Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

Resumen

Este protocolo presenta un método para inducir la lesión por isquemia-reperfusión mesentérica y visualizar trampas extracelulares (TNE) de neutrófilos en vénulas mesentéricas mediante microscopía intravital. El flujo sanguíneo en la arteria mesentérica superior se restringió durante 1 h, seguido de reperfusión, lo que permitió cuantificar directamente la adhesión leucocitaria y la NETosis.

Resumen

La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) intestinal es una afección aguda caracterizada por un daño tisular resultante de la restricción del flujo sanguíneo a los vasos mesentéricos, lo que conduce a patologías tanto locales como sistémicas con un mal pronóstico. Tanto la isquemia como la reperfusión desencadenan una serie de respuestas celulares y moleculares, en las que las células inflamatorias actúan como reguladores clave de la patología. Estas interacciones con el endotelio isquémico están mediadas por múltiples receptores de adhesión. Se han establecido varios modelos animales para imitar esta patología e investigar las vías moleculares involucradas. En este estudio, se combina un modelo microquirúrgico de lesión I/R con microscopía intravital para visualizar el balanceo de los leucocitos, la adhesión y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Este modelo se aplica a ratones transgénicos deficientes en PAR1 endotelial (F2r) para evaluar el impacto de PAR1 en el rodaje de leucocitos y la formación de NET 1 h después de la isquemia e inmediatamente después de la reperfusión. In vivo, se empleó la tinción de leucocitos con naranja de acridina y los NET se visualizaron mediante una tinción de ácido nucleico. Curiosamente, se observó una reducción de la adhesión de los leucocitos y de la formación de NET en ratones que carecían del receptor endotelial PAR1. Este modelo permite el análisis in vivo de los reguladores clave implicados en la lesión I/R.

Introducción

La isquemia mesentérica aguda (IAM) es una patología poco frecuente¹ con alto riesgo de mortalidad², caracterizada por una disminución del flujo sanguíneo en el mesenterio debido a trombos en el eje celíaco, o en la arteria mesentérica superior o inferior. En el 60-70% de los casos, las oclusiones agudas de la arteria mesentérica superior debidas a trombosis o embolización son responsables de la isquemia intestinal aguda³. Por el contrario, en el 5-15% de los casos, la trombosis venosa mesentérica representa una isquemia mesentérica que afecta a la vena mesentérica superior y, más raramente, a la vena mesentérica inferior⁴. La hipoxia y la desnutrición derivadas de la isquemia conducen a trastornos del metabolismo energético a nivel celular⁵. Por ejemplo, el deterioro de la función mitocondrial activa múltiples vías de señalización, iniciando mecanismos de muerte celular⁶. Aunque la reperfusión rápida permite la restauración del metabolismo aeróbico, la restauración del flujo sanguíneo a una región isquémica a menudo causa una lesión tisular extensa debido a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)⁷, sobrecarga de calcio⁸, disfunción endotelial⁹ y respuestas inflamatorias¹⁰.

Se han establecido muchos modelos animales experimentales que emplean la oclusión vascular temporal de la arteria mesentérica superior para dilucidar los mecanismos moleculares durante la lesión por isquemia-reperfusión (I/R)¹¹. El uso de estos modelos en combinación con la microscopía intravital (MIV) es fundamental para obtener información sobre las interacciones celulares subyacentes y la progresión de la enfermedad¹¹. La disfunción de la barrera intestinal se observa poco después de la isquemia¹², con la pérdida de integridad del epitelio¹³, lo que resulta en la translocación bacteriana a sitios extraintestinales como los ganglios linfáticos mesentéricos, el bazo, el hígado y el riñón^12,14. La reperfusión agrava aún más la lesión de la mucosa¹⁵. Una respuesta inflamatoria en las arteriolas se manifiesta por la adhesión rodante y firme de los leucocitos a la capa de células endoteliales, que depende de moléculas como la L-selectina¹⁶, la P-selectina (CD62P)¹⁷, las plaquetas GPIIb/IIIa y el fibrinógeno¹⁸. Curiosamente, la adhesión de los leucocitos a las vénulas mesentéricas está influenciada por la presencia de microbiota intestinal¹⁹ y la señalización del receptor tipo Toll 4¹⁰. La lesión I/R también desencadena la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)¹⁰. La diana terapéutica del ADN extracelular, procedente de leucocitos activados como los neutrófilos, mejora el resultado de la lesión intestinal I/R²⁰. En el hígado, la lesión I/R es provocada por los micrófagos^{residentes 21}, y la inhibición del microARN atenúa notablemente la apoptosis²². Cabe destacar que la lesión I/R en el mesenterio da lugar a una disbiosis intestinal, que es reversible y se resuelve después de la revascularización²³.

El endotelio también se ve influenciado por los efectos dañinos de la lesión I/R, con las ROS desempeñando un papel fundamental en el proceso²⁴. Se observa adhesión de leucocitos a la capa celular endotelial, daño endotelial y alteraciones del metabolismo del óxido nítrico (NO)⁹. Sin embargo, las vías moleculares involucradas aún no se han explorado por completo.

El receptor activado por proteasa 1 (PAR1, F2r), es un receptor de membrana expresado por una variedad de células, incluidas las células endoteliales, y se activa durante condiciones inflamatorias²⁵. Su activación se produce cuando las serina proteasas escinden el receptor en el extremo N-terminal, exponiendo el ligando anclado que, a su vez, activa el receptor uniéndose al segundo bucle extracelular de la molécula²⁶. La vía de señalización del receptor de proteína endotelial C (EPCR)-PAR1 afecta a la homeostasis endotelial del NO y facilita el restablecimiento del flujo sanguíneo en la isquemia periférica²⁷.

En este estudio, se aplicó la lesión I/R a un modelo genético de ratón caracterizado por una deficiencia de PAR1 específica de células endoteliales para visualizar el balanceo, la adhesión y la formación de NET de los leucocitos. La combinación de un modelo genético de ratón y la microscopía intravital después de la microcirugía I/R proporciona información valiosa al destacar los tipos específicos de células implicadas en la progresión de la enfermedad. La aplicación de la lesión I/R a modelos genéticos de ratón es fundamental para identificar posibles dianas terapéuticas que pueden utilizarse para mejorar el curso de la enfermedad. Además, se demostró la importancia de PAR1 endotelial en la NETosis.

Protocolo

Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el comité local de legislación animal (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Coblenza, Alemania; G21-1-041). 6-8 semanas de edad macho y hembra B6. Para el estudio se utilizaron ratones FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc. La regulación específica de las células endoteliales de F2r (PAR1) se produce a través del promotor VE-Cadherin Cre²⁸. En este estudio, flox-F2r x VE-Cadherin Cre⁺ (F2R^ΔEC) exhibió una expresión reducida de F2r (PAR1) en las células endoteliales, y flox-F2r x VE-Cadherin Cre^- (WT) expresa niveles normales de F2r (PAR1) endotelial. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación para la cirugía

1. Esterilizar el instrumental quirúrgico necesario (tijeras extra estrechas rectas, fórceps, pinza vascular, etc.).
2. Prepare el sistema de anestesia a base de oxígeno e isoflurano con un cono nasal y una placa calefactora.

2. Preparación animal

1. Pesa al animal.
2. Realizar anestesia: Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución que contenga midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,5 mg/mL) y fentanilo (0,5 mg/kg) (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
3. Retire el vello del área de operación del cuello y el abdomen con una afeitadora eléctrica para animales pequeños.
4. Coloque el mouse en decúbito dorsal sobre la almohadilla térmica y conéctelo al sistema de oxígeno a través de un cono nasal. Asegure las extremidades del ratón a una almohadilla térmica con cinta quirúrgica. Asegúrese de que la membrana del cono de látex de la nariz se ajuste firmemente sobre la cabeza del ratón. Controle la temperatura corporal del animal por vía rectal con un termómetro específico para roedores.
5. Aplique crema depilatoria para eliminar cualquier resto de vello de la zona quirúrgica del cuello y limpie la piel de la zona de operación con etanol al 70%.
6. Realice una prueba de pellizco de los dedos del pie (reflejo del pedal) para asegurarse de que el animal esté completamente anestesiado.

3. Procedimiento quirúrgico

1. Implante de catéter en la vena yugular
   1. Haga una incisión transversal (~0,5 cm) sobre la tráquea, retire la piel que cubre el cuello y aísle la vena yugular derecha.
   2. Utilice un hilo de seda de unos 5 cm, cierre el extremo distal de la vena y fíjelo con pinzas quirúrgicas. Coloque tres hilos de seda a unos 2 cm por debajo de la vena: uno cerca del extremo distal y dos cerca del extremo proximal de la vena yugular. Haga un nudo quirúrgico, pero no cierre el vaso.
   3. Prepare un catéter de polietileno (0,28 mm de diámetro interior, 0,61 mm de diámetro exterior) lleno de NaCl al 0,9% y taponado con una jeringa de 1 ml. Use unas tijeras para cortar un orificio entre el segundo y el tercer nudo e implantar el catéter en la vena yugular. Aspire la jeringa para asegurarse de que haya sangre en el catéter.
   4. Fije el catéter en la vena atando el hilo de seda, asegurándose de que esté bien sujeto. Use cinta médica para asegurar la jeringa.
   5. Preparar naranja de acridina: diluir 1:4 a 2 mg/mL de solución madre con solución salina estéril (concentración final de 0,5 mg/mL) en una jeringa de 1 mL. Mantenga la jeringa en la oscuridad e inyecte 50 μL en el ratón.
   6. Preparar el colorante de ácido nucleico: diluir 1:1000 una solución madre de 5 mM con solución salina estéril (concentración final de 5 μM) en una jeringa de 1 mL. Mantenga la jeringa en la oscuridad e inyecte 50 μL en el ratón.
   7. Inyectar naranja de acridina in vivo (50 μg/μL, 50 μL por ratón) a través del catéter de la vena yugular para visualizar los leucocitos teñidos y un colorante fluorescente de ADN extracelular de forma similar a la tinción de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) (5 μM, 50 μL por ratón). Se obtienen imágenes simultáneas de los tumores neuroendocrinos y los leucocitos.
2. Modelo de lesión mesentérica I/R
   1. Desinfectar la piel abdominal con etanol al 70%.
   2. Realizar una laparotomía de 3-5 cm a lo largo de la línea alba con tijeras quirúrgicas.
   3. Con dos puntas de algodón humedecidas con solución salina, retire suavemente el intestino e identifique un lugar con una cobertura mínima de grasa. Coloque las ramas del intestino delgado sobre una masa negra para reducir la señal de fondo.
   4. Adquiera los videos antes de I/R (pre isquemia).
   5. Haga una compresa humectante con NaCl y coloque el intestino en ella. Asegúrese de que el intestino esté rodeado por la compresa y mantenga la humedad durante el paso 5.6.
   6. Ocluir la arteria mesentérica superior con una pequeña pinza vascular.
   7. Empuje suavemente el intestino hacia la cavidad abdominal con hisopos de algodón humedecidos con solución salina y use una sutura 7-0 para cerrar la pared abdominal y evitar la pérdida de humedad y temperatura. Mantener la isquemia durante 60 min, controlando la anestesia al menos cada 20 min.
   8. Después de 1 h, inicie la reperfusión retirando la pinza.
      NOTA: La ejecución adecuada del procedimiento de isquemia da como resultado un cambio visible. Inicialmente, el área afectada aparecerá pálida o blanca debido a la falta de flujo sanguíneo. Al retirar la pinza, el flujo sanguíneo regresará gradualmente a la región isquémica, que recuperará su color normal, lo que significa una oclusión exitosa. Es imperativo observar de cerca al ratón de forma continua durante toda la etapa de isquemia.
   9. Después del período isquémico, aplique unas gotas de solución salina en el área recortada, luego retire suavemente los clips microvasculares con un aplicador de clips.
   10. Con puntas de algodón humedecidas con solución salina, vuelva a retirar suavemente el intestino, coloque las pequeñas ramas de la vena sobre una masa negra, vuelva a inyectar 50 μL de naranja acridina y capture los vídeos de la misma vena en el mismo lugar (postisquemia).

4. Microscopía de epifluorescencia de video de alta velocidad intravital

1. Visualice leucocitos y NET con un microscopio de fluorescencia de campo amplio de alta velocidad equipado con un condensador de larga distancia, un monocromador, un objetivo de inmersión en agua 10x y una cámara de dispositivo de carga acoplada. La adquisición de la imagen se realizó con un tiempo de exposición de 30 ms y filtros Alexa Fluor 488 (495/519) y Rhodamine Red (570/590).
2. Utilice software de procesamiento de imágenes para la adquisición y el análisis de imágenes.
3. Cuantifique el reclutamiento de células dentro de una región de interés de 0,06 mm².
4. Cuantificar los leucocitos adheridos como células que permanecen estacionarias o unidas al revestimiento endotelial durante un período de observación de 20 s.
5. Identifique los NET como estructuras extracelulares marcadas con colorantes fluorescentes de leucocitos y ácidos nucleicos extracelulares.
6. Sacrificar a los animales por luxación cervical al final del experimento (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).

5. Aislamiento de células endoteliales hepáticas (LEC) y RT-PCR cuantitativa

1. Aislar LECs mediante clasificación por celdas magnéticas (MACS)²⁹.
2. Aislar el ARN total.
3. Realice la síntesis complementaria de ADN (ADNc)²⁷ mezclando 2 μg de ARN total con 2 μL de tampón RT, 0,8 μL de mezcla dNTP, 2 μL de cebadores aleatorios RT, 1 μL de transcriptasa inversa y 4,2 μL de H₂O destilado estéril.
4. La transcripción del ADNc se realizó aplicando las siguientes condiciones: 25 °C durante 10 min, 37 °C durante 120 min, 85 °C durante 5 min.
5. Utilice 20 ng de ADNc para qPCR.
6. Utilice los siguientes cebadores: F2r (adelante): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (atrás): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTTTT, L32 (adelante): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (atrás): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Utilice las siguientes condiciones: 95 °C 30 s, 45 ciclos de (95 °C durante 10 s, 60 °C durante 25 s), 60 °C a 95 °C durante 6 s con ΔΤ 1 °C.

Resultados

Para estudiar los efectos dependientes de las células endoteliales sobre la formación y adhesión de los leucocitos, así como sobre la formación de NET, inicialmente, se examinó la eficacia de la deficiencia de F2r inducible por VE-Cadherin Cre en células endoteliales. Se empleó la clasificación magnética de células para aislar las células endoteliales hepáticas. Posteriormente, se aisló el ARN, seguido de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los ratones ^{F2r ΔEC}, en los que la Cre recombinasa expresada bajo el control del promotor VE-Cadherin está ausente, mostraron niveles de ARNm F2r (PAR1) significativamente reducidos (aproximadamente en un tercio) en comparación con los controles WT (Figura 1).

Después de confirmar la deficiencia en la línea de ratón, se realizó una lesión I/R mesentérica para examinar el impacto de PAR1 expresado por las células endoteliales vasculares sobre el rodaje y la adhesión de los leucocitos, visualizado por microscopía intravital (Figura 2A,B). Después de 1 h de isquemia, se retiró la pinza y se permitió que el vaso volviera a fusionarse. Se observó y registró el rodamiento y la adherencia de los leucocitos (teñido de verde, indicado por flechas blancas). Aunque ambos grupos mostraron un aumento en el número de leucocitos adherentes después de la lesión I/R, la deficiencia de F2r endotelial (PAR1) resultó en una adhesión de los leucocitos al endotelio mesentérico activado por I/R, lo que sugiere un papel activo de la activación endotelial de PAR1 en el reclutamiento de leucocitos a las vénulas mesentéricas isquémicas (Figura 2C).

El siguiente objetivo fue examinar si la expresión endotelial de PAR1 regula la formación de NET inducida por lesiones I/R. Por lo tanto, los ácidos nucleicos extracelulares se tiñeron con un colorante impermeable a las células³⁰ y se visualizaron los NET generados mediante microscopía intravital (indicada por flechas negras) (Figura 2A, B). Después de la lesión I/R, se observaron NETs solo en el grupo WT que expresaban niveles normales de PAR1 en las células endoteliales, lo que indica un papel regulador de PAR1 en NETosis (Figura 2C, D). En particular, cuando se suprimió la expresión endotelial de F2r , no hubo NET en las vénulas mesentéricas lesionadas por I/R.

Figura 1: Expresión de ARNm F2r (PAR1). Expresión de células endoteliales hepáticas F2r de ratones WT (n = 6) y F2r^ΔEC (n = 9) en relación con el gen de mantenimiento L32. Los datos se presentan como una mediana con un intervalo de confianza del 95%. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para comparar dos grupos independientes, *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El endotelial PAR1 afecta a la adhesión de los leucocitos y a la formación de NET en las vénulas mesentéricas lesionadas por I/R. Imágenes representativas de microscopía intravital de leucocitos adheridos teñidos con naranja de acridina (flechas blancas) y NETs teñidos con naranja Sytox (flechas negras) de ratones WT y F2r^ΔEC antes (pre) y después (post) de la lesión I/R (A) 10x y (B) aumento de 20x. Barras de escala: A, 50 μm; B, 20 μm. (C) Adhesión de leucocitos y (D) NETs por^mm2 de ratones WT (n = 7) y F2r^ΔEC (n = 4) antes (pre) y después (post) de la lesión I/R. Todos los datos se representaron como mediana con un intervalo de confianza del 95%. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba de ANOVA de dos vías, **p< 0,01, y las pruebas de comparación múltiple de Sídák para comparar las medias de diferentes genotipos en cada punto temporal (pre y post-isquemia). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La lesión mesentérica I/R combinada con microscopía intravital se aplicó a un modelo genético de ratón de deficiencia de F2r (PAR1) en células endoteliales para el análisis in vivo de leucocitos y NET después de 1 h de isquemia. El modelo de lesión mesentérica I/R se utiliza con frecuencia en roedores, con tiempos de isquemia y reperfusión que varían de minutos a varias horas^23,31, influyendo en el resultado inflamatorio³² y en la mortalidad³³. El modelo también depende de varios factores, como la microbiota^19,34, los receptores inmunitarios 10,35,36,37, el sexo 38,39 y la edad ³⁵. Además de la variación de los tiempos I/R, otra variable en este modelo es la respuesta diferencial de las diferentes partes del intestino a la lesión, siendo el intestino delgado el que muestra un mayor daño mucoso que el colon⁴⁰. La posición del clip microvascular que afecta a la región isquémica es crucial para la reproducibilidad del método^32,33. Es importante destacar que la oclusión superior de la arteria mesentérica combinada con la interrupción del flujo colateral produce tasas de mortalidad que se relacionan sistemáticamente con la duración de la isquemia⁴¹.

En este estudio, los ratones fueron sometidos a 1 h de isquemia, y la adhesión leucocitaria in vivo y la formación de NET se visualizaron inmediatamente después de la reperfusión para examinar la respuesta inflamatoria temprana desencadenada por el estado isquémico en ausencia de expresión endotelial de F2r . La aplicación de estos métodos a modelos genéticos de ratón permite investigar cómo ciertas moléculas diana afectan al comportamiento celular y a la respuesta inflamatoria tanto después de la isquemia como durante la reperfusión.

Hay varios pasos críticos en el protocolo, incluido el mantenimiento de la integridad intestinal. La manipulación del intestino debe realizarse con cuidado para evitar daños en los tejidos. Para ello, los bastoncillos de algodón húmedos son la herramienta adecuada para separar temporalmente el intestino de la cavidad abdominal. Es crucial que el intestino permanezca húmedo hasta que se reposicione en el abdomen. Las lesiones leves por manipulación pueden desencadenar la activación de varios tipos de células, como las plaquetas y las células endoteliales, lo que puede afectar los resultados.

Para mantener la consistencia, es crucial visualizar el mismo sitio de los segmentos intestinales antes y después de la isquemia. Esto puede ser un desafío porque el intestino se reposiciona en la cavidad abdominal después de la isquemia. Para abordar este problema, un enfoque es colocar un pequeño trozo de compresa húmeda en la parte del intestino que se visualizó antes de la isquemia.

Para visualizar el rodaje y la adhesión de los leucocitos, así como la formación de NET in vivo, se inyectó a los ratones un tinte de fluorescencia de leucocitos y un ácido nucleico a través de la vena yugular. El colorante leucocitario (ver Tabla de Materiales) es un colorante de fluorescencia metacromática permeable a las células que se une a los glóbulos blancos pero no a los glóbulos rojos y ha sido ampliamente utilizado para teñir leucocitos in vivo^17,42. El tinte se aplica por vía intravenosa y proporciona una fuerte tinción de leucocitos en cuestión de segundos. Sin embargo, la especificidad puede ser una limitación, ya que también tiñe otras células nucleadas, como las células endoteliales. Sin embargo, las células circulatorias retienen la tinción durante más tiempo debido a un efecto de lavado⁴³. El colorante de fluorescencia de ácido nucleico (ver Tabla de Materiales) es una tinción de ácido nucleico impermeable a las células que se usa comúnmente para visualizar la formación de NET 30,44,45. También se puede aplicar por vía intravenosa, se une con alta afinidad y es rápido y fácil de usar. Una vez más, la especificidad es un inconveniente, ya que el tinte se unirá a cualquier célula con una membrana no intacta. Idealmente, debe combinarse con un marcador de neutrófilos (p. ej., CD15, CD11b) o un marcador de NETosis (p. ej., anticuerpos anti-citH3) para mejorar la especificidad. Estos colorantes permiten obtener imágenes in vivo de leucocitos en las vénulas mesentéricas de animales de laboratorio.

La principal limitación de la técnica es la presencia de grasa visceral, que restringe la visualización de los capilares intestinales y dificulta en gran medida la adquisición de imágenes. Para evitar esta complicación, es necesario utilizar animales de experimentación jóvenes (6-8 semanas de edad) que tengan reducida la formación de grasa visceral. Además, el análisis histológico ex vivo se ve obstaculizado por el uso de tinción in vivo . Otra limitación es el impacto de la microbiota intestinal y de la dieta en este modelo, que puede variar mucho entre las diferentes crías de ratones⁴⁶. Para abordar esta limitación, se podría considerar el estudio de modelos de ratón gnotobióticos¹⁰.

En este estudio, se investigó la respuesta celular inmediata después de la isquemia, y se observó una reducción del depósito de leucocitos al endotelio mesentérico activado y la formación de NET in vivo. La degradación de NET por administración intravenosa de DNasa 1 h después de la isquemia reduce la respuesta proinflamatoria temprana y mejora la ruptura de la barrera intestinal⁴⁷. Cabe destacar que el tratamiento con trombomodulina, una glicoproteína transmembrana que inhibe la actividad de la trombina⁴⁸, mejoró la supervivencia de ratones con lesión intestinal I/R grave, atenuando la respuesta inflamatoria de la disfunción endotelial y reduciendo la intensa acumulación de histonas en órganos remotos⁴⁹. Aquí, se demostró que el receptor de trombina endotelial influye en el resultado de I/R, lo que destaca la importancia de combinar el modelo de lesión I/R intestinal con microscopía intravital en ratones modificados genéticamente para investigar mediadores importantes de la patología de la enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Naranja acridina	Sigma-Aldrich	A-6014
Placa de 96 pocillos Múltiple PCR-Platten	Sarstedt	721977202.00
Sistemas de anestesia para roedores	GROPPLER medizintechnik	Uni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVM	B Braun Melsungen	53402101
masa negra	Arcilla de modelar	Staedtler
CD146 Microperlas, ratón	Miltenyi Biotec	130-092-007
cellSens	Olympus	Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3	software
dispositivo de carga acoplada cámara	Hamamatsu Photonics	ORCA-R2
cámara bastoncillos de algodón	Bö ttger	09-119-9100
Hemostático curvo 125mm/5"	Instrumentos índigo	22466
Crema depilatoria	Balea	no aplicable
Dorbene Vet	zoetis Pinzas
Dumont	Fine Science Tools	11251-35
Etanol p.a. 99,5 %	Roth	5504.20
Tijeras extraestrechas – Recto/Afilado-Afilado/10.5	FST	14088-10
Fentanilo	Pinzas Janssen-Cilag GmBH
"Dumont #5" (Inox, punta 0,1 mm, longitud 11 cm)	FST	11251-20
GentleMACS C Tubos	Miltenyi Biotec	130-093-236
Graphpadprism	Graphpad	Prism 10	software
isoflurano	Piramal	4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Verde Supermix 10x5ml	BioRad	1725125.00
Cinta médica Leukofix	BSNMedical	0213600
Kit de disociación hepática, ratón	Miltenyi Biotec	130-105-807
LS-Columnas de separación MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Smart Strainer 100 y micro; m	Miltenyi Biotec	130-098-463
Microseal B Sellos Biorad		MSB1001
Midazolam	hameln	5918501.00
NaCl	Braun 2350748
Portaagujas	FST	12001-13
Sutura de seda trenzada no absorbible, Tamaño: 7/0, 91 metros	Fine Science Tools	18020-70
Microscopio de fluorescencia Olympus BX51WI	Microscopio	Olympus
PCR para tiras de tubo	Sarstedt	72985002.00
Tapas de tubo de PCR	Sarstedt	65989002.00
Catéter de polietileno	Smith Medical Deutschland GmbH	800/100/100
Prolene (8648G), Polipropileno 6-0, Nahtmaterial	Johnson & Johnson Medical GmbH	8695H
Relia Prep ARN Miniprep Systems	Promega	Z6112
Kit de Transcripción Inversa (ADNc de Alta Capacidad)	Applied Biosystems	4368813.00
Báscula escolar	KERN & SOHN GmbH	EMB 500-1
Tijeras de resorte - Inclinadas a los lados	FST	15006-09
Microscopio estereoscópico	Leica	M50
Hemostáticos rectos 135mm/5.5"	Indigo Instruments	22468
Jeringa 1 mL	Braun	9166017V
SYTOX Naranja	Thermo Fisher Scientific	S11368
Controlador de temperatura TC-1000	FMI Fö hr Medical Instruments GmbH	no aplicable
Pinza de tejido - 1x2 dientes	FST	18057-14
pinza vascular	Fine Science Tools	18055-02
Vetiva mini	WAHL	1584-0480