazo (Spleen-Exo) juegan un papel crítico en el tratamiento del cáncer gástrico12. Para dilucidar aún más las funciones de Spleen-Exo, es necesario establecer un método reproducible y óptimo para su extracción del tejido del bazo. Si bien existen protocolos para aislar exosomas del cáncer de cerebro e hígado 13,14, los métodos para otros tejidos siguen estando poco desarrollados y requieren una mayor validación. En este estudio, hemos esbozado un método práctico para aislar Exo del tejido del bazo.

En los últimos años, se han utilizado varios métodos para extraer Exo en investigaciones y aplicaciones científicas, incluida la ultracentrifugación, la centrifugación en gradiente de densidad, la inmunoadsorción de perlas magnéticas, la ultrafiltración y la precipitación de polímeros15. La ultracentrifugación sigue siendo el método de referencia para extraer Exo de varias fuentes. Los estudios anteriores se han centrado en la alteración de las estructuras tisulares para obtener concentraciones más altas de Exo, que consiste en fuentes intracelulares y extracelulares de Exo16. La colagenasa minimiza el impacto en la integridad de la membrana celular, asegurando la pureza de Ti-Exo3. La colagenasa se ha utilizado para extraer vesículas extracelulares de tejidos de melanoma metastásico humano, cáncer adiposo, cáncer de colon y cáncer de hígado 5,10,13,17. Sin embargo, la concentración y el tiempo de digestión de la colagenasa varían entre los diferentes tejidos.

Establecimos un protocolo específico para aislar Spleen-Exo utilizando colagenasa tipo I para la digestión, seguido de filtración a través de ultracentrifugación diferencial, para producir Spleen-Exo de alta calidad. La ultracentrifugación puede eliminar eficazmente las células residuales, las vesículas grandes, los restos celulares y los cuerpos apoptóticos de las muestras16. Crescitelli et al. emplearon colagenasa D y ultracentrifugación en gradiente para aislar pequeñas vesículas extracelulares con un tamaño medio de 75 nm de diámetro5. En comparación con su protocolo, nuestro protocolo utilizó colagenasa tipo I y un paso de ultracentrifugación adicional a 120.000 x g para lograr una pureza óptima de los exosomas. A diferencia de los informes anteriores que utilizan la homogeneización de tejidos para obtener la suspensión tisular14,18, nuestro enfoque preserva la integridad de la membrana de las células en los tejidos. Además, Vella et al. aplicaron centrifugación en gradiente de densidad (un gradiente triple de sacarosa) para generar tres grupos de partículas, lo que requirió tiempo adicional para la operación10. Este enfoque produjo vesículas grandes con un tamaño de más de 200 nm, una población heterogénea de vesículas con tamaños que oscilan entre 50 nm y 200 nm, y vesículas pequeñas de alrededor de 20 nm de tamaño. El protocolo descrito en este protocolo de estudio implica una serie de pasos de ultracentrifugación para eliminar metódicamente las células residuales, los restos celulares, los cuerpos apoptóticos y las vesículas más grandes, mejorando así la pureza del Exo obtenido. Hacemos hincapié en el manejo cuidadoso durante la recolección del sobrenadante para evitar perturbar los pellets sedimentados.

Evaluamos la morfología y pureza del Spleen-Exo aislado a través de TEM y análisis de seguimiento de nanopartículas. Ambos ensayos revelaron que las partículas derivadas del bazo aisladas por este protocolo exhibían una bicapa lipídica y vesículas en forma de copa con tamaños que oscilaban entre 30 nm y 150 nm, que son las características típicas de los exosomas19. CD9 y TSG101 son marcadores de exosomas19, y GM130, una proteína de Golgi, se utiliza como marcador negativo para la identificación de exosomas20. Los resultados mostraron que Spleen-Exo fue positivo para CD9 y TSG101, mientras que GM130 no se detectó, lo que confirma el aislamiento exitoso de Exo derivado de tejido de alta calidad del bazo.

Para lograr Ti-Exo de alta calidad, es esencial seleccionar el tipo de enzima, la concentración y la duración de la digestión adecuados, así como el almacenamiento adecuado de los tejidos. No observamos diferencias significativas en las concentraciones de proteínas entre Exo derivadas de tejidos de bazo frescos frente a tejidos congelados (datos no mostrados), lo que indica la viabilidad de procesar grandes cantidades de tejidos congelados para reducir el flujo de trabajo. El aislamiento de Ti-Exo requiere un largo tiempo de funcionamiento para la ultracentrífuga, lo que hace que sea poco práctico completar todo el protocolo dentro de un período adecuado cuando se utilizan tejidos frescos en aplicaciones clínicas. Por lo tanto, el uso de tejidos congelados para el aislamiento de exosomas sería una mejor opción. La descongelación a 37 °C no es adecuada para tejidos congelados debido a la penetración incompleta de los agentes crioprotectores en los tejidos. Se reportó que al realizar el aislamiento de exosomas utilizando tejidos congelados descongelados en hielo, el rendimiento de exosomas no mostró significancia en el contenido en comparación con los tejidos frescos21. Por lo tanto, descongelamos los tejidos de bazo congelados en hielo para realizar el aislamiento de exosomas cuando se utilizaron las muestras de almacenamiento a -80 °C.

Sin embargo, el protocolo descrito en este estudio tiene varias limitaciones. Los extensos pasos involucrados en la extracción e identificación requieren mucho tiempo. Dado el objetivo final de aplicar la investigación Exo al tratamiento clínico de enfermedades, los métodos más rápidos y rentables son cada vez más críticos. Además, aunque los resultados se basan en muestras de tejido de ratón, la aplicabilidad a los tejidos humanos aún no se ha determinado.

En conclusión, el protocolo proporciona un método para extraer Exo de alta pureza del tejido del bazo, adecuado para el análisis detallado posterior. Los Exo derivados de tejidos reflejan el microambiente de su origen con mayor precisión y tienen un potencial significativo para dilucidar los procesos fisiológicos y patológicos en los organismos vivos. Futuros estudios podrían adaptar este protocolo a tejidos humanos, permitiendo la extracción de exosomas clínicamente relevantes con fines diagnósticos y terapéuticos. Esta técnica podría ser particularmente útil para estudiar el papel de los exosomas en las respuestas inmunitarias, dada la función crítica del bazo en el sistema inmunitario. Además, el protocolo podría modificarse para aislar exosomas de otros tejidos, lo que podría ayudar en el desarrollo de biomarcadores específicos de tejidos y terapias dirigidas. Al mejorar nuestra comprensión de la biología de los exosomas, este protocolo puede contribuir a los avances en la medicina de precisión y al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82370281, 81870222), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (2022A1515012103) y el Proyecto de Asignación Competitiva del Fondo Especial de Desarrollo Tecnológico y Ciencia de la ciudad de Zhanjiang (2021A05086), y la Fundación Startup del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangdong (23H03).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
70 y micro; m Filtro de célulasBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anti CD9 anticuerpoCell Signaling Technology, Inc (CST), EE. UU.983275
Anticuerpo GM130Proteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
Anticuerpo anti TSG101Abcam Plc, Reino Unido125011
Placa de cultivo celularWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China704001
Tubo de centrífugaWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China788211
Colagenasa Tipo ISigma-Aldrich Corp., EE. UU.C2674
Agitadortermostático de escritorioShanghai bluepard instruments Co., Ltd., ChinaTHZ-100
Tampón de electroforesisWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China  G2081-1L
Kit de ensayo de proteína BCA mejoradoShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China  P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., ChinaN30E
Sistema de imágenes de fluorescencia/quimioluminiscencia Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ChinaGelView 6000Plus
HRP Cabra anti-ratón IgGProteintech Group, Inc.China  15014
HRP Cabra anti-Conejo IgGProteintech Group, Inc.China 15015
lector de microplacasMolecular Devices, EE. UU.Microtijeras CMax Plus
Shanghai  Médico  Instrumentos (grupo) Co., Ltd.,ChinaWA1010
Pinzas microscópicasShanghai  Médico  Instrumentos (grupo) Co., Ltd.,ChinaWA3010
Multifuge X1R Pro centrífugaThermo Fisher Scientific, EE. UU.75009750
Tijeras oftálmicasShanghai  Médico  Instrumentos (grupo) Co., Ltd.,ChinaY00030
Pinzas oftálmicasShanghai  Médico  Instrumentos (Grupo) Co., Ltd., China JD1060
Optima XPN-100 Centrífuga de ultrafiltraciónBeckman Coulter, EE. UU.A94469
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., ChinaP1003
Tampón de lisis RIPA (fuerte, sin inhibidores)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China  P0013K
ReglaDeli  Fabricación  Compañía, China
SDS-PAGE Tampón de carga de muestras, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China  P0015
Pipeta de transferenciaBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Microscopio electrónico de transmisiónHitachi, JapónH-7650
Tubo de ultracentrifugaciónBeckman Coulter, EE. UU355618
Tampón de transferencia occidental Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China  G2028-1L
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Referencias

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