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Artículo de método

Método para estudiar el metabolismo en células linfoides utilizando la química para medir la incorporación de puromicina por citometría de flujo

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DOI:

10.3791/67377

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15 de agosto de 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

En este artículo

Resumen

El protocolo muestra un método basado en citometría de flujo que utiliza la química para estudiar el metabolismo energético en las células.

Resumen

Tras la estimulación del antígeno, las células T vírgenes experimentan una rápida proliferación y expansión a células T efectoras. El metabolismo juega un papel importante en la generación de biomasa necesaria para estas células que proliferan rápidamente y para la generación de moléculas necesarias para la diferenciación y función de las células T efectoras, que influyen en el resultado de la respuesta inmune adaptativa en infecciones o cánceres. Las células T vírgenes reprograman su metabolismo tras la estimulación antigénica para aumentar la generación de ATP, que es necesario para apoyar su crecimiento, biosíntesis y funciones efectoras. El ATP puede generarse en una célula por la vía de fosforilación mitocondrial-oxidativa (OXPHOS) o por la vía glucolítica. Debido a que la mayor parte del ATP generado en una célula en crecimiento y en división se utiliza para la síntesis de proteínas, la síntesis de proteínas se ha utilizado como sustituto de los niveles de ATP. La síntesis de proteínas se puede medir mediante la incorporación de puromicina, que imita la adenosina 3 'de un ARNt cargado con una tirosina modificada y conduce a la terminación espontánea de la traducción de proteínas. Los inhibidores metabólicos como la 2-desoxiglucosa (2DG), que bloquea la vía glucolítica, y la oligomicina (O), que bloquea el complejo 5 de la cadena de transporte de electrones (ETC), se pueden utilizar para estudiar las dependencias de la generación celular de ATP en estas dos vías junto con la evaluación de la síntesis de proteínas en un método llamado SCENITH. Describimos aquí una variación de este método que detecta la incorporación de puromicina por citometría de flujo utilizando química. Este método de estudio del metabolismo es relativamente fácil y se puede utilizar para evaluar poblaciones de células raras, así como muestras de pacientes, mediante citometría de flujo.

Introducción

En los últimos años, ha habido una creciente apreciación del importante papel del metabolismo en la regulación de las células T. El metabolismo celular regula muchas funciones críticas en los linfocitos, incluida la expansión clonal de células T específicas de patógenos y su diferenciación en subconjuntos de células efectoras, que sintetizan una variedad de moléculas efectoras, incluidas las citocinas inflamatorias y las granzimas citolíticas necesarias para matar patógenos1. Por lo tanto, el estudio del metabolismo de las células T es importante tanto para evaluar la función normal de las células T como para el desarrollo de posibles terapias.

Las células T vírgenes son metabólicamente quiescentes y dependen del metabolismo catabólico y la fosforilación oxidativa (OXPHOS) para sus necesidades energéticas 1,2. Tras la activación del receptor de células T (TCR), las células T se someten a una rápida reprogramación metabólica impulsada en parte por la regulación positiva de los transportadores de nutrientes en la superficie de las células, que aumentan la absorción de glucosa y múltiples aminoácidos, incluida la glutamina, del medio ambiente. Estos componentes básicos de nutrientes se utilizan en vías anabólicas para producir macromoléculas que contribuyen al crecimiento celular y respaldan las mayores demandas de energía asociadas con el aumento del crecimiento y la división celular 1,2,3. La reprogramación metabólica en las células T activadas hace que las células sean más dependientes de la glucólisis aeróbica y la glutaminolisis para sus necesidades energéticas 1,2,3. Tras la estimulación de TCR, la absorción de nutrientes también juega un papel fundamental en la activación de las vías moleculares posteriores3. Por ejemplo, la absorción de aminoácidos y el aumento de la concentración local de aminoácidos activan la señalización de mTORC14. Por el contrario, la reducción de la disponibilidad de aminoácidos intracelulares disminuye la vía de señalizaciónmTORC1 2,3,5,6,7. Por lo tanto, el metabolismo y la función celular están estrechamente vinculados en una célula T efectora.

El gran aumento de biomasa requerido para que las células T se dividan rápidamente requiere la regulación positiva de la síntesis / traducción de proteínas8. La síntesis de proteínas se puede cuantificar en una célula estudiando la incorporación de puromicina9, un imitador de tirosil-ARNt que bloquea la traducción incorporando, marcando y liberando cadenas polipeptídicas alargadas de la traducción de ribosomas9. La traducción de proteínas es un proceso altamente dependiente de la energía; de hecho, la mayor parte del ATP generado en las células en crecimiento y en división se utiliza para la síntesis de proteínas. Por lo tanto, la síntesis de proteínas se ha utilizado como una medida sustituta del ATP10 celular. Para generar ATP, las células comúnmente dependen de la glucólisis y / o la vía mitocondrial OXPHOS11. La glucólisis genera dos moléculas de ATP por molécula de glucosa. La vía OXPHOS genera 36 ATP por glucosa12,13, pero la glucólisis puede generar ATP más rápido14. Por lo tanto, las células T activadas que se dividen rápidamente, como las células cancerosas, dependen en gran medida de la vía glucolítica para la generación de ATP.

La dependencia de una célula de cada vía metabólica se puede estudiar mediante el uso de inhibidores específicos. El inhibidor de la vía glucolítica 2-desoxiglucosa (2-DG), que es un análogo de la glucosa, actúa como un inhibidor competitivo de la enzima glucolítica hexoquinasa15. La 2-DG es fosforilada a 2DG-fosfato (2DG-P) por la hexoquinasa. La 2DG-P no puede ser metabolizada por la fosfohexosa isomerasa, que normalmente convierte la glucosa-6-fosfato (G-6-P) en fructosa-6-fosfato16. Por lo tanto, la 2DG-P queda atrapada y se acumula en las células, lo que lleva a la inhibición de la glucólisis y al agotamiento del ATP celular, bloqueando así la síntesis de proteínas17. De manera similar, la dependencia de las células de la vía mitocondrial OXPHOS se puede estudiar utilizando oligomicina, que se une al canal de protones de la ATP sintasa de la cadena de transporte de electrones (ETC)18, bloqueando así la síntesis de ATP mitocondrial (Figura 1). El uso de estos inhibidores junto con una evaluación de la síntesis de proteínas puede proporcionar una imagen del estado metabólico de las células y se ha utilizado en un poderoso método unicelular conocido como SCENITH que evalúa la incorporación de puromicina mediante citometría de flujo10. Sin embargo, la disponibilidad de reactivos SCENITH puede ser limitante. Otras técnicas comúnmente utilizadas para evaluar la glucólisis y OXPHOS incluyen análisis de flujo extracelular Seahorse, que requieren un mayor número de células, lo que puede no ser experimentalmente factible. En este artículo, describimos un método alternativo para evaluar la incorporación de puromicina utilizando un reactivo químico Click-it disponible comercialmente. La facilidad de este método permite una evaluación rápida del estado metabólico de los linfocitos, incluidas las poblaciones de células raras y las muestras de pacientes.

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Protocolo

La cría de animales y los experimentos se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado G98-3 por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano, NIH, y el protocolo aprobado LISB 22E por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, NIH. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57Bl / 6J de 6 a 12 semanas, criados y alojados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF). Se obtuvieron resultados similares con ratones hembras. La sangre entera humana se obtuvo del Banco de Sangre de los NIH bajo el protocolo 99-CC-0168 aprobado por el Centro Clínico de los NIH Recolección y distribución de componentes sanguíneos de donantes sanos para uso en investigación in vitro. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

1. Aislamiento y cultivo de células T CD4+ sin tratamiento previo en ratones

  1. Purifique las células T CD4+ vírgenes mediante selección negativa a partir de suspensiones unicelulares agrupadas de bazo de ratón o ganglios linfáticos de ratones machos de 6 a 12 semanas de edad utilizando un sistema de separación celular magnética de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  2. Células de cultivo (como se describe a continuación) en medios IMDM que contienen dipéptido L-alanil-L-glutamina y suplementado con suero fetal bovino al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 U/mL y 2-β-mercaptoetanol 0,05 mM.
  3. Cocultivar células T CD4 sin tratamiento previo en una proporción de 1:8 con esplenocitos sin agotamiento de T tratados con mitomicina-C (descritos a continuación) como APC en placas de 48 pocillos bajo condiciones no polarizadas (1 μg/ml de anti-CD3 [clon 2C11] y 3 μg/ml de anti-CD28 [clon 37.51]) y Th0 (1 μg/ml de anti-CD3, 3 μg/ml de anti-CD28, 10 μg/ml de anti-IFNg [clon XMG1.2], anti-IL-12 [clon C17.8] y anti-IL-4 [clon 11B11]) durante 72 h a 37 °C. Configurar cultivos utilizando 1 x 106 APC y 0,13 x 106 células T CD4 vírgenes por pocillo de una placa de 48 pocillos (Tabla de materiales)
  4. Generación de esplenocitos con agotamiento de T tratados con mitomicina-C como APC: en resumen, tiña una suspensión unicelular del bazo de ratón con anticuerpos CD4 y CD8 conjugados con FITC. Posteriormente, etiquete las células magnéticamente con Microperlas Anti-FITC (ver Tabla de Materiales). Luego, utilizando un sistema de separación magnética de células de acuerdo con el protocolo del fabricante, seleccione negativamente las APC de las células T. A continuación, trate las APC con 50 μg/ml de mitomicina C durante 40 min a 37 °C en la incubadora, seguido de un lavado 3 veces con 1 PBS.

2. Aislamiento y cultivo de PBMC humanos

  1. Aísle las PBMC de sangre total utilizando medios de separación de linfocitos y de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la tabla de materiales).
  2. Cultivo de PBMC en medios RPMI suplementados con L-glutamina 2 mM, HEPES 0,01 M, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina y estreptomicina 100 U/mL, 2-β-mercaptoetanol 0,05 mM y suero humano al 5%.
  3. Cultivo 1 x 106 PBMC por pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U con 5 μg/mL de fitohemaglutinina-L (PHA-L) durante 18-24 h a 37 °C.

3. Ensayo metabólico

NOTA: Es importante mantener todas las células, inhibidores [oligomicina (O), 2-desoxiglucosa (2-DG), DMSO (Co)] y reactivo O-propargil-puromicina (OPP) lo más cerca posible de 37 °C. Extraiga las células, los inhibidores y el reactivo de OPP en placas 96 con fondo en U y deje las placas en una incubadora a 37 °C tanto como sea posible. Inhibidores de alícuotas 2-DG y O en volúmenes más pequeños para evitar múltiples congelaciones-descongelaciones.

  1. Hacer una solución madre de 2 M (20x) de 2-DG y una solución madre de 40 μM (40x) de O. Para OPP, diluya 1 μL de OPP en 49 μL de medio para que la concentración sea de 400 μM, esta será la solución madre 20x.
  2. Asegúrese de que todos los demás componentes del kit de síntesis de proteínas OPP (consulte la tabla de materiales) estén a temperatura ambiente (RT), antes de comenzar el experimento.
  3. Prepare 1x tampón de reacción OPP diluyendo una alícuota de la botella del componente C 1:10 con agua desionizada. Después de su uso, almacene la solución 1x restante a 2-8 °C.
  4. Siembre 0,1-2 x 106 células por pocillo de placa de 96 pocillos de fondo redondo para cada condición (Co / DG / O / DGO) en 100 μL de IMDM completo (para células T CD4 de ratón) o RPMI completo (para PBMC humanos) o cualquier medio completo de su elección. Mantenga la placa en la incubadora tanto como sea posible.
  5. Añadir 1x inhibidores de soluciones madre (5 μL de 20x DG, Co), (2,5 μL de 40x O) e incubar durante 15 min a 37 °C, 5% CO2. Las concentraciones finales en las células son 100 mM DG y 1 μM O. Mezcle los inhibidores con las células cuidadosamente con una pipeta. Para mayor facilidad, extraiga los inhibidores en una placa de 96 pocillos y agregue células a los inhibidores y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
  6. En la muestra de DGO, añadir 1x de DG (5 μL), mezclar cuidadosamente con una pipeta e incubar durante 10 min a 37 °C, 5% CO2. A continuación, añadir 1x O (2,5 μL), pipetear un par de veces e incubar durante 5 min a 37 °C, 5% CO2.
  7. Sin lavar los inhibidores, agregue 5 μL de OPP de la solución madre 20x (400 μM) a cada muestra para que la concentración sea de 20 μM en las células, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces e incube 30 min a 37 °C, 5% CO2. Para mayor facilidad, alícuota OPP en una placa de 96 pocillos, agregue células con inhibidores al reactivo OPP y mezcle bien.
    NOTA: Para células menos activas metabólicamente y células aisladas directamente ex vivo, aumente el tiempo de incubación después de la adición de OPP. El tiempo de incubación con OPP debe estandarizarse para cada tipo de célula.
  8. Después de la incubación con OPP, agregue 100-150 μL de tampón FACS helado (2% FBS y 1 mM EDTA en 1x PBS). Centrifugar a 750 x g durante 2 min a 4°C. Deseche el sobrenadante y repita el paso de lavado.
  9. Tiña las células con marcadores de superficie apropiados, anticuerpo CD4 anti-ratón (utilizado con una dilución de 1/200) o anticuerpo anti-CD4 humano (utilizado con una dilución de 1/50), reactivo vivo/muerto (utilizado con una dilución de 1/600), en presencia de Fc Block (utilizado con una dilución de 1/200). Incubar durante 25-30 min a 4 °C en la oscuridad.
  10. Lave la placa con 150-200 μl de tampón FACS y centrifugue a 750 x g durante 2 min a 4 °C. Mueva suavemente la placa para desechar el sobrenadante, luego repita el paso de lavado. En esta etapa, las células se tiñen en la superficie.
  11. Vuelva a suspender las células en PFA al 1% en PBS, mezcle bien e incube durante 10-15 min a 4 °C. Protéjalo de la luz.
  12. Lavar con tampón FACS y centrifugar a 750 x g durante 2 min a 4 °C, y repetir el lavado.
  13. Vuelva a suspender el sedimento celular en 200 μL de tampón de permeabilización de saponina frío 1x (0,1% (p.t/vol) Saponina + 3% FBS en 1x PBS). Incubar a temperatura ambiente, protegido de la luz durante 5-15 min. Las células están fijas y permeabilizadas en este momento.
  14. Prepare 1x aditivo tampón de reacción OPP (Componente E) diluyendo la solución 10x 1:10 en agua desionizada. Prepare esta solución fresca y utilícela el mismo día.
  15. Prepare el cóctel de reacción OPP de acuerdo con la Tabla 1. Use el cóctel de reacción dentro de los 15 minutos posteriores a la preparación.
  16. Centrifugar las muestras del paso 3.13 a 750 x g durante 2 min. Deseche el sobrenadante. Lave las células 2 veces con 200 μL de 1x tampón de permeabilización de saponina. Gira y desecha el sobrenadante.
  17. Agregue 50-100 μL de cóctel de reacción OPP (preparado en el paso 3.12) a cada pocillo y mezcle bien. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. A continuación, centrifugar las placas a 750 x g o 2 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
  18. Vuelva a suspender el sedimento en 200 μl de 1x tampón de permeabilización de saponina y centrifugar muestras a 750 x g durante 2 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
  19. Vuelva a suspender en 50 μL de tampón de enjuague de reacción (componente F) por pocillo y centrifugar a 750 x g durante 2 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células teñidas en 200 μL de tampón FACS.
  20. Analice las muestras mediante citometría de flujo (consulte la Figura complementaria 1) el mismo día, o almacene las células en la oscuridad a 4 ° C y analícelas al día siguiente.

4. Análisis del ensayo metabólico

  1. Medir la incorporación de puromicina (OPP) como sustituto de la síntesis de proteínas en las siguientes condiciones: 1) condición de control (Co); 2) en células donde la vía glucolítica está bloqueada por 2-DG; 3) en células donde la vía mitocondrial OXPHOS está bloqueada por O; y 4) en células donde tanto la vía glucolítica como la mitocondrial están bloqueadas por inhibidores (DGO), mediante la evaluación de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de OPP (Figura 2).
  2. Analice la dependencia de las células hacia una vía particular observando el MFI de OPP en cada condición. Evaluar directamente el MFI como medida de la síntesis de proteínas. Calcular la dependencia de la glucosa, la capacidad glucolítica, la capacidad de oxidación de ácidos grasos (FAO) y la capacidad de oxidación de aminoácidos (AAO) y la dependencia mitocondrial de acuerdo con10.

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Resultados

Las células T CD4+ vírgenes se aislaron del bazo y los ganglios linfáticos de ratones y se diferenciaron en linajes Th0 o no polarizados (NP) durante 72 h. Las células se recolectaron después de 0 h, 48 h y 72 h de cultivo, y la incorporación de OPP se midió observando el MFI del OPP. Las células T CD4+ vírgenes eran menos sintéticas que las células T activadas, como se ve en el MFI de OPP (Figura 3). Las células vírgenes dependían parcialmente de la glucólisis, pero má...

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Discusión

Este artículo proporciona un método para estudiar el metabolismo en células linfoides mediante citometría de flujo, basado en la tecnología SCENITH, pero utilizando el etiquetado químico de la puromicina incorporada. Aunque nos hemos centrado en los linfocitos, este protocolo se puede ajustar para estudiar el metabolismo en cualquier tipo de célula. Este método también es ventajoso para estudiar el metabolismo en poblaciones raras de células y muestras de pacientes, donde otras técnicas,...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Qin Xu y al Dr. Avik Dutta por proporcionar muestras de PBMC y valiosas sugerencias experimentales. Esta investigación fue apoyada en parte por la División de Investigación Intramuros del NIAID, NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-MercaptoetanolThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 anticuerpo anti-puromicinaBiolegend 381506Dilución utilizada: 1/100
Alexa Fluor 647 anticuerpo anti-CD4 humanoBiolegend357422Dilución utilizada:  1/50
BD Horizon BUV737 Rata Anti-Ratón CD4BD Biosciences612761Dilución utilizada:  Kit
de ensayo de síntesis de proteínas 1/200 Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488Thermo FisherC10456
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
suero humanoMillipore SigmaH4522
IMDM, Suplemento GlutaMAX, 500 mlThermo Fisher31980030
InVivoMAb anti-ratón CD28, Clon:  37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb anti-ratón CD3&épsilon;, Clon:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb anti-ratón IFNγ, Clon:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb anti-ratón IL-12 p40, Clon:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb anti-ratón IL-4, Clon: 11B11BioXcellBE0045
L-Glutamina (200 mM)Thermo Fisher25030081
LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua fijable, para excitación de 405 nmThermo FisherL34966Dilución utilizada: 
Medio de separación de linfocitos LSMBiomedicals50494X
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)Thermo Fisher11140050
Mitomicina C de Streptomyces caespitosus Kit deSigmaM0503-10X2MG
ratónMiltenyi Biotec130-104-453
Solución acuosa de paraformaldehído al 16% Ciencias de la microscopía electrónica15710
PBS (1X), pH 7,4, 500 mlProductos biológicos de calidad114-058-101
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml). 100 mlde Thermo Fisher15140122
fitohemaglutinina-L (PHA-L)Millipore Sigma11249738001
Suero fetal bovino de grado premium (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 Medio, sin glutaminaThermo Fisher21870076
SaponinaThermo FisherA18820.22
Piruvato de sodio (100 mM)Thermo Fisher11360070
1/600 MP aislamiento de CD4 naive , de grado EM

Referencias

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Metabolismo de células linfoideproliferación de células Tsíntesis de proteínasreprogramación metabólicavía glucolíticafosforilación oxidativainhibidores metabólicosmétodo SCENITH

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