El artículo describe un protocolo para la aplicación de un modelo in vitro de agotamiento para completar un cribado de knockout de CRISPR en todo el genoma en células T receptoras de antígenos quiméricos de donantes sanos.
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Artículo de método
Realización de un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T receptoras de antígenos quiméricos
En este artículo
Resumen
Resumen
La terapia celular con receptor de antígeno quimérico T (CART) es una forma innovadora de inmunoterapia dirigida que ha revolucionado el tratamiento del cáncer. Sin embargo, la respuesta duradera sigue siendo limitada. Estudios recientes han demostrado que el panorama epigenético de los productos de células CART antes de la infusión puede influir en la respuesta a la terapia, y la edición genética se ha propuesto como una solución. Sin embargo, se necesita más trabajo para determinar la estrategia óptima de edición de genes. Las pantallas CRISPR de todo el genoma se han convertido en herramientas populares tanto para investigar los mecanismos de resistencia como para optimizar las estrategias de edición de genes. Sin embargo, su aplicación a las células primarias presenta muchos desafíos. Aquí describimos un método para completar un cribado de knockout de CRISPR en todo el genoma en células CART de donantes sanos. Como modelo de prueba de concepto, diseñamos este método para investigar el desarrollo del agotamiento en las células CART dirigidas al antígeno CD19. Sin embargo, creemos que este enfoque se puede utilizar para abordar una variedad de mecanismos de resistencia a la terapia en diferentes construcciones de CAR y modelos tumorales.
Introducción
La terapia con células del receptor de antígeno quimérico T (CART) ha demostrado un éxito impresionante en el tratamiento de las neoplasias malignas de células B; Sin embargo, la respuesta duradera se limita al 30-40%1,2,3,4,5. Si bien los investigadores han desarrollado y probado varios enfoques para abordar los mecanismos de resistencia a la terapia celular CART, incluida la optimización del diseño de CAR, la edición de genes y las terapias combinadas, el desarrollo de re....
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Protocolo
Es importante destacar que el protocolo que se describe a continuación sigue las pautas y ha recibido la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de Mayo Clinic (IRB 18-005745) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC HIP00000252.43). Todos los trabajos de cultivo celular, incluida la producción lentiviral, deben realizarse en una campana de cultivo celular con el equipo de protección personal adecuado. En particular, el trabajo lentiviral debe realizarse bajo precauciones de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), incluido el uso de lejía al 10% para desinfectar los artículos antes de desecharlos.
1. Amplificación de la biblio....
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Resultados
Para interrogar los genes y las vías que se pueden editar para mejorar la actividad de las células CART de manera imparcial, diseñamos una pantalla CRISPR knockout in vitro de todo el genoma (Figura 1). Esta criba tiene dos fases: una fase de producción de celdas CART y una fase de presión selectiva. En la fase de producción de células CART, al menos 110 × 106 células T se aíslan primero de las PBMC de donantes sanos y se activan con perlas CD3+/CD28+
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Discusión
La edición genética se ha convertido en una herramienta poderosa tanto para comprender los mecanismos de resistencia a las terapias como para diseñar nuevas terapias con células CART para mejorar la longevidad y la actividad de las células CART 16,17,26. Si bien algunas estrategias de edición de genes han mostrado mejoras en la actividad de las células CART tanto en modelos preclínicos como en e.......
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Divulgaciones
SSK es inventor de patentes en el campo de la inmunoterapia con CAR que están licenciadas a Novartis (a través de un acuerdo entre Mayo Clinic, la Universidad de Pensilvania y Novartis), Humanigen (a través de Mayo Clinic), Mettaforge (a través de Mayo Clinic) y MustangBio (a través de Mayo Clinic) y Chymal therapeutics (a través de Mayo Clinic). CS, CMR y SSK son inventores de patentes licenciadas a Immix Biopharma. SSK recibe fondos de investigación de Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc. y Lentigen. SSK ha participado en reuniones de asesoramiento con Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio y Novartis. SSK ha formado parte de la junta de seguridad y supervisión de datos con Humanigen y Carisma. SSK ha despedido a una consultora para Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, BMS, Carisma y Humanigen. CMS y SSK son inventores de la propiedad intelectual que resultó de este protocolo.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado en parte por el Centro de Medicina Personalizada de Mayo Clinic (SSK), el Centro Oncológico Integral de Mayo Clinic (SSK), el Centro de Bioterapéutica Regenerativa de Mayo Clinic (SSK), los Institutos Nacionales de Salud K12CA090628 (SSK) y R37CA266344-01 (SSK), el Departamento de Defensa CA201127 de subvenciones (SSK), la Fundación Predolin (SSK) y la Asociación de Minnesota para la Biotecnología y la Genómica Médica (SSK). Los CMS cuentan con el apoyo de la Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas de Mayo Clinic. El esquema de pantalla CRISPR (Figura 1) se creó con BioRender.com (Siegl....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células 293T | ATCC | CRL-3216 | Células utilizadas para la producción de lentivirus |
| Proteína de biotinaL Anticuerpo | GenScript | M00097 | anticuerpo anti-cadena kappa para la detección de CAR |
| Albúmina sérica bovina | Millipore Sigma | A7906 | |
| Carbenicilina sal disódica | Millipore Sigma | C1389-1G | Antibiótico carbenicilina |
| Aislamiento CD4 Perlas | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Perlas de aislamiento CD8 | Miltenyi Biotec | 130-045-201 | |
| CTS (Sistemas de terapia celular) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| Cytoflex | Beckman Coulter | NC2279958 | |
| Invitrogen | de agua libre de ADNasa | AM9937 | |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Gibco | 14190-144 | Dulbecco's | |
| Buffered | 17951RF | Kit de aislamiento negativo | |
| Células electrocompetentes Endura | Biosearch Technologies | 60242-1 | Células electrocompetentes con medio de recuperación |
| Etanol | Millipore Sigma | E7023 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library A | AddGene | 1000000048 | CRISPR library plásmido |
| Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105 | Electroporator |
| Glucógeno Millipore Sigma | 10901393001 | ||
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | CD19+ células diana |
| Reactivo de transfección Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000075 | Kit de reactivos de transfección con un reactivo de transfección (reactivo Lipofectamine 3000) y un reactivo colipídico neutro (p3000) |
| VIVO/MUERTO Aqua | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 7851 | Medio de gradiente de densidad |
| Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi Kits | ThermoFisher Scientific | 12748412 | kit de preparación maxi |
| NEBNext Alta fidelidad 2X PCR MasterMix | New England BioLabs | M0541S | maestra de PCR de alta fidelidad |
| Opti-MEM I Medio sérico reducido | Gibco | 31985-070 | Medio sérico reducido |
| pCMVR8.74 | AddGene | 22036 | Plásmido de empaquetado lentiviral |
| Penicilina-estreptomicina-glutamina (100X) | Life Technologies | 10378-016 | |
| pMD2.G | AddGene | 12259 | VSV-G que expresa la envoltura del plásmido |
| Pooled Human AB Serum | Investigación innovadora | ISERABHI | |
| Puromicina | Millipore Sigma | P8833 | |
| QIAquick Kit de extracción de gel | Qiagen | 28704 | Kit de extracción de Gek |
| Qucik-DNA Midiprep Plus Kit | Zymo Research | D4075 | Kit utilizado para aislar el ADNg |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Separador |
| celular automatizadoRoswell Park Memorial Institute 1640 Medio (RPMI) | Gibco | 21870092 | |
| SepMate-50 | STEMCELL Technologies | 85450 | Tubo de separación de gradiente de densidad |
| Acetato de sodio | Invitrogen | AM9740 | |
| Azida de sodio | Fisher Scientific | 71448-16 | |
| Anticuerpo de estreptavidina (PE) | BioLegend | 405203 | Anticuerpo secundario utilizado para la detección de CAR |
| Termociclador T100 | Ultracentrífuga 1861096 | ||
| (Optima XPN-80)Sistemas de filtro de | BeckmanCoulter | A99839 | |
| , 0.22 µ m | ThermoFisher Scientific | 567-0020 | |
| , 0.45 µ m | ThermoFisher Scientific | 165-0045 | |
| X-VIVO 15 Medio de células hematopoyéticas sin suero | Lonza | 04-418Q | Medio de células hematopoyéticas |
Referencias
- Neelapu, S. S., et al. 5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1). Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtag....
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Reimpresiones y permisos
