Optimización de la preparación de muestras para microscopía electrónica criogénica

Summary

Este protocolo presenta un método práctico que utiliza Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como ejemplo para abordar la distribución desigual de partículas a través de la optimización de la preparación de muestras, proporcionando una referencia para que los investigadores diluciden de manera eficiente estructuras macromoleculares utilizando microscopía electrónica criogénica (crio-EM).

Abstract

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) ha revolucionado la biología estructural al permitir el estudio de estructuras macromoleculares en condiciones casi nativas, suspendidas en hielo vítreo. Esta técnica permite la visualización de alta resolución de proteínas y otras biomoléculas sin necesidad de cristalización, lo que ofrece información significativa sobre su función y mecanismo. Los avances recientes en el análisis de una sola partícula, junto con un mejor procesamiento de datos computacionales, han hecho de la crio-EM una herramienta indispensable en la biología estructural moderna. A pesar de su creciente adopción, la crio-EM se enfrenta a desafíos persistentes que pueden limitar su efectividad, en particular la distribución desigual de las partículas. Este problema a menudo conduce a una resolución deficiente y una precisión reducida en las estructuras de proteínas reconstruidas. Este artículo describe un enfoque simple y práctico para abordar este desafío, utilizando la pequeña proteína de choque térmico de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como ejemplo. El método optimiza la preparación de la muestra para minimizar la adsorción preferencial, lo que garantiza una distribución más homogénea de las partículas y estructuras crio-EM de proteínas de mayor calidad. Esta técnica ofrece una valiosa orientación para los investigadores que buscan superar desafíos similares en los estudios estructurales.

Introduction

Con los recientes avances tanto en el hardware de instrumentos ^1,2 como en el software de procesamiento de imágenes ^3,4,5, la microscopía electrónica criogénica (crio-EM) se ha convertido en una herramienta popular y poderosa en la biología estructural moderna. A pesar de estos avances, persisten cuellos de botella en el logro de estructuras macromoleculares de alta resolución mediante el uso de crio-EM. Uno de estos desafíos significativos es la distribución desigual de las partícula....

Protocol

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Purificación de proteínas

1. Inducir la expresión de MjsHSP16.5 recombinante en E. coli BL21(DE3) y purificar la proteína utilizando una columna de cromatografía quelante de níquel como se describió anteriormente²⁶. Después de la purificación en una columna²⁶ de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), examine la pureza de la proteína cargando 5 μL de fracciones pico en un gel SDS-PAGE al 12,5% y ....

Results

Para identificar las condiciones óptimas de la red para MjsHSP16.5, se llevó a cabo un cribado inicial de crio-EM, centrándose principalmente en el examen de varias condiciones del tampón de proteínas: (1) el tampón de purificación final, que garantiza la estabilidad y homogeneidad de MjsHSP16.5 y es importante para su cristalización³⁰; (2) tampones adaptados de las condiciones necesarias para el crecimiento de cristales MjsHSP16.5 de alta calidad de difracción³⁰; y (3) tam.......

Discussion

Todos los estudios estructurales de proteínas comienzan con la purificación de proteínas, un proceso iterativo para lograr un equilibrio entre el aislamiento de objetivos proteicos con alta pureza y homogeneidad, al tiempo que se preserva su funcionalidad nativa. A pesar de que las composiciones de tampones para purificar y preservar las muestras de proteínas se seleccionan cuidadosamente durante el proceso de purificación, estos tampones suelen plantear desafíos durante la posterior pre.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de fondo redondo de 14 mL	SPL Life Sciences	40114
250 y micro; L Jeringa hermética al gas modelo 1725 LTN	Hamilton	81100	Aguja cementada, calibre 22s, 2 pulgadas, estilo de punta 2
50 y micro; L botón de diálisis	Hampton Research	HR3-326
Vaso de precipitados de vidrio de 50 ml	DIAMOND	HA.1010D.50
Ä KTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC Amicon
Ultra-15 Unidad de Filtro Centrífugo	Millipore		UFC905024 50-KDa NMWL
Bradford Reactivo	Supelco	B6916
Dumoxel Estilo N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Tubo de	28989335
1,5 mL	HD Micro	H23015
Tubos de PCR de 0,2 mL, tapa plana	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Unidad de descarga de brillo	Ted Pella	91000
Bloque de soporte de rejilla PELCO TEM	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Microscopía Electrónica de Cu	Ciencias	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Tubo de membrana de diálisis	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Acetato de uranilo	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Kit de cribado tampón y detergentes	ThermoFisher Scientific	A49856