Análisis introductorio y validación de datos de secuenciación CUT&RUN

Resumen

Este protocolo guía a los principiantes en bioinformática a través de una línea de análisis introductoria de CUT&RUN que permite a los usuarios completar un análisis inicial y la validación de los datos de secuenciación de CUT&RUN. Completar los pasos de análisis descritos aquí, combinados con la anotación de picos aguas abajo, permitirá a los usuarios extraer información mecanicista sobre la regulación de la cromatina.

Resumen

La técnica CUT&RUN facilita la detección de las interacciones proteína-ADN en todo el genoma. Las aplicaciones típicas de CUT&RUN incluyen la creación de perfiles de cambios en las modificaciones de la cola de histonas o el mapeo de la ocupación de la cromatina del factor de transcripción. La adopción generalizada de CUT&RUN está impulsada, en parte, por las ventajas técnicas sobre ChIP-seq convencional que incluyen menores requisitos de entrada de celdas, menores requisitos de profundidad de secuenciación y mayor sensibilidad con una señal de fondo reducida debido a la falta de agentes de reticulación que de otro modo enmascararían los epítopos de anticuerpos. La adopción generalizada de CUT&RUN también se ha logrado gracias al generoso intercambio de reactivos por parte del laboratorio de Henikoff y el desarrollo de kits comerciales para acelerar la adopción por parte de los principiantes. A medida que aumenta la adopción técnica de CUT&RUN, el análisis y la validación de la secuenciación de CUT&RUN se convierten en cuellos de botella críticos que deben superarse para permitir la adopción completa por parte de los equipos de laboratorio predominantemente húmedos. El análisis CUT&RUN suele comenzar con controles de calidad de las lecturas de secuenciación sin procesar para evaluar la profundidad de la secuenciación, la calidad de la lectura y los posibles sesgos. A continuación, las lecturas se alinean con un ensamblaje de secuencia genómica de referencia y, posteriormente, se emplean varias herramientas bioinformáticas para anotar las regiones genómicas del enriquecimiento de proteínas, confirmar la interpretabilidad de los datos y extraer conclusiones biológicas. Aunque se han desarrollado múltiples canales de análisis in silico para soportar el análisis de datos de CUT&RUN, su compleja estructura de múltiples módulos y el uso de múltiples lenguajes de programación hacen que las plataformas sean difíciles para los principiantes en bioinformática que pueden carecer de familiaridad con múltiples lenguajes de programación pero desean comprender el procedimiento de análisis de CUT&RUN y personalizar sus canales de análisis. Aquí, proporcionamos un protocolo de canalización de análisis CUT&RUN paso a paso en un solo idioma, diseñado para usuarios con cualquier nivel de experiencia en bioinformática. Este protocolo incluye la realización de controles de calidad críticos para validar que los datos de secuenciación son adecuados para la interpretación biológica. Esperamos que seguir el protocolo introductorio proporcionado en este artículo, combinado con la anotación de picos aguas abajo, permita a los usuarios extraer información biológica de sus propios conjuntos de datos de CUT&RUN.

Introducción

La capacidad de medir las interacciones entre las proteínas y el ADN genómico es fundamental para comprender la biología de la regulación de la cromatina. Los ensayos eficaces que miden la ocupación de la cromatina para una proteína determinada proporcionan al menos dos datos clave: i) la localización genómica y ii) la abundancia de proteínas en una región genómica determinada. El seguimiento de los cambios en el reclutamiento y la localización de una proteína de interés en la cromatina puede revelar loci diana directa de la proteína y revelar las funciones mecanicistas de esa proteína en los procesos biológicos basados en la cromatina, como la regulación de la transcripción, la reparación del ADN o la replicación del ADN. Las técnicas disponibles hoy en día para perfilar las interacciones proteína-ADN están permitiendo a los investigadores explorar la regulación con una resolución sin precedentes. Estos avances técnicos han sido posibles gracias a la introducción de nuevas técnicas de perfilado de cromatina que incluyen el desarrollo de la escisión bajo objetivos y la liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) por parte del laboratorio Henikoff. CUT&RUN ofrece varias ventajas técnicas sobre la inmunoprecipitación de cromatina convencional (ChIP) que incluyen menores requisitos de entrada de células, menores requisitos de profundidad de secuenciación y una mayor sensibilidad con una señal de fondo reducida debido a la falta de agentes de reticulación que de otro modo enmascararían los epítopos de anticuerpos. La adopción de esta técnica para estudiar la regulación de la cromatina requiere una comprensión profunda del principio subyacente a la técnica y una comprensión de cómo analizar, validar e interpretar los datos de CUT&RUN.

El procedimiento CUT&RUN comienza con la unión de las células a la concanavalina A conjugada con perlas magnéticas para permitir la manipulación de números bajos de células durante todo el procedimiento. Las células aisladas se permeabilizan utilizando un detergente suave para facilitar la introducción de un anticuerpo que se dirige a la proteína de interés. A continuación, la nucleasa microcócica (MNasa) se recluta para el anticuerpo unido mediante una etiqueta de proteína A o proteína A/G unida a la enzima. El calcio se introduce para iniciar la actividad enzimática. La digestión de MNasa da lugar a complejos mononucleosomales de ADN-proteína. Posteriormente, el calcio se quela para finalizar la reacción de digestión, y los fragmentos cortos de ADN de la digestión de la MNasa se liberan de los núcleos, luego se someten a la purificación del ADN, la preparación de la biblioteca y la secuenciación de alto rendimiento¹ (Figura 1).

Los enfoques in silico para mapear y cuantificar la ocupación de proteínas en todo el genoma se han desarrollado en paralelo con los enfoques de laboratorio húmedo utilizados para enriquecer esas interacciones ADN-proteína. La identificación de regiones de señales enriquecidas (picos) es uno de los pasos más críticos en el análisis bioinformático. Los métodos iniciales de análisis ChIP-seq utilizaron algoritmos como MACS² y SICER³, que emplearon modelos estadísticos para distinguir los sitios de unión proteína-ADN de buena fe del ruido de fondo. Sin embargo, el menor ruido de fondo y la mayor resolución de los datos CUT&RUN hacen que algunos programas de llamadas máximas empleados en el análisis ChIP-seq no sean adecuados para el análisis CUT&RUN⁴. Este reto pone de manifiesto la necesidad de contar con nuevas herramientas más adecuadas para el análisis de los datos de CUT&RUN. SEACR⁴ representa una de esas herramientas desarrolladas recientemente para permitir la llamada máxima de los datos de CUT&RUN, al tiempo que supera las limitaciones asociadas con las herramientas que normalmente se emplean para el análisis ChIP-seq.

Las interpretaciones biológicas de los datos de secuenciación de CUT&RUN se extraen de las salidas posteriores a la llamada de picos en la canalización de análisis. Se pueden implementar varios programas de anotación funcional para predecir la relevancia biológica potencial de los picos llamados a partir de los datos de CUT&RUN. Por ejemplo, el proyecto Gene Ontology (GO) proporciona una identificación funcional bien establecida de genes de interés ^5,6,7. Diversas herramientas y recursos de software facilitan el análisis de GO para revelar genes y conjuntos de genes enriquecidos entre los picos de CUT&RUN 8,9,10,11,12,13,14. Además, el software de visualización como Deeptools¹⁵, Integrative genomics viewer (IGV)¹⁶ y UCSC Genome Browser¹⁷ permiten la visualización de la distribución de señales y patrones en regiones de interés en todo el genoma.

La capacidad de extraer interpretaciones biológicas a partir de los datos de CUT&RUN depende fundamentalmente de la validación de la calidad de los datos. Los componentes críticos a validar incluyen la evaluación de: i) la calidad de la secuenciación de la biblioteca CUT&RUN, ii) la similitud replicada y iii) la distribución de la señal en los centros de picos. Completar la validación de los tres componentes es crucial para garantizar la fiabilidad de las muestras de la biblioteca CUT&RUN y los resultados de los análisis posteriores. Por lo tanto, es esencial establecer guías introductorias de análisis CUT&RUN para permitir que los principiantes en bioinformática y los investigadores de laboratorio húmedo realicen dichos pasos de validación como parte de sus canales de análisis CUT&RUN estándar.

Junto con el desarrollo del experimento CUT&RUN de laboratorio húmedo, se han desarrollado varias tuberías de análisis CUT&RUN in silico, como CUT&RUNTools 2.0^18,19, nf-core/cutandrun²⁰ y CnRAP²¹, para respaldar el análisis de datos de CUT&RUN. Estas herramientas proporcionan enfoques potentes para analizar conjuntos de datos CUT&RUN y CUT&Tag de una sola celda y masivos. Sin embargo, la estructura relativamente compleja del programa modular y la familiaridad requerida con múltiples lenguajes de programación para llevar a cabo estas canalizaciones de análisis pueden dificultar la adopción por parte de los principiantes en bioinformática que buscan comprender a fondo los pasos de análisis de CUT&RUN y personalizar sus propias canalizaciones. La elusión de esta barrera requiere una nueva canalización de análisis CUT&RUN introductoria que se proporciona en scripts simples paso a paso codificados con un solo lenguaje de programación simple.

En este artículo, describimos un sencillo protocolo de canalización de análisis CUT&RUN de un solo idioma que proporciona scripts paso a paso compatibles con descripciones detalladas para permitir que los usuarios nuevos y novatos realicen análisis de secuenciación CUT&RUN. Los programas utilizados en esta canalización están disponibles públicamente por los grupos de desarrolladores originales. Los pasos principales descritos en este protocolo incluyen la alineación de lectura, la llamada de picos, el análisis funcional y, lo que es más importante, los pasos de validación para evaluar la calidad de la muestra y determinar la idoneidad y confiabilidad de los datos para la interpretación biológica (Figura 2). Además, esta canalización brinda a los usuarios la oportunidad de hacer referencias cruzadas de los resultados del análisis con los conjuntos de datos CUT&RUN disponibles públicamente. En última instancia, este protocolo de canalización de análisis CUT&RUN sirve como guía introductoria y referencia para los principiantes en análisis bioinformático y los investigadores de laboratorio húmedo.

Protocolo

NOTA: La información sobre los archivos fastq de CUT&RUN en GSE126612 está disponible en la Tabla 1. La información relacionada con las aplicaciones de software utilizadas en este estudio se enumera en la Tabla de Materiales.

1. Descargar el pipeline de Easy-Shells_CUTnRUN desde su página de Github

1. Abra el terminal desde el sistema operativo.
   NOTA: Si el usuario no está seguro de cómo abrir el terminal en macOS y Windows, revise esta página web (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). Para Linux, revise esta página web (https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/).
2. Descargue la canalización de análisis comprimido de Github escribiendo wget https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/archive/refs/heads/main.zip -O ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip en el terminal.
3. Después de descargar el archivo zip, descomprima el archivo zip descargado escribiendo unzip ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip -d ~/Desktop/ en el terminal.
4. Después de la descompresión, elimine el archivo zip escribiendo rm ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip en el terminal y cambie el nombre de la carpeta escribiendo mv ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN-master ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.
5. Después de eliminar el archivo comprimido, escriba chmod +x ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/script/*.sh en el terminal para establecer el permiso ejecutable para todos los scripts de shell dentro del directorio de trabajo. A partir de ahora, simplemente escriba la ruta y el nombre de estos scripts de shell en la terminal o arrastre los scripts a la terminal e ingrese para ejecutar estos scripts de shell en la terminal.
   NOTA: El shell Bash suele estar preinstalado en la mayoría de las distribuciones de Linux. Sin embargo, las versiones recientes de macOS ya no proporcionan un shell Bash preinstalado. Si el sistema no tiene Bash, instale primero el shell de Bash. Visite los enlaces a continuación para obtener instrucciones que describen cómo instalar el shell Bash en el sistema operativo Linux (https://ioflood.com/blog/install-bash-shell-linux/) y macOS (https://www.cs.cornell.edu/courses/cs2043/2024sp/styled-3/#:~:text=The first thing you will,you will see the following:). Estos scripts de shell paso a paso se escriben para crear una carpeta ~/Desktop/GSE126612 para realizar la mayor parte de este análisis CUT&RUN dentro de este directorio sin necesidad de modificación. Si el usuario entiende cómo usar estos scripts de shell, los usuarios pueden revisar y personalizar estos scripts de shell para analizar otros conjuntos de datos de CUT&RUN y modificar las opciones según las necesidades específicas del proyecto. Para leer y editar estos scripts de shell, considere la posibilidad de usar Visual Studio Code (https://code.visualstudio.com/) como una opción para un programa fácil de usar disponible para los principales sistemas operativos.

2. Instalación de los programas necesarios para Easy Shells CUTnRUN

1. Entre los scripts de shell con el nombre de Script_01_installation_***.sh, averigüe el script de shell cuyo nombre incluye el tipo de sistema operativo del sistema del usuario. Actualmente, Easy Shells CUTnRUN soporta el script de instalación para sistemas basados en macOS, Debian/Ubuntu y CentOS/RPM.
2. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
3. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
4. En el terminal, opere el script de shell de instalación escribiendo ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_01_installation_***.sh o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
5. Lea Test_README.md en la carpeta /path/to/SEACR-1.3/Testfiles. Siga las instrucciones dentro del archivo README para aclarar si el SEACR en el sistema del usuario funciona correctamente.
   NOTA: Es crucial validar la función SEACR con los archivos de prueba proporcionados por la página de Github de SEACR para obtener resultados adecuados de llamadas máximas a partir de los datos de CUT&RUN. Por lo tanto, siga las instrucciones de Test_README.md en /path/to/SEACR-1.3/Testfiles inmediatamente después de la instalación de SEACR. Aunque Easy Shells CUTnRUN proporciona scripts de shell de instalación para algunos sistemas operativos, es posible que estos scripts no funcionen en el sistema de algunos usuarios para instalar todos los programas necesarios para Easy Shells CUTnRUN. Si hay algún problema en la instalación, revise el sitio web original del programa desinstalado o solicite ayuda utilizando la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.

3. Descargar el conjunto de datos CUT&RUN disponible públicamente desde el Archivo de lectura de secuencias (SRA)

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_02_download-fastq.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script: (i) creará una carpeta (~/Desktop/GSE126612/fastq) y descargará una lista de archivos SRA escritos en un archivo de texto (~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/sample_info/SRR_list.txt) dentro de la carpeta fastq. A modo de ejemplo, el SRR_list.txt incluye los archivos fastq de un subconjunto de muestras de CUT&RUN GSE126612. (ii) Descargue los archivos fastq sin procesar dentro de la carpeta fastq. (iii) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/log/fastq) y anote un archivo de registro (download-fastq_log.txt) y un archivo de información de muestra descargado (SRR_list_info.txt) dentro de esta carpeta de registro.
4. Después de ejecutar el script, compruebe el archivo de registro. Si hay algún mensaje de error en el archivo de registro, corrija el error y vuelva a intentar el paso 3.3. Si hay algún problema para resolverlo, pida ayuda en la página web de problemas de github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
   NOTA: Para facilitar la práctica de esta línea de análisis CUT&RUN, se recuperan las siguientes muestras disponibles públicamente de SRA: una muestra de control simulado (IgG), tres muestras de una arquitectura de cromatina y proteína factor de transcripción (CTCF), cuatro muestras correspondientes a una marca de histonas "activa" (H3K27Ac) y tres muestras correspondientes a regiones de iniciación transcripcional marcadas por la ARN polimerasa II (RNAPII-S5P). La secuenciación se realizó en pareado, por lo que se emparejan dos archivos por muestra.

4. Control de calidad inicial de los archivos de secuenciación sin procesar

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_03_fastQC.sh en el terminal o arrastre el script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script de shell: (i) Ejecutará el programa FastQC para todos los archivos fastq sin procesar en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/fastq y guardará los archivos del informe de verificación de calidad en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/fastqc.1st . (ii) Escriba un archivo de registro (fastqc.1st.log.SRR-number.txt) por ejecución de FastQC en una carpeta de registro (~/Desktop/GSE126612/log/fastqc.1st).
4. Una vez finalizada la ejecución del script de shell, revise el archivo de registro para aclarar el éxito de la ejecución. Si hay algún mensaje de error en el archivo de registro, corríjalo y repita el paso 4.3. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: Entre los archivos de salida, los archivos fastqc.html incluyen resultados de control de calidad fáciles de usar. Si hay problemas graves de calidad, hable con sus colegas de bioinformática para determinar la idoneidad de los datos para el análisis posterior. Se utilizan informes de control de calidad similares para confirmar la mejora de la calidad de los datos después del recorte del adaptador. Para utilizar este script para otros conjuntos de datos, edite la ruta de los directorios de trabajo y de salida para satisfacer las necesidades del usuario. Una diferencia notable a la hora de interpretar el control de calidad de CUT&RUN en comparación con las lecturas de ChIP-seq es que las lecturas duplicadas en CUT&RUN no indican necesariamente duplicados de PCR. Esto se debe a que la MNase reclutada se digiere en el mismo lugar o en lugares similares dentro de los grupos experimentales.

5. Calidad y recorte del adaptador para archivos de secuenciación sin procesar

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_04_trimming.sh en el terminal o arrastre el script Script_04_trimming.sh al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script de shell: (i) Ejecutará el programa Trim-Galore para todos los archivos fastq sin procesar en ~/Desktop/GSE126612/fastq para realizar un recorte de adaptador y calidad. (ii) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/trimmed) y guarde los archivos de salida de Trim-Galore dentro de la carpeta recortada. (iii) Cree una carpeta de registro (~/Desktop/GSE126612/log/trim_galore) y anote un archivo de registro trim_galore_log_RSS-number.txt por cada ejecución de Trim-Galore.
4. Una vez finalizada la ejecución, revise detenidamente el archivo de registro. Si hay algún mensaje de error en el archivo de registro, corríjalo y repita el paso 5.3. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
5. Una vez completado este proceso, compare los archivos de salida .html con los archivos fastqc.html creados en 4.3. Revise la ruta de los directorios de entrada y salida para realizar el paso de recorte de cualquier archivo fastq ubicado en otro lugar.

6. Descarga del índice bowtie2 para los genomas de referencia para muestras de control reales y con picos

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_05_bowtie2-index.sh en el terminal o arrastre el script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script: (i) Descargará los índices Bowtie2 para los genomas de referencia de muestras reales (humanos; hg19; utilizados en la publicación original²²) y los genomas de referencia de control Spike-in (levadura en ciernes; R64-1-1) en la carpeta bowtie2-index (~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/bowtie2-index). (iii) Escriba un archivo de registro (bowtie2-index-log.txt) en un directorio de registro (~/Desktop/GSE126612/log/bowtie2-index).
4. Una vez finalizada la ejecución, compruebe el archivo de registro. Si hay algún mensaje de error, corríjalo y repita el paso 6.3. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: Actualmente, los índices de Bowtie2 para varios genomas de referencia se proporcionan en el sitio web de Bowtie2 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml). Los usuarios pueden editar Script_05_bowtie2-index.sh para descargar cualquier índice de Bowtie2 para cumplir con los requisitos del usuario. Si el usuario no puede localizar el índice Bowtie2 del genoma de referencia de interés, localice los archivos fasta de la secuencia del genoma de referencia de:
   1. Ensembl ftp (https://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/)
   2. Página web de la UCSC (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/downloads.html)
   3. u otras bases de datos específicas de especies.
      Después de localizar los archivos fasta de la secuencia del genoma de referencia, cree un índice Bowtie2 para el genoma de referencia descargado siguiendo la sección (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#the-bowtie2-build-indexer) "El indexador de construcción de bowtie2" del sitio web de Bowtie2.

7. Mapeo de lecturas de secuenciación CUT&RUN recortadas a los genomas de referencia

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_06_bowtie2-mapping.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script de shell: (1) Ejecutará el programa bowtie2 para mapear todos los archivos fastq recortados y del adaptador tanto para el experimental (humano; hg19) como para el control de picos (levadura en ciernes; R64-1-1) genomas de referencia de forma independiente. (ii) Ejecute la función de vista samtools para comprimir los archivos de pares de lectura asignados en formato bam. (iii) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/bowtie2-mapped) y guarde el archivo comprimido de pares de lectura mapeados dentro de la carpeta bowtie2-mapped. (iv) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/log/bowtie2-mapped) y anote el registro del proceso de mapeo como archivo de texto bowtie2_log_hg19_SRR-number.txt para pares de lectura mapeados en el genoma de referencia hg19 y bowtie2_log_R64-1-1_SRR-number.txt para pares de lectura mapeados en R64-1-1) para indicar la eficiencia del mapeo dentro de la carpeta de registro de mapeo bowtie2.
4. Una vez finalizada la ejecución, compruebe el archivo de registro. Si hay algún mensaje de error en el archivo de registro, corríjalo y vuelva a ejecutar el script de shell. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: Este script de shell ejecuta bowtie2 con opciones para mapear archivos de secuenciación de extremos emparejados para encontrar pares de lectura mapeados concordantemente con longitudes de fragmento de 10 bp-700 bp. Descubra las descripciones de las opciones escribiendo bowtie2 --help en el terminal o visitando el sitio web de bowtie2 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#the-bowtie2-aligner) para comprender y cambiar las opciones según sea necesario. Utilice este script de shell para asignar cualquier otro archivo fastq cambiando la ruta y el formato de nombre de los archivos fastq y los índices Bowtie2.

8. Ordenar y filtrar los archivos de pares de lectura asignados

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo "chsh -s $(which bash)" en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_07_filter-sort-bam.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script: (i) Ejecutará la función de vista samtools para todos los archivos de pares de lectura mapeados comprimidos en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/bowtie2-mapped para filtrar los pares de lectura mapeados en regiones de cromosomas no canónicos, listas negras anotadas públicamente y regiones de repetición de TA. (ii) Ejecute la función de ordenación samtools para ordenar los archivos bam filtrados por los nombres de los fragmentos o coordenadas dentro del mismo directorio. (iii) Anote un archivo de registro por un archivo bam de entrada en el directorio ~/Desktop/GSE126612/log/filter-sort-bam .
4. Una vez finalizada la ejecución, revise detenidamente los archivos de registro. Si hay algún mensaje de error en los archivos de registro, corríjalo e intente ejecutar el script de shell de nuevo. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: Los archivos bam (salida) resultantes ordenados por los nombres de los fragmentos servirán como archivos de entrada para crear archivos BED de fragmentos y recuentos de lecturas sin procesar bedGraph. Los archivos bam ordenados por coordenadas servirán como archivos de entrada para generar archivos BEDPE de fragmentos. Todos los BED, bedGraph y BEDPE se utilizarán para la llamada de picos y la visualización en el análisis posterior. Todos los archivos de lecho de anotaciones para las regiones cromosómicas canónicas (chr1~22, chrX, chrY y chrM), las regiones de lista negra^{anotadas públicamente 23} y las regiones de repetición TA¹⁸ se encuentran en el directorio ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/blacklist . Si es necesario, use este directorio para agregar archivos de lista negra adicionales. Utilice este script de shell para realizar las mismas funciones para otros archivos bam de pares de lectura asignados cambiando la ruta y el nombre de los archivos bam. Escriba samtools view --help y samtools sort --help en el terminal para obtener más información sobre estas funciones.

9. Convierta pares de lecturas asignadas en fragmentos BEDPE, BED y recuentos de lecturas sin procesar archivos bedGraph

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_08_bam-to-BEDPE-BED-bedGraph.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script: (i) Ejecutará la función filterdup y awk de macs3 para convertir archivos bam ordenados por coordenadas en archivos BEDPE fragmentados cuyas longitudes de fragmento son inferiores a 1 kb, y guardará los archivos BEDPE en ~/Desktop/GSE126612/BEDPE. (ii) Cree un directorio de registro (~/Desktop/GSE126612/log/bam-to-BEDPE) y anote un archivo de registro por archivo de fragmentos de lecturas asignados. (iii) Ejecute las funciones bedtools bamtobed y awk, cut, sort para convertir archivos bam ordenados por los nombres de los fragmentos en archivos BED de fragmentos cuyas longitudes de fragmento son inferiores a 1 kb. (iv) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/bam-to-bed) y guarde los archivos BED de fragmentos dentro de la carpeta bam-to-bed. (v) Escriba un archivo de registro por archivo BED de fragmentos de lecturas mapeados en un directorio de registro (~/Desktop/GSE126612/log/bam-to-bed). (vi) Ejecute la función bedtools genomecov para generar archivos bedGraph de recuentos de lecturas sin procesar utilizando los archivos BED de fragmentos en una carpeta (~/Desktop/GSE126612/bedGraph).
4. Una vez finalizada la ejecución, compruebe detenidamente los archivos de registro. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: Los archivos bedGraph de recuentos de lecturas sin procesar de salida se utilizarán como archivos de entrada para el programa de llamadas máximas SEACR con la opción de normalización en la sección 12 y la normalización de recuento de lecturas fraccional escalado (SFRC)²² en la sección 10. Los archivos BED de fragmentos servirán como archivos de entrada para lecturas mapeadas normalizadas por millón con picos en la normalización de control negativo (SRPMC) ^24,25 en la sección^10.To capturar fragmentos cortos (>100 bp) solo para datos CUT&RUN de factores asociados a la cromatina, cambie el paso de filtración de fragmentos en este script y continúe con el paso de normalización. Para comparar las señales CUT&RUN entre fragmentos de tamaño corto y regular dentro de la misma muestra, la normalización de SFRC puede ser útil para reducir el posible efecto de reducción de muestreo causado por la captura de fragmentos cortos solamente. Utilice este script de shell para realizar los mismos procesos para otros archivos bam ordenados secuenciados emparejados cambiando la ruta y el formato de nombre de los archivos bam y bed.

10. Conversión de archivos bedGraph de recuentos de lecturas sin procesar a archivos bedGraph y bigWig normalizados

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_09_normalization_SFRC.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar el bucle for con la función awk para crear archivos bedGraph normalizados por SFRC utilizando archivos bedGraph de readcounts sin procesar dentro de ~/Desktop/GSE126612/bedGraph. (ii) Ejecute la función bedGraphToBigWig para crear un formato comprimido (.bw) de los archivos bedGraph normalizados de SFRC en ~/Desktop/GSE126612/bigWig. (iii) Anote un archivo de registro para registrar el factor de normalización utilizado para el cálculo de SFRC por ejecución y guarde el archivo de registro dentro de ~/Desktop/GSE126612/log/SFRC.
4. Una vez finalizada la ejecución, compruebe los archivos de registro. Si hay algún mensaje de error, corríjalo y vuelva a ejecutar el script de shell. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: La normalización de recuento de lecturas fraccional a escala se utilizó en la publicación original²² del conjunto de datos CUT&RUN GSE126612. La fórmula de la normalización en el bin i es la misma que se muestra a continuación:
   
   Dado que este método de normalización no incluye la normalización con control negativo (por ejemplo, muestra de IgG) ni el control de picos, este enfoque puede no ser ideal para observar la diferencia de señal en todo el genoma entre muestras. Sin embargo, dado que este método es teóricamente similar a otras normalizaciones basadas en recuentos totales de lecturas (por ejemplo, recuento por millón), sería suficiente observar la diferencia de señal local entre las muestras.
5. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_09_normalization_SRPMC.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script: (i) Ejecutará el bucle for con la función bedtools genomecov para crear archivos bedgraph normalizados SRPMC en ~/Desktop/GSE126612/bedGraph utilizando archivos BED de fragmentos en ~/Desktop/GSE126612/bam-to-bed. (ii) Anote un archivo de registro para registrar los factores de normalización utilizados para la normalización de SRPMC por una ejecución en ~/Desktop/GSE126612/log/SRPMC. (iii) Ejecute la función bedGraphToBigWig para crear un formato comprimido (.bw) de los archivos bedGraph normalizados y guarde los archivos bigWig normalizados en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/bigWig .
6. Una vez finalizada la ejecución, revise detenidamente los archivos de registro. Si hay algún mensaje de error en los archivos de registro, corríjalo y vuelva a ejecutar el script de shell. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: La fórmula de normalización de SRPMC se desarrolló para normalizar los recuentos de lecturas de muestras reales con control negativo (muestra de IgG, por ejemplo) y control de pico mediante la combinación de RPM (lecturas por millón de lecturas asignadas), RPS (proporción de lecturas por pico de lectura) y relación de señal relativa para controlar^24,25. La definición de RPS es la misma que la siguiente:
   
   Al aplicar RPS tanto para la muestra real como para la muestra de control negativa, la relación de señal relativa (RS) para controlar la muestra real se puede calcular de la siguiente manera:
   
   Y la definición del factor de normalización de RPM (RPM:NF) es la misma que se muestra a continuación:
   
   A partir de aquí, el factor de normalización SRPMC (SRPMC:NF) ha salido combinando el RS y el RPM:NF:
   
   Y esta fórmula se puede simplificar de la siguiente manera:
   
   Por lo tanto, el método SRPMC normaliza las lecturas por la (1) relación de lecturas de picos entre el control y la muestra, y (2) lecturas de control normalizadas RPM. Dado que este factor de normalización tiene en cuenta las lecturas de picos y hace que las lecturas de control sean comparables entre muestras juntas, este método sería apropiado para observar la diferencia en todo el genoma entre las muestras y reducir el efecto de lote en las lecturas totales de muestras reales y controles en diferentes experimentos con lotes. Estos archivos bedGraph normalizados se convertirán en archivos de entrada para llamar a los picos mediante SEACR en la sección 11. Y estos archivos bigWig normalizados se utilizarán en la visualización de loci a través de IGV y en la creación de mapas de calor y gráficos promedio a través de Deeptools. Se recomienda encarecidamente utilizar un navegador de genomas para visualizar el patrón de paisaje del conjunto de datos CUT&RUN utilizando los archivos bigWig normalizados en regiones genómicas representativas para evaluar la calidad de los datos. Es probable que sea apropiado omitir las muestras CUT&RUN que muestran patrones de señal de fondo ruidosos que se asemejan al control IgG para los análisis posteriores. Utilice estos scripts de shell para normalizar otros archivos de lecho de lecturas y recuentos de lecturas sin procesar archivos bedGraph cambiando la ruta y los nombres de archivo para los archivos bed y bedgraph de entrada y salida. Edite estos scripts para aplicar otros cálculos de normalización cambiando los factores y la fórmula dentro de este script.

11. Validación de la distribución del tamaño de los fragmentos

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_10_insert-size-analysis.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar picard.jar función CollectInsertSizeMetrics utilizando archivos bam de pares de lectura asignados en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/filtered-bam para identificar la distribución del tamaño de inserción. (ii) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/insert-size-distribution) y guarde los resultados del análisis de distribución del tamaño de inserción en la carpeta creada. (iii) Escriba un archivo de registro por un archivo bam de entrada en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/insert-size-distribution .
4. Una vez finalizada la ejecución, compruebe detenidamente los archivos de registro. Si hay algún mensaje de error en los archivos de registro, corrija el error e intente ejecutar el script de shell de nuevo. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: En general, el análisis del tamaño de la plaquita (salida) para muestras CUT&RUN muestra picos importantes en los rangos de tamaño nucleosomal mono- (100-300 pb) y di- (300-500 pb). Los errores/limitaciones técnicas (como la digestión excesiva o insuficiente de MNasa durante la preparación de la muestra CUT&RUN o la selección incorrecta del tamaño durante la preparación de la biblioteca) pueden causar el enriquecimiento de fragmentos iguales o más grandes que los trinucleosomales (500-700 pb) e iguales o más cortos que los subnucleosomales (<100 pb). A veces, la ausencia de picos de tamaño mononucleosómico con el enriquecimiento de los fragmentos largos (>500 pb) y cortos (<100 pb) puede deberse a los rangos de selección de tamaño de la biblioteca elegidos en la etapa de laboratorio húmedo o a la baja profundidad de secuenciación. Compare la profundidad de secuenciación ('bases secuenciadas totales' / 'tamaño total del genoma de referencia'), la descripción general del panorama genómico utilizando recuentos de lecturas normalizados, archivos bigWig en la sección 10 y el patrón de distribución del tamaño de las inserciones para aclarar la calidad de las muestras CUT&RUN procesadas. Las líneas discontinuas de los histogramas representan la "fracción acumulativa" de las lecturas con un tamaño de inserción mayor o igual que el valor del eje x. Esta línea discontinua permite identificar la distribución de los tamaños de inserción en el archivo de lecturas asignadas de entrada. La progresión a lo largo del eje x se asocia con el aumento del tamaño de la plaquita. La línea discontinua identifica la proporción de pares de lectura asignados en el archivo bam de entrada que tienen un tamaño de inserción al menos tan grande como el indicado en la posición del eje x de intersección. Por lo tanto, la interpretación comienza en 1 a la izquierda, lo que indica que todas las lecturas tienen un tamaño de inserción mayor o igual que el tamaño más pequeño, y disminuye hacia 0 a medida que aumenta el tamaño de inserción.

12. Picos de llamadas usando MACS2, MACS3 y SEACR

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_11_peak-calling_MACS.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar las funciones callpeak y callpeak de macs2 con y sin control IgG utilizando archivos BEDPE de fragmentos para llamar a los picos y guardar los resultados de las llamadas de picos en los directorios de salida (~/Desktop/GSE126612/MACS2 y ~/Desktop/GSE126612/MACS3). (ii) Anote el registro de estos picos de llamadas como archivo de texto en el directorio de registro (~/Desktop/GSE126612/log/MACS2 y ~/Desktop/GSE126612/log/MACS3)
4. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_11_peak-calling_SEACR.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar SEACR_1.3.sh script con y sin control IgG, con opciones estrictas y relajadas utilizando archivos bedGraph y bedGraph normalizados y readcounts sin procesar para llamar a los picos. (ii) Cree un directorio de salida (~/Desktop/GSE126612/SEACR-peaks) y guarde los resultados de las llamadas máximas por SEACR. (iii) Anote el registro de estos picos de llamadas como archivo de texto en el directorio de registro (~/Desktop/GSE126612/log/SEACR).
5. Una vez finalizado la ejecución de los scripts de shell, compruebe detenidamente los archivos de registro. Si hay algún mensaje de error en los archivos de registro, corríjalo primero. Es posible que algunos programas no llamen los picos para la muestra de control de IgG con la opción de control de IgG juntos, por lo tanto, omitan el mensaje de error con respecto a la muestra de control de IgG con la opción de control de IgG. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: Estos dos scripts de shell realizan llamadas de picos para muestras CUT&RUN utilizando tres llamadores de picos (MACS2, MACS3 y SEACR) con varias opciones: con/sin opción de control IgG, usando archivos bedGraph de recuentos de lecturas sin procesar con la opción de normalización del llamador máximo o archivos bedGraph de recuentos de lecturas normalizados sin la opción de normalización del llamador máximo, y opciones de llamada al pico SEACR estrictas y relajadas. Dado que los archivos de salida de llamada de picos no son suficientes para ser utilizados directamente en los análisis posteriores, Easy Shells CUTnRUN incluye un script para procesar estos archivos de salida llamados picos para crear nuevos archivos de picos que incluyen cromosoma, inicio, fin y nombre de picos. A través de enfoques intensivos de llamadas máximas, Easy Shells CUTnRUN ofrece la oportunidad de elegir el programa de llamadas máximas más adecuado para el proyecto CUT&RUN de un usuario comparando los picos llamados en tres llamadas máximas. Además, este canal de análisis de CUT&RUN también ofrece la oportunidad de seleccionar las opciones de llamadas máximas más adecuadas para el proyecto CUT&RUN de un usuario. Estas comparaciones se realizarán mediante diagrama de Venn, y la visualización en forma de mapa de calor y gráfico promedio.

13. Creación de archivos de lecho de pico llamados

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_12_make-peak-bed.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar la función awk utilizando archivos de cama en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/SEACR para crear dos tipos de archivos de cama de pico SEACR ~/Desktop/GSE126612/bed_SEACR carpeta. Los archivos completos del lecho de picos incluyen el inicio y el final de cada pico, y los archivos del lecho de picos enfocados incluyen el inicio y el lecho del intervalo de señal más alto dentro de cada pico. (ii) Ejecute la función awk utilizando archivos _peaks.xls en las carpetas ~/Desktop/GSE126612/MACS2 y ~/Desktop/GSE126612/MACS3 para crear archivos de lecho de pico completos que incluyen el inicio y el final de cada pico llamado por MACS2 y MACS3 en las carpetas ~/Desktop/GSE126612/peak-bed_MACS2 y ~/Desktop/GSE126612/peak-bed_MACS3 . (iii) Ejecute la función awk utilizando archivos _summits.bed en las carpetas ~/Desktop/GSE126612/MACS2 y ~/Desktop/GSE126612/MACS3 para crear archivos de lecho de pico enfocados que incluyen el inicio y el final de la bandeja más significativa dentro de cada pico. (iv) Los archivos de registro se escriben en formato de archivo de texto en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/peak-bed .
4. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_13_filter-peaks.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar la función de intersección bedtools utilizando archivos de lecho de picos a los que se llama sin la opción de control de IgG para eliminar picos superpuestos con picos de control de IgG. (ii) Los archivos filtrados de peak bed se guardan en las carpetas ~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_MACS2, ~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_MACS3 y ~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_SEACR . (iii) Se crea un archivo de registro log_filter-peaks.txt en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/filter-peaks .
5. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_14_cat-merge-peak-bed_MACS.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar funciones cat y sort para concatenar los archivos de lecho de pico completo MACS2 y MACS3 de las réplicas como un archivo de lecho de pico y ordenar el archivo de lecho de pico concatenado en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/bed-for-comparison . (ii) Ejecute la función de fusión de herramientas de cama utilizando los archivos de lecho de picos completos concatenados para fusionar picos que se superponen entre sí. (iii) Se escribe un archivo de registro log_cat-merged-peak-bed_MACS.txt en la carpeta de registro ~/Desktop/GSE126612/log/cat-merged-peak-bed.
6. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_14_cat-merge-peak-bed_SEACR.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar funciones cat y sort para concatenar los archivos de lecho de pico completo SEACR de las réplicas como un archivo de lecho de pico y ordenar el archivo de lecho de pico concatenado en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/bed-for-comparison . (ii) Ejecute la función de fusión de herramientas de cama utilizando los archivos de lecho de picos completos concatenados para fusionar picos que se superponen entre sí. (iii) Un archivo de registro log_cat-merged-peak-bed_SEACR.txt se escribe en la carpeta de registro ~/Desktop/GSE126612/log/cat-merged-peak-bed.
7. Una vez finalizada la ejecución de los scripts de shell, revise los archivos de registro cuidadosamente. Si hay algún mensaje de error en los archivos de registro, corríjalo y vuelva a ejecutar los scripts. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: Los archivos de lecho de pico de todas las regiones de pico se utilizarán como archivos de entrada del análisis del diagrama de Venn para comparar la similitud entre las opciones de llamada de picos, los métodos de llamada de picos, las réplicas y las observaciones del paisaje genómico cerca de las regiones de picos. Los archivos de lecho de pico de regiones de pico completas fusionadas se utilizarán para el análisis de componentes principales (PC) y el análisis de correlación de coeficiente de Pearson utilizando deeptools. Los archivos de lecho de picos enfocados se utilizarán para el mapa de calor y el análisis de gráficos promedio utilizando Deeptools.

14. Validar la similitud entre réplicas utilizando la correlación de Pearson y el análisis de componentes principales (PC).

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell de Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, los usuarios pueden ver lo siguiente: /path/to/bash (o un mensaje similar como /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash de forma predeterminada, omita este paso.
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_15_correlation_plotCorrelation.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar la función de archivo BED multiBamSummary utilizando los archivos bam de las réplicas, que se ordenaron por coordenadas, y fusionaron archivos de lecho de pico completo para CTCF, H3K27Ac y RNAPII-S5P para generar archivos de matriz para el análisis de correlación de Pearson en la carpeta Desktop/GSE126612/deeptools_multiBamSummary . (ii) Ejecute la función plotCorrelation utilizando los archivos de matriz para realizar el cálculo del coeficiente de correlación de Pearson y la agrupación de mapas de calor y guarde el resultado en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotCorrelation . (iii) Anote un archivo de registro log_plotCorrelation.txt en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/correlation .
4. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_15_correlation_plotPCA.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar la función de archivo BED multiBamSummary utilizando los archivos bam, que se ordenaron por coordenadas, y fusionaron archivos de lecho de picos completos, que incluyen todos los picos CTCF, H3K27ac y RNAPII-S5P, para generar archivos de matriz para el análisis de componentes principales (PCA) en la carpeta Desktop/GSE126612/deeptools_multiBamSummary . (ii) Ejecute la función plotPCA utilizando los archivos de matriz para realizar PCA y guarde el resultado en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotPCA . (iii) Anote un archivo de registro log_plotPCA.txt en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/correlation .
5. Una vez finalizado la ejecución de los scripts de shell, compruebe los archivos de registro. Si hay algún mensaje de error, corríjalo y vuelva a ejecutar los scripts de shell. Si hay algún problema para resolverlo, solicite ayuda a través de la página web de problemas de github (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues) de Easy Shells CUTnRUN.
   NOTA: En principio, las réplicas debidamente preparadas y procesadas muestran valores más altos del coeficiente de correlación de Pearson dentro del mismo grupo de agrupamiento y una posición cercana en el análisis de componentes principales. Cualquier réplica, que muestre un coeficiente de correlación de Pearson más bajo, y una larga distancia de otras réplicas en la gráfica de componentes principales, puede representar un valor atípico potencial entre las réplicas. Este script de shell es aplicable para cualquier dato de lectura asignado en formato bam. Cambie la ruta y el nombre de archivo de los archivos bigwig para cumplir con los requisitos específicos del proyecto.

15. Validar la similitud entre réplicas, métodos de llamada de picos y opciones usando el diagrama de Venn

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, puede haber algo como /path/to/bash (por ejemplo, /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash como predeterminado, considere omitir este paso
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_16_venn-diagram_methods.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar la función venn de intervención utilizando archivos de lecho de picos de toda la región de picos para encontrar superposiciones entre los picos llamados por varias opciones (con / sin opción de control de IgG, con / sin normalización y opciones de llamada de pico estrictas / relajadas para SEACR). (ii) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/intervene_methods) y guarde los resultados del análisis del diagrama de Venn en esta carpeta. (iii) Anote un archivo de registro log_intervene_methods.txt en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/intervene.
4. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_16_venn-diagram_replicates.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e introduzca.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar la función venn de intervención utilizando archivos de lecho de picos de toda la región de picos para encontrar superposiciones entre los picos de las réplicas. (ii) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/intervene_replicates) y guarde los resultados del análisis del diagrama de Venn en esta carpeta. (iii) Anote un archivo de registro log_intervene_replicates.txt en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/intervene .
5. Una vez finalizado el proceso de ejecución de los scripts de shell, revise los archivos de registro. Si hay algún mensaje de error, corríjalo y vuelva a ejecutar los scripts de shell. Si hay algún problema en el uso de la canalización de análisis de Easy Shells CUTnRUN, pida ayuda en la página web de problemas de Github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
   NOTA: Estos resultados del análisis del diagrama de Venn brindan información para elegir las opciones, métodos y réplicas de llamada de picos más apropiados con alta reproducibilidad para el análisis posterior. Es preferible elegir las opciones y métodos de llamada pico que muestren los números pico más altos con buena superposición con otros métodos y opciones de llamada pico.

16. Analizar mapas de calor y gráficos de promedio para visualizar los picos llamados.

1. Abra el terminal y escriba echo $SHELL para comprobar el shell predeterminado en el terminal activo. Si el shell Bash es el shell predeterminado en el terminal actual, puede haber algo como /path/to/bash (por ejemplo, /bin/bash) en el terminal.
2. Si el shell predeterminado no es Bash, establezca Bash shell como shell predeterminado escribiendo chsh -s $(which bash) en el terminal. Si el terminal usa el shell Bash como predeterminado, considere omitir este paso
3. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_27_plotHeatmap_focused.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e ingrese.
   NOTA: Este script está escrito para: (i) Ejecutar la función de punto de referencia computeMatrix utilizando archivos bigWig normalizados y archivos de lecho de picos enfocados para hacer matrices de recuentos de lecturas normalizadas en el centro de los picos enfocados en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/deeptools_computeMatrix . (ii) Ejecute la función plotHeatmap utilizando la matriz de recuentos de lecturas normalizados para generar mapas de calor y gráficos de promedios que visualicen el patrón de distribución de recuentos de lecturas normalizados en las ubicaciones de picos enfocadas. (iii) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotHeatmap) y guarde los archivos de salida de plotHeatmap dentro de esta carpeta. (iv) Anote un archivo de registro log_plotHeatmap_focused.txt en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/plotHeatmap .
4. Escriba ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_27_plotHeatmap_whole.sh en el terminal o arrastre el archivo de script de shell al terminal e introduzca.
   Este script está escrito para: (i) Ejecutar la función de punto de referencia computeMatrix utilizando archivos bigWig normalizados y archivos de lecho de picos completos para hacer matrices de recuentos de lecturas normalizadas en el centro de los picos enteros en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/deeptools_computeMatrix . (ii) Ejecute la función plotHeatmap utilizando la matriz de recuentos de lecturas normalizados para generar mapas de calor y gráficos de promedios que visualicen el patrón de distribución de recuentos de lecturas normalizados en todas las ubicaciones de picos. (iii) Cree una carpeta (~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotHeatmap) y guarde los archivos de salida de plotHeatmap dentro de esta carpeta. (iv) Anote un archivo de registro log_plotHeatmap_whole.txt en la carpeta ~/Desktop/GSE126612/log/plotHeatmap .
5. Una vez finalizado el proceso de ejecución de los scripts de shell, revise los archivos de registro. Si hay algún mensaje de error, corríjalo y vuelva a ejecutar los scripts de shell. Si hay algún problema en el uso de la canalización de análisis de Easy Shells CUTnRUN, pida ayuda en la página web de problemas de Github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
   NOTA: Idealmente, las ubicaciones de las cumbres de los picos MACS2/3 y las ubicaciones de los picos focalizados de los SEACR exhiben una distribución de señal nítida y enfocada en el centro de los gráficos. Sin embargo, si el algoritmo de llamada de picos no funciona correctamente para los datos CUT&RUN, puede aparecer una distribución de señal "ruidosa" menos focalizada en los gráficos. Por lo tanto, el uso del número de picos llamados y los patrones de distribución de la señal de pico de los gráficos de salida guiará la determinación de la validez de pico para análisis CUT&RUN posteriores que incluyan la anotación de pico aguas abajo.

Resultados

La calidad y el recorte del adaptador conservan las lecturas con alta calidad de secuenciación
Las técnicas de secuenciación de alto rendimiento son propensas a generar errores de secuenciación, como "mutaciones" de secuencia en las lecturas. Además, los dímeros del adaptador de secuenciación se pueden enriquecer en conjuntos de datos de secuenciación debido a una mala extracción del adaptador durante la preparación de la biblioteca. Los errores de secuenciación excesivos, como las mutaciones de lectura, la generación de lecturas más cortas de lo necesario para un mapeo adecuado y el enriquecimiento de los dímeros adaptadores, pueden aumentar el tiempo de mapeo de lectura y pueden producir lecturas mapeadas falsas positivas que distorsionan los resultados del análisis bioinformático posterior. Por lo tanto, se requiere un filtrado de calidad y un ajuste del adaptador para retener lecturas de alta calidad para el análisis y la interpretación posteriores.

Para retener lecturas de alta calidad para el análisis, esta canalización de análisis CUT&RUN (Figura 2) emplea FastQC²⁶ y Trim Galore²⁷. El script de shell "Script_03_fastQC.sh" ejecuta FastQC para todos los archivos fastq dentro del directorio de trabajo. Los resultados (Figura 3) de este paso utilizando el conjunto de datos CTCF CUT&RUN disponible públicamente de GSE126612 (SRR8581589) identifican algunas lecturas con bases de puntuación de baja calidad (Figura 3A, C) y algunos grados de desajuste en la distribución de los contenidos de GC por secuencia entre la estimación teórica y las lecturas reales (Figura 3E).

La ejecución del script "Script_04_trimming.sh" para ejecutar Trim Galore elimina con éxito aquellas lecturas con bases de puntuación de baja calidad (por debajo de 20 en la Figura 3A) y cualidades de secuencia medias bajas evidentes antes del recorte (Figura 3B-D). Además, "Script_04_trimming.sh" también elimina con éxito el 55 ~ 60% de enriquecimiento medio del contenido de GC que se muestra en la distribución de GC de 'pre-recorte' en el gráfico de secuencia (Figura 3E, F). Estos resultados demuestran que esta línea de análisis CUT&RUN filtra las lecturas de alta calidad para facilitar un mapeo de lectura rápido y preciso con el genoma de referencia.

La distribución del tamaño de la inserción puede proporcionar una estimación de los resultados máximos de las llamadas
Debido al uso de MNasa en CUT&RUN (Figura 1), se espera que las lecturas mapeadas de CUT&RUN exhiban picos de tamaño de fragmentos de ADN mono- (~200 pb) y di-nucleosomales (~350 pb) dentro de los gráficos de distribución de tamaño de inserción (Figura 4). Los problemas con la detección de algunos objetivos pueden dar lugar a inserciones cortas (< 100 pb) (Figura 4C). El alto nivel de lecturas cortas reduce el número de lecturas que se pueden usar para las llamadas máximas de alta confianza, lo que reduce los números máximos y afecta al análisis posterior. En esta canalización de análisis CUT&RUN, "Script_10_insert-size-analysis.sh" opera la función "picard.jar CollectInsertSizeMetrics" para realizar el análisis de distribución del tamaño de la inserción y exportar histogramas como salida de visualización (Figura 2). En los gráficos de salida (Figura 4A-C), el eje x muestra el rango de tamaño de inserción, el lado izquierdo del eje y y el histograma relleno representa el número de inserciones con el valor en el eje x, y el lado derecho del eje y muestra y la línea discontinua la fracción acumulada de plaquitas con un tamaño de inserción igual o mayor que el valor en el eje x. Por lo tanto, tanto la ubicación en el eje X con el cambio más drástico en la pendiente de la línea discontinua que se cruza con el nivel de máximos en el histograma identifica el tamaño de inserción principal en la muestra. Entre las lecturas mapeadas en el genoma de referencia de interés (humano, hg19), los fragmentos de muestra de H3K27Ac (marca de histonas activas) exhiben la distribución de tamaño de inserto CUT&RUN esperada con el tamaño mononucleosomal más alto y picos de tamaño dinucleosomal detectables (Figura 4B). Los fragmentos de muestra de CTCF mostraron grupos adicionales en regiones de longitud de fragmento de 100 ~ 200 pb (Figura 4A). En conjunto, la canalización de análisis CUT&RUN proporciona scripts de shell fáciles de usar para realizar análisis de distribución de tamaño de inserción después de las lecturas de mapeo en genomas de referencia. Estos análisis se vuelven importantes a la hora de estimar la eficiencia de las llamadas máximas antes del análisis posterior.

La canalización de análisis CUTnRUN de Easy Shells proporciona opciones de filtración y normalización para crear recuentos de lecturas confiables
Uno de los puntos críticos del análisis CUT&RUN es obtener pares de lectura mapeados adecuados mediante el filtrado de pares de lectura problemáticos de las salidas de mapeo iniciales y la normalización de los recuentos de lecturas mapeados filtrados con un método de cálculo de normalización específico que pueda cumplir con los objetivos/necesidades del análisis del usuario. La línea de análisis CUT&RUN discutida en este estudio incluye el script "Script_07_filter-sort-bam.sh" para eliminar pares de lectura que están mapeados en cromosomas no canónicos, regiones de lista negra anotadas públicamente²³ y TA repite regiones^18,22 de pares de lectura que fueron mapeados por bowtie2 usando "Script_06_bowtie2-mapping.sh". Estas filtraciones son necesarias para eliminar los pares de lectura que pueden producir falsos positivos, señales de picos atípicos y picos llamados en el análisis posterior (Figura 5; regiones de caja amarilla).

Además de las filtraciones, la aplicación del método de normalización correcto es un factor importante para visualizar con precisión la diferencia de señal entre las muestras. Por lo tanto, la canalización de análisis CUT&RUN incluye scripts "Script_09_normalization_SFRC.sh" y "Script_09_normalization_SRPMC.sh" para proporcionar dos métodos de normalización verificados públicamente: la lectura fraccional escalada (SFRC)²² y las lecturas normalizadas por millón de picos en el control negativo (SRPMC)^24,25 (Figura 5A-D). Dado que la SFRC no incluye el control (por ejemplo, IgG) ni la muestra de pico en la fórmula, la normalización de la SFRC se puede utilizar para muestras que no incluyen ninguna muestra de control o que se espera que muestren diferencias de señal solo en regiones locales sin diferencia a escala de todo el genoma. Las muestras normalizadas de SFRC procesadas por la tubería de análisis CUT&RUN (Figura 5A-D; pistas rojas) producen los mismos patrones de distribución de señal que las lecturas mapeadas disponibles públicamente de GEO (Figura 5A-D; pistas negras), lo que sugiere que esta tubería puede reproducir los resultados de la publicación.

El método SRPMC es útil para normalizar muestras que incluyen muestras de control y de pico y se espera que muestren una diferencia de señal global entre las muestras (Figura 5A-D; pistas verdes). Dado que una muestra de H3K27Ac (SRR8581599) exhibe una relación mucho más alta "(lecturas reales de CUT&RUN)/(lecturas de pico)" (RPS de muestra; 997) que otras réplicas (237, 175 y 161), las señales relativas de H3K27Ac parecen diferentes entre las réplicas en muestras normalizadas de SFRC y SRPMC (Figura 5A-D; H3K27Ac comparado en todas las pistas). Las muestras de RNAPII-S5P exhiben un RPS de muestra relativamente más bajo (1.7, 0.8, 2.1) que el control de IgG (259), por lo que las muestras de RNAPII-S5P exhiben una señal más baja que el control de IgG después de la normalización de SRPMC (Figura 5A-D; Comparación de RNAPII-S5P en todas las pistas). Por lo tanto, la canalización de análisis CUT&RUN que se analiza aquí recomienda utilizar el método SRPMC solo para las muestras que tienen suficientes lecturas en muestras experimentales en relación con las lecturas de control de IgG y las lecturas de control de pico.

La comparación del diagrama de Venn puede dar ideas para elegir un mejor método y opciones de llamada de picos
Múltiples programas de llamada de picos permiten la identificación de la ocupación de proteínas significativamente enriquecidas en todo el genoma. Los programas empleados para el análisis CUT&RUN incluyen los programas de la familia MACS² y SEACR⁴ como métodos principales hasta el momento. Sin embargo, puede ser un desafío, especialmente para los principiantes en bioinformática, identificar el método de detección de picos más apropiado y las opciones para un proyecto CUT&RUN determinado. Por lo tanto, la canalización de análisis CUT&RUN incluye pasos de análisis del diagrama de Venn para dar a los usuarios la oportunidad de comparar la similitud y la diferencia de los resultados de las llamadas máximas entre varias opciones de llamadas máximas (opciones Script_17_intervene) y programas de llamadas máximas (Script_19_intervene_methods.sh) (Figura 6A-H).

De acuerdo con la comparación, los picos fusionados CTCF, H3K27ac y RNAPII-S5P que se denominan con y sin opción de control de IgG durante el paso de llamada de picos, MACS2 y MACS3 llamaron más picos con la opción de control de IgG (Figura 6A), pero SEACR llamó a más picos sin opción de control de IgG tanto en opciones estrictas como relajadas (Figura 6B-D). Por lo tanto, la canalización de análisis de CUT&RUN sugiere (1) aplicar la opción de control de IgG para MACS2 y MACS3, (2) llamar a los picos para las muestras experimentales de CUT&RUN y las muestras de control de IgG por separado, y luego filtrar los picos de IgG más tarde para el llamador de picos de SEACR. Entre MACS2 y MACS3, MACS3 tuvo un poco más de picos (Figura 6A).

Además, la comparación de los picos llamados por MACS2 y MACS3 con la opción de control de IgG y SEACR sin la opción de control de IgG muestra que los picos de SEACR llamados con la opción estricta se superponen con los picos de MACS 2 y MACS3 más que los picos de SEACR llamados con la opción relajada (Figura 6E, F). Por lo tanto, los resultados de la canalización de análisis CUT&RUN sugieren que la opción estricta maximiza la coherencia de SEACR con las llamadas máximas de MACS. Por último, el diagrama de Venn para comparar la superposición de picos convocados por SEACR con normalización para los archivos bedGraph CUT&RUN readcounts sin procesar y sin normalización para los archivos bedGraph CUT&RUN readcounts normalizados no revela ninguna diferencia entre los métodos SFRC y SRPMC para SEACR con la opción strictent. Los picos de SFRC exhiben números de pico mucho más altos y se superponen mejor con los picos de opciones normalizados ('norma' en la Figura 6) que los picos de SRPMC para SEACR con opciones relajadas (Figura 6G, H).

Comparaciones estadísticas entre réplicas y muestras
Sacar conclusiones precisas a través de múltiples réplicas requiere una evaluación de la similitud de las réplicas. La canalización de análisis CUT&RUN utilizada aquí emplea el cálculo del coeficiente de correlación estadística basado en Deeptools2¹⁵, la agrupación en clústeres de mapas de calor y el análisis de componentes principales (PCA) para facilitar la identificación de muestras y réplicas apropiadas para un análisis posterior válido. El agrupamiento del mapa de calor basado en el coeficiente de correlación de Pearson mostró una correlación estadísticamente significativa entre las réplicas para CTCF, H3K27Ac y RNAPII-S5P en sus regiones pico llamadas (Figura 7A-C). Sin embargo, el PCA mostró que una muestra de CTCF (SRR8581590) y H3K27Ac (SRR8581608) se encuentra relativamente lejos de otras réplicas (Figura 7D) en todas las regiones CTCF, H3K27Ac y RNAPII-S5P llamadas pico.

De acuerdo con el diagrama de Venn para comparar entre picos entre réplicas, los picos de CTCF (SRR8581590) mostraron la menor superposición con otras réplicas en los tres resultados de la llamada máxima (Figura 7E-G), y los picos H3K27Ac (SRR8581608) mostraron la menor superposición con otras réplicas en los resultados de llamadas máximas de SEACR (Figura 7F). los picos H3K27Ac (SRR8581608) no mostraron una superposición mínima con otras réplicas en los resultados de llamada de picos de MACS2 y MACS3 (Figura 7F), lo que puede sugerir que la distancia entre réplicas en PCA no es suficiente para definir una muestra atípica. Por lo tanto, la línea de análisis CUT&RUN propone definir la replicación de valores atípicos como "la muestra que muestra un coeficiente de correlación de Pearson bajo en el grupo de agrupamiento de mapas de calor, una larga distancia en el gráfico de PCA con otras réplicas y una superposición de picos más baja entre las réplicas".

La llamada de picos facilita la visualización e interpretación de los datos de CUT&RUN
La línea de análisis de CUT&RUN detallada en este estudio emplea dos tipos de llamadas máximas disponibles públicamente: la familia MACS y SEACR. Para optimizar la visualización de los picos llamados, esta canalización selecciona el intervalo de señal más alto como centro de picos para los análisis de mapas de calor y metagráficos. Todos los picos CTCF, H3K27Ac y RNAPII-S5P llamados por los llamadores de picos MACS3 y SEACR mostraron un patrón de distribución de picos más nítido en el centro de los intervalos de señal más altos (Figura 8A-F, gráficos 'enfocados') que en el centro de regiones de picos completas (Figura 8A-F, gráficos 'completos'). Las muestras CUT&RUN procesadas por la tubería de análisis CUTnRUN de Easy Shells con normalización SFRC (Figura 8 A-F, gráficos 'SFRC') exhiben patrones de distribución de señal similares a los de las muestras normalizadas SFRC de las cuales los pares de lectura mapeados sin procesar están disponibles públicamente en GEO (Figura 8A-F, gráficos 'públicos') en los picos llamados por la tubería de análisis. Por lo tanto, el canal de análisis CUT&RUN puede reproducir con éxito los resultados de la publicación.

Figura 1: Esquema del procedimiento experimental CUT&RUN. CUT&RUN es un enfoque basado en enzimas para detectar las interacciones proteína-ADN en todo el genoma. El procedimiento CUT&RUN comienza con la unión de las células (o núcleos aislados) a la concanavalina A conjugada con perlas magnéticas para permitir el aislamiento y la manipulación de números bajos de células durante todo el procedimiento. Las células aisladas se permeabilizan utilizando un detergente suave para facilitar la introducción de un anticuerpo que se dirige a la proteína de interés. A continuación, la nucleasa microcócica (MNasa) unida a la proteína A o a la proteína A/G se introduce en la célula permeabilizada. La pA-MNasa (o pAG-MNasa) se recluta para el anticuerpo unido mediante una etiqueta de proteína A o proteína A/G. Una vez que la MNasa se localiza en los sitios objetivo, la nucleasa se activa brevemente mediante la introducción de calcio para digerir el ADN alrededor de la proteína objetivo. La digestión de MNasa da lugar a complejos mononucleosomales de ADN-proteína. Posteriormente, el calcio se quela para finalizar la reacción de digestión, y los fragmentos cortos de ADN de la digestión de la MNasa se liberan de los núcleos mediante una incubación corta a 37 °C, y luego se someten a purificación de ADN, preparación de bibliotecas y secuenciación de alto rendimiento¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resumen esquemático de la canalización de análisis CUT&RUN de Easy-Shell. La canalización de análisis CUT&RUN de Easy-Shell está diseñada en tres secciones principales: (1) control de calidad y mapeo de archivos de lectura sin procesar (izquierda; morado), (2) normalización de lecturas mapeadas y recuentos de lecturas y llamadas máximas (centro; verde), y (3) validación de lecturas mapeadas y picos llamados (derecha; rosa). En cada paso, se proporciona el número de script de shell correspondiente, una breve descripción y la herramienta de programa utilizada en ese paso (entre paréntesis). Las flechas de Plaine muestran flujos directos entre pasos. Esta canalización de análisis CUT&RUN proporciona dos métodos de normalización de lecturas que pueden satisfacer las necesidades de los usuarios con y sin lecturas de control, procesos de validación multicapa para identificar réplicas adecuadas para el análisis posterior e identificación de picos enfocados para la creación de resultados de mapas de calor y metagráficos bien enfocados. Este canal de análisis está escrito en scripts de shells fáciles de usar de manera paso a paso para proporcionar a los principiantes en bioinformática la oportunidad de aprender y practicar el análisis básico de datos de CUT&RUN mediante la lectura y edición de los propios scripts. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación de los resultados del control de calidad antes y después del recorte de calidad. Las salidas del informe de control de calidad seleccionadas de FastQC muestran el efecto del recorte de calidad mediante lecturas de SRR8581589 (GSM3609748, CTCF). Los resultados que se muestran incluyen: (A) Puntuación de calidad en las bases antes del recorte. (B) La misma lectura que A) después del recorte. (C) Distribución de la puntuación de calidad en todas las secuencias antes del recorte. (D) La misma lectura que C) después del recorte. (E) Distribución de GC en todas las secuencias antes del recorte. (F) La misma lectura que E) después del recorte. La puntuación de calidad mínima en cada posición dentro de las lecturas de secuenciación (A, B) y la calidad media mínima de la secuencia (C, D) aumentan después del recorte de calidad. Además, este paso puede reducir la diferencia entre la distribución teórica de los recuentos de GC y el recuento real de GC por base en las lecturas (E, F) al eliminar los pares de lecturas que tienen una alta tasa de discrepancia de bases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de la distribución del tamaño de la plaquita. Histograma del tamaño del inserto para (A) CTCF, (B) H3K27Ac, y (C) serina 5 ARN polimerasa II fosforilada (RNAPII-S5P). Los histogramas muestran diferencias relativas en la distribución del tamaño de la plaquita entre las muestras. La línea discontinua en el histograma representa la fracción acumulada de lecturas con un tamaño de inserción mayor o igual que el valor en el eje x. n: número de lecturas únicas asignadas concordantemente por muestra después de la filtración. FR: fragmentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Vista general panorámica de las muestras de CUT&RUN. Las lecturas mapeadas de CUT&RUN disponibles públicamente normalizadas por el conteo fraccional escalado (SFRC) sin filtración adicional (pistas negras), las muestras de CUT&RUN procesadas por la tubería de análisis CUTnRUN de Easy Shells con normalización de SFRC (pistas rojas) y las lecturas mapeadas normalizadas de picos por millón en el control negativo (SRPMC; pistas verdes)' se muestran en (A) región del grupo de genes histonas, y (B-D) otras tres regiones con picos CTCF, H3K27Ac y RNAPII-S5P llamados por todos los llamadores de picos MACS2, MACS3 y SEACR. Los recuadros amarillos resaltan la ubicación de las señales de pico filtradas durante el paso de filtración en la canalización de análisis CUTnRUN de Easy Shells. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Diagrama de Venn para comparar entre los picos llamados por diferentes llamadas de pico y las opciones de llamada de pico. (A) Comparación entre los picos llamados por MACS2 y MACS3 con y sin opción de entrada IgG durante la llamada de pico. (B-D) Comparación entre picos llamados por SEACR con y sin opción de entrada IgG, opciones 'estrictas' y 'relajadas', y con opción de normalización usando archivos de pares de lectura sin procesar (B), sin opción de normalización usando archivos de recuentos de lecturas normalizados SFRC (C) o archivos de recuentos de lecturas normalizados SRPMC (D). (E,F) Comparación entre los picos llamados por MACS2, MACS3 con opción de entrada IgG y SEACR con opción estricta (E) o relajada (F). (G,H) Comparación entre picos llamados por SEACR sin opción de entrada de IgG y con opciones estrictas (G) o relajadas (H). con IgG: picos llamados con la opción de entrada de IgG. sin IgG: picos llamados sin la opción de entrada de IgG. norma: picos llamados con la opción de normalización. non: picos llamados sin la opción de normalización. SFRC: picos llamados por archivos de recuentos de lecturas normalizados por el método de 'conteo fraccional escalado (SFRC)'. SRPMC: picos llamados por los archivos readcounts normalizados por el método 'Spike-in normalized Reads Per Million mapped reads in the negative Control (SRPMC)'. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Correlación de Pearson, análisis de componentes principales y diagrama de Venn para validar la similitud entre réplicas. (A-C) La agrupación de mapas de calor con valores de coeficiente de correlación de Pearson muestra el grado de similitud entre las réplicas en los picos llamados por MACS2 (A), MACS3 (B) y SEACR (C). El coeficiente de correlación de Pearson se encuentra en un valor entre -1 y 1. Un valor más alto del coeficiente de correlación de Pearson absoluto indica una correlación más fuerte entre dos variables, y un valor positivo del coeficiente de correlación de Pearson indica una correlación positiva, donde las dos variables se mueven en la misma dirección. Por lo tanto, las muestras con mayor similitud exhiben un pedigrí más cercano en el agrupamiento de mapas de calor y un valor de coeficiente de Pearson más alto. (D) El análisis de componentes principales (PCA) muestra el grado de similitud entre las réplicas y las muestras en todas las regiones de pico CTCF, H3K27Ac y RNAPII-S5P que son llamadas por MACS2 (izquierda), MACS3 (centro) y SEACR (derecha). Las muestras con mayor similitud se colocan más juntas en la gráfica PCA. (E-G) Análisis de diagrama de Venn para comparar los picos encontrados en cada réplica por MACS2 (E), MACS3 (F) y SEACR (G). La línea de análisis CUT&RUN de Easy-Shell propuso aplicar los tres métodos para identificar réplicas con alta similitud que pueden ser adecuadas para fusionar los picos llamados para el análisis posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Visualización de mapa de calor y metagráficos de la distribución de la señal en los picos. El mapa de calor y los metagráficos muestran la distribución del enriquecimiento alrededor de los centros de picos llamados mediante diferentes llamadores de picos. (A,B) Picos de CTCF CUT&RUN llamados desde una réplica (SRR8581589) por MACS3 (A) y SEACR (B). (C,D) Picos de H3K27Ac CUT&RUN llamados desde una réplica (SRR8581607) utilizando MACS3 (C) y SEACR (D). (E,F) Picos RNAPII CUT&RUN llamados desde una réplica (SRR8581589) por MACS3 (E) y SEACR (F). Los pares de lectura mapeados disponibles públicamente ('Público' en la Figura 8) y los fragmentos mapeados por la canalización de análisis CUTnRUN de Easy Shells ('SFRC' en la Figura 8) se comparan después de la normalización del 'conteo fraccional escalado (SFRC)'. Los picos son llamados por MACS3 con la opción de entrada de IgG ('MACS3 w/ IgG' en la Figura 8) y SEACR sin entrada de IgG y sin opción de normalización utilizando archivos de recuentos de lecturas normalizados SFRC en modo estricto ('SEACR sin IgG no SFRC estricto' en la Figura 8). Se preparan dos versiones de los archivos de coordenadas de los picos llamados: desde el inicio hasta el final de los picos llamados ('completos' en la Figura 8) y la ubicación del bin con la señal más alta dentro de los picos llamados (cumbres en MACS3 llamadas picos; 'enfocado' en la Figura 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Información sobre los archivos fastq de CUT&RUN en GSE126612. Todos los archivos fastq de lecturas sin procesar que se incluyen en GSE126612 y se seleccionan como conjunto de datos de ejemplo para la canalización de análisis CUTnRUN de Easy Shells se enumeran como una tabla. La columna 'Nombre de archivo' muestra los nombres de los archivos sin procesar que CUT & RUN lee los archivos fastq que se mostrarán en '~/Desktop/GSE126612/fastq' después de ejecutar 'Script_02_download-fastq.sh'. 'md5sum' comparte MD5 (Message-Digest Algorithm 5) para el conjunto de datos de ejemplo, que se puede utilizar para verificar la integridad de los archivos después de descargar el conjunto de datos mediante la ejecución de 'Script_02_download-fastq.sh'. La última columna describe el objetivo de CUT&RUN para cada muestra. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

La capacidad de mapear la ocupación de proteínas en la cromatina es fundamental para realizar estudios mecanicistas en el campo de la biología de la cromatina. A medida que los laboratorios adoptan nuevas técnicas de laboratorio húmedo para perfilar la cromatina, la capacidad de analizar los datos de secuenciación de esos experimentos de laboratorio húmedo se convierte en un cuello de botella común para los científicos de laboratorio húmedo. Por lo tanto, describimos un protocolo introductorio paso a paso para permitir que los principiantes en bioinformática superen el cuello de botella del análisis e inicien el análisis y las comprobaciones de control de calidad de sus propios datos de secuenciación CUT&RUN.

Este protocolo de análisis CUT&RUN describe la aplicación de varios pasos para garantizar que se cuantifiquen las señales de buena fe. La eliminación de lecturas de mala calidad y secuencias de adaptador de los datos de lectura sin procesar es uno de los primeros pasos de control de calidad y uno de los pasos más críticos para obtener resultados de análisis precisos. Por lo tanto, esta línea de análisis incluye pasos de recorte de calidad y adaptador fáciles de aplicar utilizando el programa Trim-galore²⁷. Debido a la importancia de este proceso, este proceso de análisis incluye pasos para comparar la calidad de los resultados antes (paso 4.3) y después (paso 5.3) del proceso de recorte (paso 5.5). Además del recorte de la calidad y el adaptador, esta canalización de análisis también elimina las lecturas de cromosomas no canónicos, las regiones de repetición de TA y las regiones de la lista negra, que pueden introducir sesgos de contenido de GC y picos de falsos positivos. Estos pasos de filtración proporcionan una vía introductoria adecuada para que los principiantes en bioinformática comprendan los pasos críticos del control de calidad para el análisis de datos de CUT&RUN.

Después del paso de filtración, esta canalización de análisis CUT&RUN proporciona dos opciones de normalización: 'recuento de lecturas fraccional escalado (SFRC)²²' y 'Lecturas normalizadas por millón de picos en lecturas mapeadas en el control negativo (SRPMC)^24,25 para crear archivos de entrada para la llamada y visualización de picos descendentes. Si se espera que el conjunto de datos CUT&RUN revele diferencias locales solo sin diferencias de señal en todo el genoma entre las muestras, el recuento de lectura fraccionado a escala (la fracción de los recuentos por el tamaño del gnoma de referencia) puede ser suficiente para el análisis posterior. Sin embargo, si existe la posibilidad de que haya diferencias de señal a escala global entre las muestras de CUT&RUN, los usuarios pueden elegir el método SRPMC que considera la proporción de lecturas entre el pico y la muestra (tanto las muestras experimentales de CUT&RUN como las de control negativo) junto con la normalización de lecturas por millón (RPM) para lecturas de control negativo para hacer que las lecturas de control negativo sean comparables entre diferentes muestras. Dado que el SRPMC proporciona lecturas normalizadas en relación con las lecturas de control negativo normalizadas, este enfoque minimiza la señal de control negativo y permite la comparación entre conjuntos de datos creados en diferentes lotes y grupos.

Un factor importante en la detección de picos de muestras de CUT&RUN es la eliminación de los falsos positivos de picos de CUT&RUN durante el análisis in silico , en parte, mediante la inclusión de muestras de IgG. En concreto, esta canalización de análisis proporciona enfoques de llamadas máximas para diferentes llamadores máximos para descartar los picos de llamadas CUT&RUN falsos positivos. En el caso de las llamadas máximas de MACS2/3, nuestra canalización de análisis aplica lecturas simuladas de IgG como muestra de entrada durante las llamadas máximas. En el caso de SEACR, este proceso de análisis recomienda llamar primero a los picos de las muestras experimentales y a las muestras de control negativo de forma independiente y, a continuación, eliminar los picos que se superponen entre las muestras experimentales y las muestras de control negativos, ya que el SEACR puede "perder" la mayoría de los picos si se le proporciona el control negativo durante la llamada de los picos de las muestras experimentales. Los picos seleccionados exhiben una similitud comparable entre los diferentes llamadores de picos y réplicas (Figura 5). En conjunto, la eliminación de los cromosomas no canónicos de mala calidad, la región de la lista negra y las lecturas repetidas de TA, el recorte de las secuencias de adaptadores, la normalización del ADN de picos y el manejo adecuado del control negativo durante los pasos de llamadas máximas proporciona a los usuarios archivos de recuentos de lecturas adecuados que son adecuados para los análisis posteriores. Con archivos de lectura normalizados de alta calidad y picos llamados seleccionados, los usuarios pueden proceder a comparar la similitud entre réplicas y crear mapas de calor y metagráficos con una señal de fondo ultra limpia para validar la llamada de picos efectiva.

Los picos de llamada con lecturas de alta calidad marcan el inicio de la extracción de interpretaciones biológicas a partir de los datos de CUT&RUN. Este protocolo describe la obtención de señales de pico enfocadas en mapas de calor y metagráficos mediante el designamiento de la señal más alta o las ubicaciones de señal estadísticamente más significativas como centros de pico. Algunos enfoques de llamadas pico no seleccionan las señales más altas o las señales estadísticamente significativas en su ubicación central. Por lo tanto, redefinir el centro de cada pico como la señal más alta o la ubicación de la señal estadísticamente más significativa sirve como un paso importante para crear salidas de datos visuales con señales bien enfocadas en el centro de los gráficos. Los archivos de lecho de los picos llamados originales se conservan para realizar la anotación de picos y el análisis de relevancia funcional como próximos pasos después de completar los pasos descritos en este protocolo.

Aunque este proceso de análisis de CUT&RUN incluye pasos para describir la instalación de los programas necesarios, los principiantes en bioinformática pueden encontrar dificultades para instalar las herramientas de análisis. Por lo tanto, se ha establecido una página de problemas de Github asociada para proporcionar descripciones paso a paso más detalladas para la instalación del programa y para facilitar las comunicaciones con los usuarios de soporte durante la instalación del programa en su propio sistema. Los próximos pasos en la canalización de análisis de CUT&RUN más allá del protocolo descrito en este artículo incluyen la anotación de picos, la identificación de superposiciones entre diferentes tipos de picos llamados y la anotación funcional para los picos llamados. La finalización de los pasos de control de calidad y la llamada de picos descritos en este protocolo, combinados con la anotación de picos posteriores, permitirá a los usuarios extraer un significado biológico de sus datos CUT&RUN.

Este canal de análisis de CUT&RUN se ha creado para proporcionar directrices introductorias generales paso a paso para el análisis masivo de CUT&RUN. Este oleoducto posee algunas limitaciones. En primer lugar, aunque esta canalización de análisis intenta manejar el efecto impulsado por la variación del contenido de GC mediante el filtrado de lecturas en regiones de lista negra (que incluyen "regiones de artefactos de alta señal" y "regiones de repetición de artefactos" y regiones de repetición de TA), este enfoque puede no ser suficiente para algunos organismos que pueden tener un contenido distintivo de GC en su genoma. Por lo tanto, si a los usuarios les preocupa cualquier sesgo basado en el contenido de GC, considere la posibilidad de agregar otro paso para corregir las lecturas asignadas. Para los principiantes en bioinformática, 'computeGCBias' y 'correctGCBias' en Deeptools pueden ser opciones para este objetivo. En segundo lugar, esta canalización de análisis maneja lecturas de tamaño de inserción regular (100 pb-1 kb) y de tamaño de inserción pequeña (< 100 pb), que pueden ser las lecturas reales de algunas proteínas asociadas a la cromatina, dentro del mismo archivo. Dado que esta canalización de análisis se escribe en scripts de shell, los usuarios pueden modificar "Script_08_bam-to-BEDPE-BED-bedGraph.sh" para capturar las lecturas cortas del tamaño de inserción por separado de las lecturas de tamaño de fragmento normales durante el paso de generación del archivo de cama de lecturas asignadas. Posteriormente, el archivo de cama de lecturas de tamaño de inserción corto se puede normalizar independientemente de las lecturas asignadas de tamaño de inserción regulares para minimizar el efecto de reducción de tamaño. En tercer lugar, para reducir la complejidad de la canalización de análisis, Easy Shells CUTnRUN no incluye un paso de muestreo descendente para que coincida con la profundidad de secuenciación de las muestras CUT&RUN. Sin embargo, los usuarios pueden aplicar un paso de muestreo descendente después de filtrar archivos bam mediante samtools view²⁸ o PositionBasedDownsampleSam (Picard)²⁹.

Todos los pasos de análisis de este protocolo están escritos en scripts de shell para permitir que los principiantes en bioinformática aprendan los conceptos básicos del análisis CUT&RUN mediante la revisión de los scripts. Esperamos que los usuarios puedan practicar el análisis bioinformático paso a paso ejecutando cada script de shell secuencialmente en el terminal. Además, la simplicidad de los scripts de shell proporcionados en esta canalización de análisis de CUT&RUN permite a los usuarios revisar y personalizar estos scripts para aplicar esta canalización de análisis a sus propios datos de CUT&RUN. En última instancia, esperamos que esta línea de análisis de CUT&RUN pueda reducir los cuellos de botella comunes en el proceso de análisis de datos de CUT&RUN para permitir que los investigadores de laboratorio húmedo y los principiantes en bioinformática saquen conclusiones biológicas de sus propios datos de secuenciación de CUT&RUN.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software para comprimir y convertir recuentos de lecturas bedGraph a bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ la U. de Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software para procesar archivos bam/bed/bedGraph
bowtie2 2.5.4	Universidad	Johns Hopkinshttps://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software para crear el índice de pajarita y realizar la alineación
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software para realizar análisis de distribución de tamaño de plaquita
Software Cutadapt	NBIS		https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html para realizar el recorte de adaptadores
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software para realizar análisis de correlación de coeficiente de Pearson, análisis de componentes principales y análisis de mapas de calor/gráficos promedio
FastQC versión 0.12.0	Babraham Bioinformatics		https://github.com/s-andrews/FastQC Software para verificar la calidad del archivo fastq
Interventionv0.6.1	Biología Computacional & Regulación génica - Grupo Mathelier	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software para realizar análisis de diagramas de Venn utilizando archivos
de picos MACSv2.2.9.1	Iniciativa de Chan Zuckerberg	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software para llamar picos
MACSv3.0.2	Iniciativa de Chan Zuckerberg	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software para llamar picos
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute		https://github.com/samtools/samtools Software para procesar archivos sam/bam
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial Institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software para llamar a los picos
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI		https://github.com/ncbi/sra-tools Software para descargar SRR de GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software para realizar un recorte de calidad y precisión