Método para estudiar el metabolismo en células linfoides utilizando la química para medir la incorporación de puromicina por citometría de flujo

Resumen

El protocolo muestra un método basado en citometría de flujo que utiliza la química para estudiar el metabolismo energético en las células.

Resumen

Tras la estimulación del antígeno, las células T vírgenes experimentan una rápida proliferación y expansión a células T efectoras. El metabolismo juega un papel importante en la generación de biomasa necesaria para estas células que proliferan rápidamente y para la generación de moléculas necesarias para la diferenciación y función de las células T efectoras, que influyen en el resultado de la respuesta inmune adaptativa en infecciones o cánceres. Las células T vírgenes reprograman su metabolismo tras la estimulación antigénica para aumentar la generación de ATP, que es necesario para apoyar su crecimiento, biosíntesis y funciones efectoras. El ATP puede generarse en una célula por la vía de fosforilación mitocondrial-oxidativa (OXPHOS) o por la vía glucolítica. Debido a que la mayor parte del ATP generado en una célula en crecimiento y en división se utiliza para la síntesis de proteínas, la síntesis de proteínas se ha utilizado como sustituto de los niveles de ATP. La síntesis de proteínas se puede medir mediante la incorporación de puromicina, que imita la adenosina 3 'de un ARNt cargado con una tirosina modificada y conduce a la terminación espontánea de la traducción de proteínas. Los inhibidores metabólicos como la 2-desoxiglucosa (2DG), que bloquea la vía glucolítica, y la oligomicina (O), que bloquea el complejo 5 de la cadena de transporte de electrones (ETC), se pueden utilizar para estudiar las dependencias de la generación celular de ATP en estas dos vías junto con la evaluación de la síntesis de proteínas en un método llamado SCENITH. Describimos aquí una variación de este método que detecta la incorporación de puromicina por citometría de flujo utilizando química. Este método de estudio del metabolismo es relativamente fácil y se puede utilizar para evaluar poblaciones de células raras, así como muestras de pacientes, mediante citometría de flujo.

Introducción

En los últimos años, ha habido una creciente apreciación del importante papel del metabolismo en la regulación de las células T. El metabolismo celular regula muchas funciones críticas en los linfocitos, incluida la expansión clonal de células T específicas de patógenos y su diferenciación en subconjuntos de células efectoras, que sintetizan una variedad de moléculas efectoras, incluidas las citocinas inflamatorias y las granzimas citolíticas necesarias para matar patógenos¹. Por lo tanto, el estudio del metabolismo de las células T es importante tanto para evaluar la función normal de las células T como para e....

Protocolo

La cría de animales y los experimentos se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado G98-3 por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano, NIH, y el protocolo aprobado LISB 22E por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, NIH. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57Bl / 6J de 6 a 12 semanas, criados y alojados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF). Se obtuvieron resultados similares con ratones hembras. La sangre entera humana se obtuvo del Banco de Sangre de los NIH bajo el protocolo....

Resultados

Las células T CD4⁺ vírgenes se aislaron del bazo y los ganglios linfáticos de ratones y se diferenciaron en linajes Th0 o no polarizados (NP) durante 72 h. Las células se recolectaron después de 0 h, 48 h y 72 h de cultivo, y la incorporación de OPP se midió observando el MFI del OPP. Las células T CD4⁺ vírgenes eran menos sintéticas que las células T activadas, como se ve en el MFI de OPP (Figura 3). Las células vírgenes dependían parcialmente de la glucólisis, pero má.......

Discusión

Este artículo proporciona un método para estudiar el metabolismo en células linfoides mediante citometría de flujo, basado en la tecnología SCENITH, pero utilizando el etiquetado químico de la puromicina incorporada. Aunque nos hemos centrado en los linfocitos, este protocolo se puede ajustar para estudiar el metabolismo en cualquier tipo de célula. Este método también es ventajoso para estudiar el metabolismo en poblaciones raras de células y muestras de pacientes, donde otras técnicas,.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Mercaptoetanol	Thermo Fisher	21985-023
Alexa Fluor 488 anticuerpo anti-puromicina	Biolegend 381506		Dilución utilizada: 1/100
Alexa Fluor 647 anticuerpo anti-CD4 humano	Biolegend	357422	Dilución utilizada:  1/50
BD Horizon BUV737 Rata Anti-Ratón CD4	BD Biosciences	612761	Dilución utilizada:  Kit
de ensayo de síntesis de proteínas 1/200 Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	C10456
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
suero humano	Millipore Sigma	H4522
IMDM, Suplemento GlutaMAX, 500 ml	Thermo Fisher	31980030
InVivoMAb anti-ratón CD28, Clon:  37.51	BioXcell	BE0015-1
InVivoMAb anti-ratón CD3&épsilon;, Clon:  145-2C11	BioXcell	BE0001-1
InVivoMAb anti-ratón IFNγ, Clon:  XMG1.2	BioXcell	BE0055
InVivoMAb anti-ratón IL-12 p40, Clon:  C17.8	BioXcell	BE0051
InVivoMAb anti-ratón IL-4, Clon: 11B11	BioXcell	BE0045
L-Glutamina (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua fijable, para excitación de 405 nm	Thermo Fisher	L34966	Dilución utilizada:
Medio de separación de linfocitos LSM	Biomedicals	50494X
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)	Thermo Fisher	11140050
Mitomicina C de Streptomyces caespitosus Kit de	Sigma	M0503-10X2MG
ratón	Miltenyi Biotec	130-104-453
Solución acuosa de paraformaldehído al 16%	Ciencias de la microscopía electrónica	15710
PBS (1X), pH 7,4, 500 ml	Productos biológicos de calidad	114-058-101
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml). 100 ml	de Thermo Fisher	15140122
fitohemaglutinina-L (PHA-L)	Millipore Sigma	11249738001
Suero fetal bovino de grado premium (FBS)	Avantor	97068-085
RPMI 1640 Medio, sin glutamina	Thermo Fisher	21870076
Saponina	Thermo Fisher	A18820.22
Piruvato de sodio (100 mM)	Thermo Fisher	11360070

1/600 MP aislamiento de CD4 naive , de grado EM