Medición de cuatro subtipos de células NK uterinas mediante tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada en mujeres con fallo de implantación repetido

Resumen

Este estudio presenta un método pionero para cuantificar subconjuntos de células asesinas naturales uterinas durante la ventana de implantación utilizando técnicas avanzadas de tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada.

Resumen

La inmunohistoquímica (IHQ) desempeña un papel crucial en la investigación biológica y el diagnóstico clínico, ya que es el método más utilizado para identificar y visualizar los antígenos tisulares. Sin embargo, los métodos tradicionales de tinción con IHQ tienen limitaciones para distinguir varios subtipos de células inmunitarias. Este desafío ha llevado a los científicos a explorar nuevas tecnologías y metodologías para la identificación y diferenciación precisas de subtipos de células inmunitarias. En los últimos años, la IHC multiplex ha surgido como una solución, permitiendo la detección simultánea de múltiples antígenos y su visualización dentro de la misma muestra de tejido. Las células asesinas naturales uterinas (uNK) desempeñan un papel fundamental en los procesos tempranos del embarazo, incluida la decidualización, la remodelación de las arterias espirales uterinas y la implantación del embrión. Los diferentes subtipos de células uNK exhiben diferentes funciones, lo que les permite coordinar varios eventos biológicos para el desarrollo exitoso del embrión y el embarazo. Por lo tanto, la investigación en profundidad sobre los subtipos de células uNK es esencial para dilucidar los mecanismos de regulación inmunitaria durante el embarazo. Estos estudios proporcionan información valiosa y enfoques novedosos para abordar afecciones relacionadas, como la infertilidad y el fracaso reproductivo recurrente. En este artículo se presenta un protocolo detallado de tinción de IHQ multiplex para estudiar la densidad de cuatro subtipos de células uNK en muestras endometriales durante la ventana de implantación (WOI). El protocolo incluye la preparación de muestras, la optimización de marcadores de subtipos, imágenes microscópicas y análisis de datos. Este protocolo de tinción múltiple de IHC ofrece una alta especificidad y sensibilidad, lo que permite la detección simultánea de diferentes subtipos de células uNK, proporcionando así a los investigadores una poderosa herramienta para explorar las complejidades y los mecanismos de la regulación inmunitaria durante el embarazo.

Introducción

El primer nacido vivo documentado después de la fertilización in vitro-transferencia de embriones (FIV-ET) se reportó en 1978. En los últimos 40 años, ha habido una gran demanda de asistencia a la FIV-ET entre las parejas infértiles¹. En 2021, 238,126 pacientes iniciaron un total de 413,776 ciclos de FIV en los Estados Unidos. Esto marca un aumento del 25% en los ciclos con respecto a los 2 años anteriores y un aumento del 135% con respecto a 2012². Este aumento se atribuye principalmente al aumento de la prevalencia de la infertilidad y al retraso en la planificación del embarazo. Los avances en las técnicas de cultivo embrionario y los protocolos de superovulación han llevado a un aumento de la tasa de nacidos vivos por ciclo ET, alcanzando el 30%-50% en mujeres menores de 40 años y menos del 30% en mujeres mayores de 40 años². Sin embargo, a pesar de estos avances, más de la mitad de los embriones transferidos aún no logran implantarse. El fallo repetido de implantación (RIF), normalmente definido como el fracaso después de tres o más intentos consecutivos de transferir embriones de alta calidad, afecta al 15% de las mujeres que se someten a FIV-ET³. Las parejas con RIF son extremadamente vulnerables y más propensas a someterse a procedimientos costosos e innecesarios que pueden exponerlas a riesgos indebidos⁴. Por lo tanto, comprender las causas de la RIF y mejorar la implantación embrionaria es crucial para mejorar el éxito de la FIV-ET, especialmente para las mujeres con RIF. La preparación del endometrio es fundamental para el éxito de la implantación del embrión. Este proceso se caracteriza por una acumulación significativa de células asesinas naturales uterinas (uNK), que pasan de constituir el 30% del total de linfocitos en el endometrio durante la fase semisecretora media al 70%-80% en la decidua durante el embarazo temprano⁵. En particular, las células uNK difieren de las células NK periféricas, que son linfocitos citotóxicos críticos para el sistema inmunitario innato que causan la muerte de las células infectadas por lisis o apoptosis. Si bien las funciones exactas de las células uNK aún no se comprenden completamente, varias líneas de evidencia sugieren que están involucradas en la remodelación de la angiogénesis, la invasión del trofoblasto y el desarrollo fetal⁶. La asociación entre el porcentaje de células uNK sobre las células estromales y el RIF ha atraído mucho en los últimos 20 años. Un metaanálisis reciente, que incluyó 8 estudios con 604 mujeres, demostró que la densidad de células CD56+uNK durante la fase lútea media aumenta significativamente en las mujeres con RIF en comparación con los controles fértiles⁷. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las características de las células uNK durante la fase lútea media difieren significativamente de las de las células NK deciduales (dNK). Aunque las células uNK pueden diferenciarse aún más en varios subconjuntos de células dNK después del embarazo, la medición de las células uNK por sí sola no representa con precisión las células dNK⁸. Las células uNK experimentan una diferenciación dinámica y desempeñan diferentes funciones en el ciclo menstrual y los procesos de decidualización, lo que las hace más complejas de lo que se puede identificar solo con CD56. Se requieren múltiples marcadores para lograr una comprensión completa del comportamiento de las células uNK durante la preparación endometrial. Nuestro estudio reciente empleó la secuenciación de ARN de una sola célula para identificar la diversidad de células uNK a lo largo de los ciclos menstruales. Los resultados, validados mediante citometría de flujo, han mostrado la presencia de cuatro subtipos distintos de células uNK, cada uno de los cuales presenta cambios dinámicos durante el ciclo menstrual⁹. El análisis de enriquecimiento génico y el enriquecimiento funcional de ontología génica indican que estos subconjuntos de uNK cumplen diferentes funciones en varias etapas de la menstruación. Sin embargo, la citometría de flujo no es universalmente accesible en los laboratorios clínicos, y el procesamiento inmediato de tejido endometrial fresco para la digestión enzimática hace imposible repetir los pasos experimentales tras los errores.

El objetivo de este estudio fue, por lo tanto, investigar la medición de estas cuatro subpoblaciones de células NK utilizando un ensayo de tinción multiplex, que proporciona un enfoque diagnóstico más práctico. En la tinción múltiple, diferentes anticuerpos específicos contra cada objetivo se unen a diferentes marcadores de fluoróforos que emiten diferentes longitudes de onda de luz cuando son excitados por una longitud de onda de luz específica. En comparación con el método tradicional de tinción IHQ, este método puede comparar cuantitativamente la abundancia relativa y la distribución de múltiples dianas en una muestra y proporcionar información sobre la interacción y la colocalización de diferentes dianas, lo que nos permite identificar diferentes subtipos de células uNK. Este enfoque no solo profundizará nuestra comprensión de la relación entre las células uNK y RIF, sino que también proporcionará información para investigar otras subpoblaciones de células inmunitarias en enfermedades relacionadas con el endometrio.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica del Clúster Este de la Universidad China Conjunta de Hong Kong-Nuevos Territorios (CREC ref no.: 2022.581). Las mujeres con RIF fueron reclutadas en el Centro de Tecnología de Reproducción Asistida del Hospital Príncipe de Gales de la Universidad China de Hong Kong. El RIF se definió como la imposibilidad de lograr un embarazo clínico después de la transferencia de al menos 4 embriones de buena calidad en un mínimo de 3 ciclos frescos o congelados en una mujer menor de 40 años¹⁰. Se obtuvo el consentimiento informado de las participantes antes de tomar las biopsias endometriales.

1. Adquisición y procesamiento de muestras endometriales

1. Momento de la recolección de la muestra endometrial
   1. Recolectar muestras de endometrio siguiendo un protocolo estricto para garantizar la consistencia entre las participantes del estudio. Para pacientes con ciclos naturales, realizar análisis de orina a partir del^9º día del ciclo menstrual y realizar biopsia endometrial el^7º día después del aumento de LH (LH+7)¹¹ . Para las pacientes que se someten a ciclos de terapia de reemplazo hormonal (TRH), administre 6 mg de valerato de estradiol por vía oral diariamente a partir del día 2 del ciclo menstrual.
   2. Evaluar el grosor del endometrio mediante ecografía el día 13 del ciclo menstrual. Cuando el grosor del endometrio alcanza o supera los 8 mm, administrar progesterona por vía transvaginal y realizar una biopsia endometrial 5 días después de la administración de progesterona¹².
2. Recogida y fijación de muestras endometriales: introducir un muestreador de pipetas en la cavidad uterina, avanzando hasta la región uterina; Aplique la succión tirando hacia abajo del émbolo interno, raspando simultáneamente la superficie endometrial a través de movimientos rotacionales y verticales dentro de la cavidad uterina. Enjuague las muestras recolectadas con solución salina normal para eliminar las secreciones cervicales y uterinas. Mida las muestras y evalúe el tamaño. Para muestras de 3 mm x 15-25 mm, sumergirlas inmediatamente en 10 mL de formalina tamponada neutra al 10% y fijarlas a temperatura ambiente durante 24-48 h.
3. Deshidratación: Una vez finalizada la fijación, se someten las muestras a una secuencia de deshidratación diseñada para reemplazar el agua con etanol. Para ello, sumerja los pañuelos en baños de etanol al 70%, 80%, 90% y 100% para garantizar una deshidratación completa. Después del baño final de etanol, limpie las muestras en xileno para eliminar cualquier residuo de alcohol y prepárelas para la infiltración de parafina.
4. Incrustación: Después de colocar el tejido plano en el fondo del molde, derrita la parafina y agréguela con cuidado a las muestras para asegurarse de que el tejido endometrial esté completamente encapsulado en la matriz de parafina. Después de llenar los moldes con cera de parafina, enfríelos en una mesa de congelación para promover la solidificación de la cera de parafina. Una vez que los bloques de parafina se endurezcan, almacene a temperatura ambiente hasta que se requiera un procesamiento adicional.
   NOTA: Los moldes utilizados se eligieron específicamente para acomodar el tamaño de las muestras endometriales obtenidas para permitir que el tejido endometrial quede plano en el fondo sin doblarse, asegurando así una orientación óptima para el corte posterior y sin crear excesos innecesarios.
5. Seccionado: Para preparar el corte, refrigere los bloques de parafina a 4 °C durante 2 h. Cortar las muestras en secciones de 4 μm con un micrótomo, luego aplanar las rodajas en la superficie de agua destilada calentada a 42 °C y montarlas en portaobjetos de vidrio adhesivo. Coloque las rodajas en una secadora deslizante durante la noche y guárdelas a temperatura ambiente antes de usarlas.

2. Optimización de las condiciones de inmunohistoquímica múltiple

1. Validación de IHQ: Para la validación de los parámetros de tinción de IHQ, adopte un enfoque sistemático para ajustar las condiciones de recuperación de antígenos, concentración de anticuerpos y tiempos de incubación.
   1. Dentro de los rangos de dilución recomendados por el fabricante, pruebe 2-3 concentraciones para cada anticuerpo. Optimice la recuperación de antígenos comparando tampones a pH 6 y pH 9, y evalúe los protocolos de incubación tanto a temperatura ambiente durante 1,5 h como durante la noche a 4 °C.
   2. Evalúe cada condición meticulosamente, centrándose en la intensidad de la tinción, la especificidad y el ruido de fondo. Seleccione la combinación óptima que produzca la tinción más clara y específica con una unión inespecífica mínima. Esta rigurosa validación garantizó la máxima precisión y reproducibilidad en el protocolo IHC.
2. Tinción monoplex de amplificación de señal de tiramida (TSA): después de determinar los parámetros de tinción óptimos para anticuerpos individuales, optimice el emparejamiento de anticuerpos con diferentes colorantes TSA. Empareje el marcador con mayor expresión con un colorante con un nivel de intensidad de fluorescencia más bajo, o viceversa. Durante esta fase, realice ajustes en la concentración de anticuerpos y el tiempo de incubación de acuerdo con la intensidad de la señal de fluorescencia observada. Si se observa una tinción de fondo significativa o inespecífica, cambie el tinte emparejado¹³.
3. Tinción múltiple TSA: Para el protocolo de inmunohistoquímica múltiple (m-IHC), el orden secuencial de la tinción se ha definido cuidadosamente de acuerdo con los principios establecidos. Para garantizar que el proceso de multiplexación refleje la sensibilidad y la especificidad de la tinción de una sola marca, se priorizaron los anticuerpos con niveles de expresión más bajos al comienzo de la secuencia de tinción. Coloque los anticuerpos que requieren reparación de bases para la recuperación de antígenos al final de la secuencia de tinción, ya que la reparación de bases es robusta en comparación con los métodos basados en ácidos, que pueden, en algunos casos, amplificar artefactos de tinción inespecíficos.
4. Utilizando los hallazgos de los pasos 2.1 y 2.2, decida qué anticuerpos se usarán y en qué etapa, en función de sus requisitos de recuperación de antígenos y densidades de expresión. Por ejemplo, el anticuerpo CXCR4, que requiere una reparación de base para la recuperación de antígenos, se ha colocado en las etapas finales de la tinción. Por el contrario, el anticuerpo CD49a, que se caracteriza por una menor densidad de expresión, ha obtenido la primera posición en la secuencia de tinción. Maximice las posibilidades de una detección exitosa y minimice los efectos de enmascaramiento que puedan producirse en las últimas etapas del procedimiento de multiplexación.
5. Para los anticuerpos restantes, pruebe diferentes combinaciones durante la fase de optimización para determinar la secuencia más efectiva que equilibre la sensibilidad y la especificidad. Los resultados de estos análisis comparativos guiarán la composición final del panel multiplex, como se detalla en la Tabla 1, asegurando que el panel seleccionado proporcione un rendimiento óptimo al tiempo que minimiza el fondo.

3. Proceso m-IHC

1. Desparafinado, hidratación y fijación: Hornee las secciones de tejido a 60 °C durante 2 h, seguido de inmersión secuencial en xileno I (10 min), xileno II (10 min), 100% etanol (5 min), 95% etanol (5 min), 80% etanol (5 min), 75% etanol (5 min), ddH₂O (2 min para 3x), 10% formalina tamponada neutra (al menos 20 min), y ddH₂O (2 min para 3x).
2. Recuperación de antígenos: Agregue 200 mL del respectivo tampón AR6 o AR9, como se indica en la Tabla 1 para cada anticuerpo, a un casete de recuperación de antígeno resistente al calor. Coloque las secciones en el tampón de recuperación de antígeno adecuado y caliente en un microondas a alta potencia durante unos 2 minutos hasta que hierva. Posteriormente, cubra el casete sin apretar, caliéntelo a baja potencia durante 15 minutos y enfríe a temperatura ambiente. Enjuague las secciones con ddH₂O y PBST.
3. Dibujo de la barrera hidrofóbica: Después de eliminar el exceso de solución con papel absorbente, dibuje un círculo completo alrededor del tejido con un rotulador de barrera hidrofóbica.
4. Inactivación de la actividad enzimática endógena: Tratar las secciones con peróxido de hidrógeno al 3% e incubar durante 8 min a temperatura ambiente. Lavar con PBST 3 veces durante 2 minutos cada uno.
5. Bloqueo de sitios inespecíficos: Después de secar con papel absorbente, aplicar una solución de bloqueo (1x Antibody Diluyente/Block) e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
6. Incubación con anticuerpo primario: Después de retirar la solución de bloqueo, aplique 150 μL del primer anticuerpo primario, CD49a, en cada portaobjetos a una dilución de 1:1000 en 1x Diluyente de anticuerpos. Incubar como se ha optimizado previamente en la sección 2. Después de la incubación, lave los portaobjetos con PBST 3x durante 2 minutos cada uno. Para los anticuerpos restantes, consulte la Tabla 1 para conocer las proporciones de dilución específicas.
7. Incubación con anticuerpo secundario: Antes de aplicar el anticuerpo secundario, utilice papel absorbente para eliminar el exceso de humedad y evitar la dilución del reactivo. Añadir 4-5 gotas (aproximadamente 150 μL) del anticuerpo secundario 1x Anti-Ms + Rb HRP en cada portaobjetos, seguido de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. Realice tres lavados con PBST durante 2 minutos cada post-incubación.
   NOTA: Tenga en cuenta que el anticuerpo secundario 1x Anti-Ms + Rb HRP es específico para anticuerpos primarios de conejo y ratón.
8. Amplificación de la señal con colorante TSA: Después de secar el exceso de humedad, diluya el colorante TSA 1:100 en el diluyente de amplificación. Agregue 150 μL de esta solución de colorante TSA diluida a cada portaobjetos. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar con PBST 3 veces durante 2 minutos cada uno.
9. Repita los pasos 3.2 y 3.5-3.8 para el procedimiento TSA utilizando el anticuerpo y el colorante correspondientes.
10. Núcleos de tinción: Después de teñir el último anticuerpo, elimine los fluoróforos no unidos calentando en el microondas secciones en 200 ml de tampón AR6 dentro de un casete resistente al calor, hirviendo durante 2 minutos, luego calentando a baja potencia durante 15 minutos. Enfríe las muestras a temperatura ambiente y enjuague con ddH₂O y PBST. Añadir 150 μL de solución de trabajo DAPI diluida en PBST (1:10) gota a gota, incubar durante 10 min a temperatura ambiente y enjuagar 2 veces con ddH₂O.
11. Montaje: Una vez que las secciones se hayan secado completamente al aire en un área oscura durante aproximadamente 30 minutos, aplique una sola gota (alrededor de 30 μL) del soporte fluorescente anti-enfriamiento y coloque cubreobjetos.
    NOTA: Proteja todas las operaciones de la luz después de la primera aplicación del tinte TSA. La observación rápida y la captura de imágenes fueron esenciales después de la finalización de la tinción para evitar el enfriamiento de la fluorescencia.

4. Adquisición y análisis de imágenes

1. Tiempo de exposición: Capture imágenes utilizando un generador de imágenes que hereda las longitudes de onda de excitación y emisión correspondientes a los fluoróforos. Al ajustar los tiempos de exposición, compruebe las diapositivas con una amplia gama de expresiones de marcador para garantizar la precisión. Para cada combinación de marcador/filtro, concéntrese manualmente en diferentes áreas de la diapositiva. Utilice la función Exposición automática para establecer el tiempo de exposición.
2. Seleccione los filtros de acuerdo con los tintes de la TSA y examine varios portaobjetos para determinar los tiempos de exposición óptimos por canal. Aplique estos ajustes de forma coherente a todas las adquisiciones posteriores para mantener la comparabilidad a lo largo de las imágenes.
3. Selección de las áreas de captura: Para garantizar un muestreo imparcial en todas las secciones de tejido y una inclusión coherente del epitelio luminal en cada campo analizado, seleccione aleatoriamente el área inicial para la adquisición de imágenes, siendo el criterio crítico la presencia del borde epitelial luminal.
4. Después de la captura de este campo inicial, seleccione sistemáticamente las áreas posteriores moviendo un campo a la izquierda o a la derecha del punto de inicio (omitiendo un campo entre cada imagen capturada) mientras mantiene el borde epitelial luminal dentro del marco. Repita este proceso para capturar al menos cinco áreas diferentes, cada una de las cuales contiene al menos una porción del epitelio luminal, para mantener una profundidad de análisis constante a lo largo de¹⁴. Este enfoque tenía como objetivo incluir un mínimo de aproximadamente 10.000 células estromales en todos los campos capturados para garantizar una recopilación de datos completa y representativa.
5. Análisis de imágenes
   1. Preparación de la imagen: Para importar y analizar imágenes multiespectrales, primero vaya a Archivo > Abrir imagen en la interfaz del software para cargar los archivos y la diapositiva de autofluorescencia (AF). Después de cargar las imágenes, proceda a desmezclar los fluoróforos haciendo clic en el botón Seleccionar fluores y seleccionando la biblioteca espectral adecuada. Una vez que se hayan seleccionado todos los fluoróforos, haga clic en Aceptar para confirmar la selección. Para aislar el espectro AF, utilice la herramienta cuentagotas AF para muestrear un área representativa de tejido de la imagen AF, teniendo cuidado de excluir cualquier píxel que no sea de tejido. Después de muestrear, haga clic en Preparar imagen o Preparar todo en la esquina inferior izquierda de la interfaz¹⁵.
   2. Segmentación de tejidos: Inicie el proceso de segmentación delineando manualmente una línea de base de 3 a 5 regiones por tipo de tejido dentro de la imagen, incluidas las áreas epiteliales que contienen células epiteliales, las áreas estromales que contienen células estromales y las áreas en blanco sin contenido celular. Si los resultados de la segmentación inicial no son satisfactorios, anote manualmente regiones adicionales para mejorar el conjunto de datos de entrenamiento, aumentando así la precisión y la fiabilidad de los análisis posteriores. Este ajuste dinámico de regiones y parámetros garantiza que el software pueda identificar automáticamente estructuras similares en la imagen actual y otras imágenes importadas con mayor precisión.
      NOTA: La anotación inicial sirve como un conjunto de datos de entrenamiento para que el software aprenda las características de cada componente del tejido. Las capacidades de segmentación del software se refinan de forma iterativa en función de la complejidad y la variabilidad del tejido.
   3. Segmentación de celdas: Haga clic en Segmentar celdas para iniciar la segmentación de celdas. En la Configuración de segmentación de celdas, seleccione Núcleos y membrana. Elija DAPI para identificar los núcleos celulares y ajustar la configuración de intensidad para detectar todos los núcleos celulares sin ruido de fondo. Seleccione las señales CD16, CD49a y CD56 para encontrar la membrana y utilizar esta señal para ayudar en la división nuclear. Utilice la función de división de componentes nucleares para distinguir núcleos ubicados muy cerca.
      NOTA: DAPI resalta el interior de las celdas. La función de división de componentes nucleares ayuda a distinguir los núcleos celulares cuando están muy juntos o parecen fusionados. Este paso es importante para obtener recuentos de células fiables y mantener la integridad del análisis.
   4. Fenotipado celular: Adopte cuatro marcadores de superficie celular diferentes, incluidos CD56, CD49a, CXCR4 y CD16 para diferenciar diferentes subtipos de células NK. En el esquema de fenotipado, etiquete estos cuatro marcadores como los fenotipos a continuar. En la sección Vista de asociado, asigne colores específicos a cada uno de los fenotipos para su identificación. Con el botón Agregar, clasifique las celdas como que expresan positiva o negativamente los marcadores; por ejemplo, en el fenotipo CD56, las células se pueden etiquetar como CD56+ o CD56-. Etiquete manualmente al menos cinco celdas para cada fenotipo durante el proceso de entrenamiento. Realice un etiquetado manual adicional si la capacitación inicial no produce resultados efectivos.
   5. Una vez establecida la configuración del fenotipado celular, cada celda de la imagen indicará si los cuatro marcadores de superficie se expresan positiva o negativamente. Exporte los datos resultantes a una hoja de cálculo para su posterior análisis.
   6. Procesamiento de datos: Importe los datos obtenidos de todas las imágenes en una hoja de cálculo para su procesamiento. Calcule porcentajes de todos los subtipos de celdas uNK en relación con el número total de celdas de la imagen. El recuento final de células representa el recuento promedio en varias imágenes, lo que proporciona una descripción general completa de la población de varios subtipos de células uNK dentro de la muestra.

Resultados

Para mantener la consistencia en el momento de la recolección de muestras endometriales para las mujeres sometidas al ciclo natural, se realizó una prueba de orina para detectar con precisión el aumento de la hormona luteinizante (LH), con biopsias endometriales realizadas 7 días después del aumento de la LH. Para las mujeres sometidas a ciclos de TRH, las muestras se programaron precisamente 5 días después de que comenzara la suplementación con progesterona. Para cuantificar los diferentes subtipos de células NK en el endometrio, se empleó la tinción con m-IHC. En la Figura 1 se muestra un esquema del procedimiento experimental.

La optimización del procedimiento experimental es fundamental para lograr resultados de tinción de m-IHC de alta calidad para garantizar la precisión y la coherencia en los resultados del experimento. Inicialmente, se empleó IHQ para determinar la concentración adecuada de anticuerpos, con la selección de soluciones de recuperación de antígenos AR6 o AR9. Para anticuerpos como CD56, CD16 y CD49, se recomienda una solución de recuperación de antígenos con pH 6, mientras que para el anticuerpo CXCR4, se lograron resultados de tinción superiores utilizando una solución de reparación de antígenos con un pH de 9 en comparación con un tampón de pH 6. Una vez que se han determinado los parámetros, incluida la proporción de dilución de anticuerpos, el tiempo de incubación y las condiciones de recuperación de antígenos, se puede seleccionar el colorante TSA más adecuado en función de la afinidad del anticuerpo. Se debe seleccionar un colorante con un brillo de fluorescencia débil para complementar la alta afinidad del anticuerpo. En el Cuadro 2 se pueden encontrar datos de referencia sobre la intensidad de la señal de los tintes TSA. Una vez finalizado el ensayo de monoplexación de la TSA, se puede determinar el orden del múltiplex de la TSA. Dado que los cuatro anticuerpos están diseñados para identificar diferentes subtipos de células uNK, la colocalización entre los anticuerpos es inevitable. Para minimizar la superposición espectral y prevenir la interferencia entre las fracciones fluorescentes, se empleó la siguiente estrategia: seleccionar fracciones fluorescentes con longitudes de onda lo más separadas posible, comparar la posición y el número de señales positivas del múltiplex TSA con las del monoplex TSA para asegurar su identidad (Figura 2) y asegurar un fondo claro (Figura 3)¹⁶.

Tras la optimización y finalización de los procedimientos de tinción de m-IHC, se empleó la estación de trabajo de imágenes para la adquisición de imágenes y se aplicó el software de análisis de imágenes para el análisis en profundidad de las imágenes (Figura 4). Para la clasificación de las células uNK se utilizaron métodos tradicionales e innovadores. La clasificación tradicional divide las células NK en dos categorías, CD56 + CD16- y CD56 + CD16 + ¹⁷, según el nivel de expresión de CD16. Sobre esta base, tratamos de delinear aún más la heterogeneidad de las células NK utilizando una nueva estrategia de clasificación. Utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de nuestra investigación anterior, aislamos células NK individuales mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y realizamos la secuenciación de ARN para capturar los perfiles transcriptómicos de cada célula. Nuestro análisis reveló cuatro subtipos distintos de células NK: NK1 (CD56 + CD49a + CXCR4-), NK2 (CD56 + CD49a + CXCR4+), NK3 (CD56 + CD49a-CXCR4-) y NK4 (CD56 + CD49a-CXCR4+). Estos subtipos se caracterizaron por la expresión diferencial de CD49a y CXCR4, con CD56 sirviendo como marcador universal para todas las células NK. CD49a se detectó específicamente en los subtipos NK1 y NK2, mientras que CXCR4 estuvo presente en los subtipos NK2 y NK4. Para validar esta clasificación, realizamos un análisis de citometría de flujo para garantizar la precisión de nuestro método de subtipificación (Figura 5)⁹. La proporción de cada subtipo de células uNK se presenta como un porcentaje en relación con el número total de células estromalas.

Figura 1: Diagrama del flujo de trabajo del análisis endometrial de células NK. Los pasos principales incluyen la adquisición y recolección del endometrio, la optimización del panel m-IHC, la tinción m-IHC del endometrio y la adquisición y análisis de la imagen. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas para la cuantificación de biomarcadores mediante tinción DAB, TSA monoplex y TSA multiplex. Las imágenes representativas de cada uno de los anticuerpos teñidos por DAB (paneles izquierdos), TSA monoplex IHC (paneles centrales) y TSA multiplex IHC (paneles derechos) demostraron una desviación mínima mediante el desarrollo de m-IHC. Las imágenes IHC simuladas de la TSA que se encuentran debajo imitan en gran medida las imágenes de campo claro correspondientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados experimentales después de la tinción con m-IHC del endometrio. (A) Se obtuvo una imagen sin mezclar utilizando el generador de imágenes con un aumento de 200x. (B) Mayor aumento de esta imagen sin mezclar. (C-F) Se observaron imágenes en los canales TSA colorante 570 (CD16), TSA 650 (CD56), TSA 620 (CXCR4) y TSA 520 (CD49a) después de desmezclar con el software de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de imágenes teñidas con m-IHC. Las imágenes se analizaron utilizando las funciones de segmentación de tejidos (A), segmentación celular (B) y fenotipo celular (C) del software de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis de subtipos de células NK endometriales. (A) Las células NK endometriales convencionales se pueden clasificar en células CD56 + CD16-NK y células CD56 + CD16 + NK en función de la expresión de CD16. (B) El innovador método de análisis de subtipos clasificó las células NK endometriales en cuatro categorías: NK1 (CD56 + CD49a + CXCR4-), NK2 (CD56 + CD49a + CXCR4+), NK3 (CD56 + CD49a-CXCR4-) y NK4 (CD56 + CD49a-CXCR4+). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ciclo de tinción	Marcador	Clon	Compañía	Producto	Dilución de anticuerpos	Búfer de RA	Fluoróforo
1	CD49a	CL7207	Novus Biológicos	NBP2-76478	1:1000	AR6	TSA 520
2	CD56	CD564	Leica	NCL-L-CD56-504	1:100	AR6	TSA 650
3	CD16	SP175	ABCAM	AB183354	1:100	AR6	TSA 570
4	CXCR4	44716	I+D	MAB172	1:100	AR9	TSA 620

Tabla 1: Lista de las concentraciones de los anticuerpos y el colorante TSA utilizados en la m-IHC.

Fluoróforo	Mantra
Tinte TSA 520	Alto
Tinte TSA 540	Medio
Tinte TSA 570	Medio
Tinte TSA 620	Medio
Tinte TSA 650	Alto
Tinte TSA 690	Bajo

Tabla 2: Colorantes TSA e intensidad de fluorescencia correspondiente.

Discusión

La implantación embrionaria implica una interacción compleja entre el embrión y el endometrio. El estado inmunológico de la homeostasis endometrial desempeña un papel fundamental en la determinación de la receptividad endometrial. Durante la WOI, la población de leucocitos predominante en el endometrio son las células NK. Aproximadamente el 90% de las células uNK exhiben una alta expresión de CD56 pero carecen de CD16. Sin embargo, un subconjunto menor de células uNK se asemeja a las células NK de sangre periférica, mostrando una baja expresión de CD56 pero una expresión positiva de^{CD16 18}. Estos dos subtipos de células uNK muestran funciones distintas. El subtipo CD56+CD16- contribuye principalmente a la producción de citocinas, la remodelación vascular y las interacciones con las células del trofoblasto, que son cruciales para establecer y mantener el embarazo. Por el contrario, el subtipo CD56+CD16+ presenta una mayor citotoxicidad. Utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula, nuestro estudio reciente clasificó aún más las células uNK en cuatro subconjuntos, subagrupando aún más las células NK reguladoras CD56 + CD16- en tres subpoblaciones en función de sus fenotipos y funciones específicos⁹. El subconjunto NK1, caracterizado por CD56+CD49a+CXCR4-, está implicado en la remodelación tisular. El subconjunto NK2, identificado por CD56+CD49a+CXCR4+, regula la respuesta inmunitaria. El subconjunto NK3, marcado por CD56+CD49a-CXCR4-, interactúa con los trofoblastos. El subconjunto NK4, que exhibe CD56 + CD49a-CXCR4+, comparte similitudes con las células NK CD56 + CD16+, mostrando funciones citotóxicas⁹. En el presente estudio, por primera vez, establecimos con éxito un protocolo para identificar estos cuatro subconjuntos distintos de células NK utilizando la tinción m-IHC.

La tinción convencional de IHQ y la citometría de flujo son los métodos más utilizados para identificar las células inmunitarias, cada uno con sus propias fortalezas y limitaciones¹⁹. Si bien la IHQ convencional se usa ampliamente en entornos clínicos debido a su fácil accesibilidad, enfrenta desafíos para detectar simultáneamente múltiples antígenos y cuantificar señales positivas. Esto representa un obstáculo importante para caracterizar con precisión los fenotipos de las células inmunitarias, que a menudo requieren el uso de múltiples marcadores para una medición precisa. Por otro lado, la citometría de flujo es capaz de detectar simultáneamente múltiples marcadores celulares, pero requiere un gran volumen de muestras frescas y no proporciona información espacial sobre la ubicación de las células dentro del tejido. En particular, las células inmunitarias endometriales no se dispersan uniformemente por todo el tejido endometrial; por ejemplo, las células uNK están más densamente agregadas cerca de la capa basal del endometrio en comparación con las áreas cercanas a la cavidad luminal²⁰. Estas limitaciones de la IHQ convencional y la citometría de flujo se pueden abordar a través de m-IHC y la plataforma de análisis de imágenes conjugada con algoritmos de aprendizaje automático para lograr la segmentación de tejidos, la segmentación celular y la identificación de células positivas. Este enfoque mejora la eficiencia al analizar decenas de miles de células en cuestión de minutos, minimiza el sesgo del observador al identificar automáticamente las células positivas y permite un análisis más preciso mediante el uso de múltiples marcadores. Además, elimina la necesidad de muestras frescas y permite experimentos por lotes o análisis repetidos cuando sea necesario.

La realización de una evaluación exhaustiva de los fenotipos de células uNK mediante la técnica m-IHC puede proporcionar una comprensión más profunda de la correlación entre las células uNK y la implantación embrionaria, así como de sus cambios en las mujeres con RIF. Además de las células uNK, otras células inmunitarias endometriales también contribuyen a la homeostasis inmunitaria local. Por ejemplo, los linfocitos T reguladores (células Treg) mantienen la tolerancia inmunitaria mediante la liberación de factores inhibidores, como la IL-10 y el TGF-β, que suprimen la actividad de las células Th1 y Th2²¹. La diferenciación de los macrófagos M2, regulados por esteroides y citocinas Th2, contribuye al estado de inmunotolerancia al aumentar la actividad de la arginasa e inhibir la producción de óxido nítrico²². Además, las células dendríticas (CD) se diferencian en células tolerogénicas maduras dentro del útero, liberando factores como sFLT1 y TGF-β1 que regulan la neogénesis vascular e inhiben la función de las células T CD8+, manteniendo así la homeostasis inmunitaria y apoyando el desarrollo embrionario¹⁸. Al igual que las células uNK, estas células inmunitarias también son heterogéneas y un solo marcador no puede identificar con precisión sus fenotipos. La aplicación de m-IHC para evaluar subconjuntos de células uNK ilustra el potencial para identificar subconjuntos de estas células inmunitarias endometriales.

Además del endometrio, este método se puede aplicar a varios tejidos para identificar fenotipos de células inmunitarias. Al aplicarlo a otros tejidos, solo son necesarios pequeños ajustes para garantizar una tinción óptima. Además, si los investigadores tienen la intención de reemplazar ciertos marcadores, el panel original puede modificarse para cumplir con los requisitos experimentales específicos. La versatilidad y flexibilidad de este panel lo convierten en una herramienta adaptable para estudiar diferentes tejidos o diferentes subconjuntos celulares.

Esta tecnología no solo facilita la comprensión de los cambios detallados en las células inmunitarias endometriales para diseccionar el mecanismo subyacente de la no receptividad endometrial, sino que también proporciona potencial para el desarrollo de pruebas diagnósticas. La relativa facilidad de obtención y conservación de bloques y secciones de parafina ha allanado el camino para el uso generalizado de esta técnica. Con los paneles de tinción estandarizados, los hospitales pueden aprovechar la tecnología de tinción automatizada junto con sofisticados algoritmos de software para mejorar significativamente la eficiencia de sus procedimientos de análisis. Las ventajas de la tecnología m-IHC la convierten en una opción viable para las prácticas clínicas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Anticuerpos primarios
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Anticuerpos primarios
CD16	abcam	ab183354	Anticuerpos primarios
CXCR4	R& D	MAB172	Anticuerpos primarios
Diluyente de amplificación	Serie FP1498	Akoya Biosciences	Tampón de dilución de fluoróforos
Diluyentes de anticuerpos	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Diluir el anticuerpo
Solución tamponada de citrato, pH 6.0 /9.0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Solución de recuperación de antígenos
inForm software de análisis de imágenes avanzado inForm	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Software de análisis de datos
Estaciones de trabajo Mantra	Akoya Biosciences	CLS140089	Microondas de imágenes espectrales
Inversor	Akoya Biosciences	Extracción	microondas
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Reactivos fluorescentes adecuados a base de tiramida
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Reactivos fluorescentes adecuados a base de tiramida
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Reactivos fluorescentes adecuados a base de tiramida
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Reactivos fluorescentes adecuados a base de tiramida
Portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina Portaobjetos	120-550-15	Fisher Technologies	para uso histológico rutinario
PolyHRP Broad Spectrum Perkin	Elmer	ARH1001EA	Anticuerpos secundarios
Invitrogen™   Fluoromount-G™ Medio de montaje	ThemoFisher Science	495802	Instalación
DAPI espectral	Akoya Biosciences	FP1490A	Tinción de ácidos nucleicos