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Artículo de método

Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

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DOI:

10.3791/67264

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27 de septiembre de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un método para inducir la lesión por isquemia-reperfusión mesentérica y visualizar trampas extracelulares (TNE) de neutrófilos en vénulas mesentéricas mediante microscopía intravital. El flujo sanguíneo en la arteria mesentérica superior se restringió durante 1 h, seguido de reperfusión, lo que permitió cuantificar directamente la adhesión leucocitaria y la NETosis.

Resumen

La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) intestinal es una afección aguda caracterizada por un daño tisular resultante de la restricción del flujo sanguíneo a los vasos mesentéricos, lo que conduce a patologías tanto locales como sistémicas con un mal pronóstico. Tanto la isquemia como la reperfusión desencadenan una serie de respuestas celulares y moleculares, en las que las células inflamatorias actúan como reguladores clave de la patología. Estas interacciones con el endotelio isquémico están mediadas por múltiples receptores de adhesión. Se han establecido varios modelos animales para imitar esta patología e investigar las vías moleculares involucradas. En este estudio, se combina un modelo microquirúrgico de lesión I/R con microscopía intravital para visualizar el balanceo de los leucocitos, la adhesión y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Este modelo se aplica a ratones transgénicos deficientes en PAR1 endotelial (F2r) para evaluar el impacto de PAR1 en el rodaje de leucocitos y la formación de NET 1 h después de la isquemia e inmediatamente después de la reperfusión. In vivo, se empleó la tinción de leucocitos con naranja de acridina y los NET se visualizaron mediante una tinción de ácido nucleico. Curiosamente, se observó una reducción de la adhesión de los leucocitos y de la formación de NET en ratones que carecían del receptor endotelial PAR1. Este modelo permite el análisis in vivo de los reguladores clave implicados en la lesión I/R.

Introducción

La isquemia mesentérica aguda (IAM) es una patología poco frecuente1 con alto riesgo de mortalidad2, caracterizada por una disminución del flujo sanguíneo en el mesenterio debido a trombos en el eje celíaco, o en la arteria mesentérica superior o inferior. En el 60-70% de los casos, las oclusiones agudas de la arteria mesentérica superior debidas a trombosis o embolización son responsables de la isquemia intestinal aguda3. Por el contrario, en el 5-15% de los casos, la trombosis venosa mesentérica representa una isquemia mesentérica que afecta a la vena mesentérica superior y, más raramente, a la vena mesentérica inferior4. La hipoxia y la desnutrición derivadas de la isquemia conducen a trastornos del metabolismo energético a nivel celular5. Por ejemplo, el deterioro de la función mitocondrial activa múltiples vías de señalización, iniciando mecanismos de muerte celular6. Aunque la reperfusión rápida permite la restauración del metabolismo aeróbico, la restauración del flujo sanguíneo a una región isquémica a menudo causa una lesión tisular extensa debido a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)7, sobrecarga de calcio8, disfunción endotelial9 y respuestas inflamatorias10.

Se han establecido muchos modelos animales experimentales que emplean la oclusión vascular temporal de la arteria mesentérica superior para dilucidar los mecanismos moleculares durante la lesión por isquemia-reperfusión (I/R)11. El uso de estos modelos en combinación con la microscopía intravital (MIV) es fundamental para obtener información sobre las interacciones celulares subyacentes y la progresión de la enfermedad11. La disfunción de la barrera intestinal se observa poco después de la isquemia12, con la pérdida de integridad del epitelio13, lo que resulta en la translocación bacteriana a sitios extraintestinales como los ganglios linfáticos mesentéricos, el bazo, el hígado y el riñón12,14. La reperfusión agrava aún más la lesión de la mucosa15. Una respuesta inflamatoria en las arteriolas se manifiesta por la adhesión rodante y firme de los leucocitos a la capa de células endoteliales, que depende de moléculas como la L-selectina16, la P-selectina (CD62P)17, las plaquetas GPIIb/IIIa y el fibrinógeno18. Curiosamente, la adhesión de los leucocitos a las vénulas mesentéricas está influenciada por la presencia de microbiota intestinal19 y la señalización del receptor tipo Toll 410. La lesión I/R también desencadena la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)10. La diana terapéutica del ADN extracelular, procedente de leucocitos activados como los neutrófilos, mejora el resultado de la lesión intestinal I/R20. En el hígado, la lesión I/R es provocada por los micrófagosresidentes 21, y la inhibición del microARN atenúa notablemente la apoptosis22. Cabe destacar que la lesión I/R en el mesenterio da lugar a una disbiosis intestinal, que es reversible y se resuelve después de la revascularización23.

El endotelio también se ve influenciado por los efectos dañinos de la lesión I/R, con las ROS desempeñando un papel fundamental en el proceso24. Se observa adhesión de leucocitos a la capa celular endotelial, daño endotelial y alteraciones del metabolismo del óxido nítrico (NO)9. Sin embargo, las vías moleculares involucradas aún no se han explorado por completo.

El receptor activado por proteasa 1 (PAR1, F2r), es un receptor de membrana expresado por una variedad de células, incluidas las células endoteliales, y se activa durante condiciones inflamatorias25. Su activación se produce cuando las serina proteasas escinden el receptor en el extremo N-terminal, exponiendo el ligando anclado que, a su vez, activa el receptor uniéndose al segundo bucle extracelular de la molécula26. La vía de señalización del receptor de proteína endotelial C (EPCR)-PAR1 afecta a la homeostasis endotelial del NO y facilita el restablecimiento del flujo sanguíneo en la isquemia periférica27.

En este estudio, se aplicó la lesión I/R a un modelo genético de ratón caracterizado por una deficiencia de PAR1 específica de células endoteliales para visualizar el balanceo, la adhesión y la formación de NET de los leucocitos. La combinación de un modelo genético de ratón y la microscopía intravital después de la microcirugía I/R proporciona información valiosa al destacar los tipos específicos de células implicadas en la progresión de la enfermedad. La aplicación de la lesión I/R a modelos genéticos de ratón es fundamental para identificar posibles dianas terapéuticas que pueden utilizarse para mejorar el curso de la enfermedad. Además, se demostró la importancia de PAR1 endotelial en la NETosis.

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Protocolo

Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el comité local de legislación animal (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Coblenza, Alemania; G21-1-041). 6-8 semanas de edad macho y hembra B6. Para el estudio se utilizaron ratones FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc. La regulación específica de las células endoteliales de F2r (PAR1) se produce a través del promotor VE-Cadherin Cre28. En este estudio, flox-F2r x VE-Cadherin Cre+ (F2RΔEC) exhibió una expresión reducida de F2r (PAR1) en las células endoteliales, y flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) expresa niveles normales de F2r (PAR1) endotelial. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación para la cirugía

  1. Esterilizar el instrumental quirúrgico necesario (tijeras extra estrechas rectas, fórceps, pinza vascular, etc.).
  2. Prepare el sistema de anestesia a base de oxígeno e isoflurano con un cono nasal y una placa calefactora.

2. Preparación animal

  1. Pesa al animal.
  2. Realizar anestesia: Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución que contenga midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,5 mg/mL) y fentanilo (0,5 mg/kg) (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
  3. Retire el vello del área de operación del cuello y el abdomen con una afeitadora eléctrica para animales pequeños.
  4. Coloque el mouse en decúbito dorsal sobre la almohadilla térmica y conéctelo al sistema de oxígeno a través de un cono nasal. Asegure las extremidades del ratón a una almohadilla térmica con cinta quirúrgica. Asegúrese de que la membrana del cono de látex de la nariz se ajuste firmemente sobre la cabeza del ratón. Controle la temperatura corporal del animal por vía rectal con un termómetro específico para roedores.
  5. Aplique crema depilatoria para eliminar cualquier resto de vello de la zona quirúrgica del cuello y limpie la piel de la zona de operación con etanol al 70%.
  6. Realice una prueba de pellizco de los dedos del pie (reflejo del pedal) para asegurarse de que el animal esté completamente anestesiado.

3. Procedimiento quirúrgico

  1. Implante de catéter en la vena yugular
    1. Haga una incisión transversal (~0,5 cm) sobre la tráquea, retire la piel que cubre el cuello y aísle la vena yugular derecha.
    2. Utilice un hilo de seda de unos 5 cm, cierre el extremo distal de la vena y fíjelo con pinzas quirúrgicas. Coloque tres hilos de seda a unos 2 cm por debajo de la vena: uno cerca del extremo distal y dos cerca del extremo proximal de la vena yugular. Haga un nudo quirúrgico, pero no cierre el vaso.
    3. Prepare un catéter de polietileno (0,28 mm de diámetro interior, 0,61 mm de diámetro exterior) lleno de NaCl al 0,9% y taponado con una jeringa de 1 ml. Use unas tijeras para cortar un orificio entre el segundo y el tercer nudo e implantar el catéter en la vena yugular. Aspire la jeringa para asegurarse de que haya sangre en el catéter.
    4. Fije el catéter en la vena atando el hilo de seda, asegurándose de que esté bien sujeto. Use cinta médica para asegurar la jeringa.
    5. Preparar naranja de acridina: diluir 1:4 a 2 mg/mL de solución madre con solución salina estéril (concentración final de 0,5 mg/mL) en una jeringa de 1 mL. Mantenga la jeringa en la oscuridad e inyecte 50 μL en el ratón.
    6. Preparar el colorante de ácido nucleico: diluir 1:1000 una solución madre de 5 mM con solución salina estéril (concentración final de 5 μM) en una jeringa de 1 mL. Mantenga la jeringa en la oscuridad e inyecte 50 μL en el ratón.
    7. Inyectar naranja de acridina in vivo (50 μg/μL, 50 μL por ratón) a través del catéter de la vena yugular para visualizar los leucocitos teñidos y un colorante fluorescente de ADN extracelular de forma similar a la tinción de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) (5 μM, 50 μL por ratón). Se obtienen imágenes simultáneas de los tumores neuroendocrinos y los leucocitos.
  2. Modelo de lesión mesentérica I/R
    1. Desinfectar la piel abdominal con etanol al 70%.
    2. Realizar una laparotomía de 3-5 cm a lo largo de la línea alba con tijeras quirúrgicas.
    3. Con dos puntas de algodón humedecidas con solución salina, retire suavemente el intestino e identifique un lugar con una cobertura mínima de grasa. Coloque las ramas del intestino delgado sobre una masa negra para reducir la señal de fondo.
    4. Adquiera los videos antes de I/R (pre isquemia).
    5. Haga una compresa humectante con NaCl y coloque el intestino en ella. Asegúrese de que el intestino esté rodeado por la compresa y mantenga la humedad durante el paso 5.6.
    6. Ocluir la arteria mesentérica superior con una pequeña pinza vascular.
    7. Empuje suavemente el intestino hacia la cavidad abdominal con hisopos de algodón humedecidos con solución salina y use una sutura 7-0 para cerrar la pared abdominal y evitar la pérdida de humedad y temperatura. Mantener la isquemia durante 60 min, controlando la anestesia al menos cada 20 min.
    8. Después de 1 h, inicie la reperfusión retirando la pinza.
      NOTA: La ejecución adecuada del procedimiento de isquemia da como resultado un cambio visible. Inicialmente, el área afectada aparecerá pálida o blanca debido a la falta de flujo sanguíneo. Al retirar la pinza, el flujo sanguíneo regresará gradualmente a la región isquémica, que recuperará su color normal, lo que significa una oclusión exitosa. Es imperativo observar de cerca al ratón de forma continua durante toda la etapa de isquemia.
    9. Después del período isquémico, aplique unas gotas de solución salina en el área recortada, luego retire suavemente los clips microvasculares con un aplicador de clips.
    10. Con puntas de algodón humedecidas con solución salina, vuelva a retirar suavemente el intestino, coloque las pequeñas ramas de la vena sobre una masa negra, vuelva a inyectar 50 μL de naranja acridina y capture los vídeos de la misma vena en el mismo lugar (postisquemia).

4. Microscopía de epifluorescencia de video de alta velocidad intravital

  1. Visualice leucocitos y NET con un microscopio de fluorescencia de campo amplio de alta velocidad equipado con un condensador de larga distancia, un monocromador, un objetivo de inmersión en agua 10x y una cámara de dispositivo de carga acoplada. La adquisición de la imagen se realizó con un tiempo de exposición de 30 ms y filtros Alexa Fluor 488 (495/519) y Rhodamine Red (570/590).
  2. Utilice software de procesamiento de imágenes para la adquisición y el análisis de imágenes.
  3. Cuantifique el reclutamiento de células dentro de una región de interés de 0,06 mm².
  4. Cuantificar los leucocitos adheridos como células que permanecen estacionarias o unidas al revestimiento endotelial durante un período de observación de 20 s.
  5. Identifique los NET como estructuras extracelulares marcadas con colorantes fluorescentes de leucocitos y ácidos nucleicos extracelulares.
  6. Sacrificar a los animales por luxación cervical al final del experimento (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).

5. Aislamiento de células endoteliales hepáticas (LEC) y RT-PCR cuantitativa

  1. Aislar LECs mediante clasificación por celdas magnéticas (MACS)29.
  2. Aislar el ARN total.
  3. Realice la síntesis complementaria de ADN (ADNc)27 mezclando 2 μg de ARN total con 2 μL de tampón RT, 0,8 μL de mezcla dNTP, 2 μL de cebadores aleatorios RT, 1 μL de transcriptasa inversa y 4,2 μL de H2O destilado estéril.
  4. La transcripción del ADNc se realizó aplicando las siguientes condiciones: 25 °C durante 10 min, 37 °C durante 120 min, 85 °C durante 5 min.
  5. Utilice 20 ng de ADNc para qPCR.
  6. Utilice los siguientes cebadores: F2r (adelante): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (atrás): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTTTT, L32 (adelante): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (atrás): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Utilice las siguientes condiciones: 95 °C 30 s, 45 ciclos de (95 °C durante 10 s, 60 °C durante 25 s), 60 °C a 95 °C durante 6 s con ΔΤ 1 °C.

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Resultados

Para estudiar los efectos dependientes de las células endoteliales sobre la formación y adhesión de los leucocitos, así como sobre la formación de NET, inicialmente, se examinó la eficacia de la deficiencia de F2r inducible por VE-Cadherin Cre en células endoteliales. Se empleó la clasificación magnética de células para aislar las células endoteliales hepáticas. Posteriormente, se aisló el ARN, seguido de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los ratones F2r ΔEC, en los que la Cre recomb...

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Discusión

La lesión mesentérica I/R combinada con microscopía intravital se aplicó a un modelo genético de ratón de deficiencia de F2r (PAR1) en células endoteliales para el análisis in vivo de leucocitos y NET después de 1 h de isquemia. El modelo de lesión mesentérica I/R se utiliza con frecuencia en roedores, con tiempos de isquemia y reperfusión que varían de minutos a varias horas23,31, influyendo en el resultado inf...

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Divulgaciones

Los autores no revelan ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

C.R. agradece la financiación de Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz y ReALity (proyecto MORE), el BMBF Cluster4Future CurATime (proyecto MicrobAIome; 03ZU1202CA), la Wilhelm Sander-Stiftung (Nr. 2022.131.1) y el Fondo de Innovación "Microbioma" de la Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG). C.R. es científico del Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK). C.R. es miembro del Centro de Biología Vascular Traslacional (CTVB), del Centro de Investigación en Inmunoterapia (FZI) y del Potentialbereich EXPOHEALTH de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia. C.R. es miembro de la Unidad de Investigación DFG 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). C.R. fue galardonado con una beca del Colegio de Investigación Gutenberg de la Universidad Johannes Gutenberg de Maguncia. K.K. cuenta con el apoyo del Programa de Excelencia "Promoción de Mujeres Científicas" de DZHK y es miembro de Young DZHK. Z.G y O.D. son estudiantes de doctorado en la Escuela de Investigación de Biomedicina Traslacional de Maguncia (TransMed).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Naranja acridinaSigma-Aldrich   A-6014
Placa de 96 pocillos Múltiple PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Sistemas de anestesia para roedoresGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
masa negraArcilla de modelarStaedtler
CD146 Microperlas, ratónMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympusOlympus cellSense Dimension Desktop 2.3software
dispositivo de carga acoplada cámaraHamamatsu PhotonicsORCA-R2
cámara bastoncillos de algodónBö ttger09-119-9100
Hemostático curvo 125mm/5"Instrumentos índigo 22466
Crema depilatoriaBaleano aplicable
Dorbene Vetzoetis Pinzas
DumontFine Science Tools11251-35
Etanol p.a. 99,5 %Roth5504.20
Tijeras extraestrechas – Recto/Afilado-Afilado/10.5FST14088-10
FentaniloPinzas Janssen-Cilag GmBH
"Dumont #5" (Inox, punta 0,1 mm, longitud 11 cm)FST11251-20
GentleMACS C TubosMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpadPrism 10software
isoflurano Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Verde Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
Cinta médica LeukofixBSNMedical0213600
Kit de disociación hepática, ratónMiltenyi Biotec130-105-807
LS-Columnas de separación MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Smart Strainer 100 y micro; mMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Sellos BioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun 2350748
PortaagujasFST12001-13
Sutura de seda trenzada no absorbible, Tamaño: 7/0, 91 metros Fine Science Tools18020-70
Microscopio de fluorescencia Olympus BX51WIMicroscopioOlympus
PCR para tiras de tuboSarstedt72985002.00
Tapas de tubo de PCRSarstedt65989002.00
Catéter de polietilenoSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G), Polipropileno 6-0, Nahtmaterial Johnson & Johnson Medical GmbH 8695H
Relia Prep ARN Miniprep SystemsPromegaZ6112
Kit de Transcripción Inversa (ADNc de Alta Capacidad)Applied Biosystems4368813.00
Báscula escolar KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
Tijeras de resorte - Inclinadas a los ladosFST15006-09
Microscopio estereoscópicoLeicaM50
Hemostáticos rectos 135mm/5.5"Indigo Instruments 22468
Jeringa 1 mLBraun9166017V
SYTOX NaranjaThermo Fisher ScientificS11368
Controlador de temperatura TC-1000FMI Fö hr Medical Instruments GmbHno aplicable
Pinza de tejido - 1x2 dientesFST18057-14
pinza vascularFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480

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