Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas

Resumen

En este trabajo se presenta la metodología para evaluar de forma concisa los niveles de LC3-II del marcador autofagosoma en vesículas extracelulares (VE) mediante inmunotransferencia. El análisis de los niveles de LC3-II en EV, la formación de autolisosomas y la formación de omegasomas sugiere el nuevo papel de STX6 en la liberación de EV positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

Resumen

La (macro)autofagia representa una vía fundamental de degradación celular. En este proceso, las vesículas de doble membrana conocidas como autofagosomas engullen el contenido citoplasmático y posteriormente se fusionan con los lisosomas para su degradación. Más allá del papel canónico, los genes relacionados con la autofagia también modulan una vía de secreción que implica la liberación de moléculas inflamatorias, factores de reparación de tejidos y vesículas extracelulares (VE). En particular, el proceso de diseminación de proteínas patológicas entre las células, particularmente en las enfermedades neurodegenerativas que afectan al cerebro y la médula espinal, subraya la importancia de comprender este fenómeno. Investigaciones recientes sugieren que la proteína de unión al ADN de respuesta transactiva 43 kDa (TDP-43), un actor clave en la esclerosis lateral amiotrófica y la degeneración lobar frontotemporal, se libera de manera autofagienaria a través de EV enriquecidas con las proteínas 1A/1B asociadas a microtúbulos del marcador autofagosómico 1A/1B de cadena ligera 3B-II (LC3-II), especialmente cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

Para dilucidar el mecanismo subyacente a la formación y liberación de EVs LC3-II-positivos, es imperativo establecer un método accesible y reproducible para evaluar las vesículas intracelulares y extracelulares LC3-II-positivas. Este estudio presenta un protocolo detallado para evaluar los niveles de LC3-II mediante inmunotransferencia en fracciones celulares y EV obtenidas mediante centrifugación diferencial. La bafilomycina A1 (Baf), un inhibidor de la fusión autofagosoma-lisosoma, sirve como control positivo para mejorar los niveles de vesículas intracelulares y extracelulares positivas para LC3-II. El gen de susceptibilidad tumoral 101 (TSG101) se utiliza como marcador de cuerpos multivesiculares. Aplicando este protocolo, se demuestra que la knockdown de la sintaxina-6 (STX6) mediada por siRNA, un factor de riesgo genético para la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica, aumenta los niveles de LC3-II en la fracción EV de las células tratadas con Baf sin mostrar un efecto significativo sobre los niveles de TSG101. Estos hallazgos sugieren que STX6 puede regular negativamente la liberación extracelular de LC3-II a través de EV, particularmente en condiciones en las que la fusión autofagosoma-lisosoma está afectada. Combinado con los métodos establecidos para evaluar la autofagia, este protocolo proporciona información valiosa sobre el papel de moléculas específicas en la formación y liberación de EV positivas para LC3-II.

Introducción

La proteína de unión al ADN 43 (TDP-43) es una ribonucleoproteína nuclear heterogénea ampliamente expresada que participa en la regulación del empalme de exones, la transcripción de genes y la estabilidad del ARNm, todas ellas vitales para la supervivencia celular ^1,2. En enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la degeneración lobar frontotemporal (FTLD), una proteína nuclear TDP-43 se acumula de forma anormal en el citoplasma. Este cambio da lugar a una pérdida de la función de TDP-43 en el núcleo y una ganancia de función tóxica en el citoplasma. La acumulación patológica de TDP-43 comienza en regiones específicas del cerebro y la médula espinal, diseminándose a través de estas áreas de forma similar a un prión, un proceso estrechamente asociado con la progresión de la enfermedad³. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo exacto por el cual la patología TDP-43 se propaga a través del cerebro y la médula espinal.

TDP-43 se secreta a través de vesículas extracelulares (VE) y se detectan niveles elevados de TDP-43 en el plasma y el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con ELA y FTLD-TDP ^4,5,6. El líquido cefalorraquídeo de pacientes diagnosticados con ELA y FTLD induce una mala localización intracelular y la agregación de TDP-43 endógeno en células de glioma humano⁷. Por lo tanto, TDP-43 liberado extracelularmente a través de EV puede mediar la propagación de célula a célula de la patología de TDP-43.

La autofagia es un mecanismo de degradación celular bien conservado que implica el encierro de sustancias no deseadas dentro de vesículas de doble membrana, conocidas como autofagosomas, que están marcadas por LC3. Estos autofagosomas se fusionan con los lisosomas positivos para la proteína de membrana 1 asociada a lisosomales (LAMP1) para formar autolisosomas (LC3⁺/LAMP1⁺), lo que lleva a la degradación de su contenido⁸. Los análisis histológicos indican que las inclusiones envolventes de los autofagosomas se acumulan en las neuronas de los pacientes esporádicos con ELA⁹. Algunos genes causales de la ELA familiar y FTLD-TDP están relacionados con la regulación de la autofagia 10,11,12. Estos hallazgos sugieren que la autofagia está suprimida en pacientes con ELA y FTLD-TDP.

El estudio previo indicó que TDP-43 se secreta a través de EVs positivos para el marcador de autofagosoma LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma¹³. La desregulación de la vía autofagia-lisosoma podría causar no solo la acumulación intracelular de TDP-43, sino también la liberación extracelular de TDP-43 a través de EVs¹⁴. Sin embargo, aún se desconoce cómo se liberan los VE positivos para LC3-II y qué tan significativo es esto en la propagación de la patología TDP-43.

Los VE se clasifican en VE grandes (de 100 a 1000 nm de diámetro), que se producen a partir de la gemación de la superficie celular, y VE pequeños (de 50 a 150 nm de diámetro), que se producen a partir de la gemación de las membranas endosomales hacia el interior del endosoma (conocidos como exosomas) y el aparato de Golgi. Para recoger por separado los vehículos eléctricos grandes y pequeños, realizamos una centrifugación secuencial y recogemos pellets por centrifugación a 20.000 × g y 110.000 × g, respectivamente. La fracción P1 EV (20.000 × g de pellets) está preparada para recoger vehículos eléctricos grandes, y la fracción P2 EV (110.000 × g de pellets) está preparada para recoger vehículos eléctricos pequeños¹⁵. La metodología para evaluar los niveles de LC3-II en VE grandes y pequeñas derivada de la centrifugación secuencial por inmunotransferencia es estable y reproducible¹⁶. Además de analizar los niveles de LC3-II en los EV, el análisis de la formación de autolisosomas y omegasomas mejora la comprensión de cómo la desregulación de la autofagia conduce a la liberación de EV positivos para LC3-II. Aquí, el presente estudio muestra el papel supresor de la sintaxina 6 (STX6), una proteína SNARE, que promueve el movimiento de las vesículas transportadoras a las membranas diana¹⁷, en la liberación de EVs positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

Protocolo

1. Preparación de la célula, fracción EV P1 y P2 a partir del medio cultivado de células HeLa

1. Preparación de la fracción P1 y P2 EV a partir del medio cultivado de células HeLa
   1. Día 1
      1. Cuente las células utilizando un contador de células y siembre 1 × 10⁶ células en una placa de 6 cm que contenga un medio de cultivo compuesto por DMEM High Glucose, 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
   2. Día 2 (opcional)
      1. Prepare 20 μM de solución de siRNA.
      2. Mezcle 100 μL de medio sérico reducido y 3 μL de siRNA en un tubo de baja retención para preparar la solución A.
      3. Mezclar 100 μL de medio sérico reducido y 5 μL de reactivo de transfección en un tubo de baja retención para preparar la solución B.
      4. Mezcle la solución A y la solución B, luego incube la mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
      5. Agregue la mezcla de soluciones A y B al medio utilizado para cultivar células HeLa. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
   3. Día 3
      1. Lavar las células con PBS y exponerlas a 500 μL de solución de tripsina al 0,25% y EDTA al 1 mM a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 5 min.
      2. Añada 2,5 mL del medio de cultivo a las células y utilice una pipeta de transferencia Pasteur con una punta de pipeta de 200 μL unida para preparar una suspensión unicelular.
      3. Cuente las celdas usando un contador de celdas y siembre 1 × 10⁶ celdas en un plato de 10 cm. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
         NOTA: Es necesario preparar al menos 1 × 10⁶ células para recolectar EV del medio de cultivo requerido para el análisis de inmunotransferencia.
   4. Día 4
      1. Prepare un medio de cultivo (véase el paso 1.1.1.1) que contenga vehículo (DMSO) o 100 nM de bafilomicicina A1 (Baf).
      2. Exponga las células al medio que contenga vehículo o 100 nM Baf e incube a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
   5. Día 5
      1. Recoja todo el medio de cultivo de la placa de 10 cm, transfiéralo a un tubo de 15 ml y centrifuérrelo a 3.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares.
         NOTA: Las celdas restantes de la placa de 10 cm se utilizarán en la sección 1.2.1.
      2. Para el aislamiento de la fracción P1 EV, transfiera el sobrenadante después de la centrifugación a 3.000 × g a un tubo de centrifugación y, a continuación, centrifugue a 20.000 × g a 4 °C durante 1 h.
      3. Para el aislamiento de la fracción P2 EV, transfiera el sobrenadante después de la centrifugación a 20.000 × g a un tubo de ultracentrífuga y, a continuación, centrifugue a 110.000 × g a 4 °C durante 1 h.
      4. Después de limpiar el exceso de humedad dentro del tubo con una toallita de laboratorio, vuelva a suspender los gránulos restantes en el tubo de centrifugación en 50 μL de tampón de muestra 2x [2,5% SDS, 125mM tampón Tris-HCl (pH 6,8), 30% glicerol, 10% 2-mercaptoetanol, 0,4% azul de bromofenol] para preparar la fracción P1 EV.
      5. Retire el sobrenadante por decantación, limpie el exceso de humedad dentro del tubo con una toallita de laboratorio y luego vuelva a suspender los gránulos restantes en el tubo de ultracentrifugación en 50 μL de tampón de muestra 2x para preparar la fracción P2 EV.
      6. Incubar las fracciones P1 y P2 EV a 100 °C en un bloque térmico durante 10 min.
         NOTA: No agite los tubos después de la centrifugación a 20.000 × g y 110.000 × g para evitar desechar accidentalmente los gránulos restantes. Después de inclinar el tubo para transferir el sobrenadante, mantenga la posición del tubo para evitar que el pellet se sumerja nuevamente en el sobrenadante restante.
2. Preparación de la fracción celular a partir de células HeLa cultivadas
   1. Día 5
      1. Después de transferir el medio de cultivo de la placa de 10 cm a un tubo de 15 mL, lavar las células en la placa de 10 cm con PBS y exponerlas a 2 mL de tripsina al 0,25% y 1 mM de solución de EDTA a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 5 min.
      2. Añada 8 mL de medio de crecimiento a las células, luego use una pipeta de transferencia Pasteur con una punta de pipeta de 200 μL para pipetear las células y preparar una suspensión unicelular.
      3. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugue a 1.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
      4. Retire el sobrenadante con un aspirador, agregue PBS al pellet de celda y luego centrifugue a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
      5. Retire el PBS con un aspirador y sonique el pellet de la célula en 1 mL de tampón A68 [10 mM de tampón Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M de NaCl, 1 mM de etilenglicol bis(β-aminoethil éter)-N,N,N,N,N-ácido tetraacético (EGTA)] que contenga un 1% de sarkosil.
      6. Mida la concentración de proteínas del lisado celular utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA.
      7. Mezclar 300 μL de lisado celular con 100 μL de tampón de muestra 4x e incubar la mezcla a 100 °C en un bloque térmico durante 10 min para preparar la fracción celular.

2. Análisis de inmunotransferencia

1. Separe las cantidades equivalentes de proteínas en las muestras por SDS-PÁGINA¹⁸.
2. Transfiera las proteínas separadas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
3. Después de la transferencia, bloquee las membranas con el agente bloqueante durante 20 minutos.
4. Incubar la membrana bloqueada durante la noche con el anticuerpo primario indicado en tampón Tris que contiene un 10% (v/v) de suero de ternero en RT.
5. Lavar la membrana con tampón Tris durante 5 s y luego incubarla con un anticuerpo secundario conjugado con biotina en RT durante 2 h.
6. Lave la membrana con tampón Tris durante 5 s y luego incube con tampón Tris que contenga soluciones A y B al 0,4% (v/v) del kit en RT durante 1 h.
7. Lave la membrana con PBS y luego incube con PBS que contenga 0,04% (p/v) de diaminobenzidina, 0,8% (p/v) de NiCl 2,6H₂O, y 0,3% (v/v) de H_2O2 para la detección colorimétrica de bandas.
   NOTA: Para la detección de señales, también es aceptable un método de quimioluminiscencia.
8. Digitalizar la imagen de la membrana con un escáner y someterla a un análisis de densitometría utilizando Fiji.
   1. Abra la imagen digitalizada con Fiji y convierta la imagen en color RGB en una imagen de 8 bits haciendo clic en Imagen | Tipo | 8 bits.
   2. Haz clic en la herramienta rectángulo y ajusta el tamaño del rectángulo arrastrándolo para rodear las bandas. Identifique la banda que se va a analizar haciendo clic en Analizar | Geles | Selecciona Primer carril.
   3. Coloque el rectángulo en la segunda banda y en las siguientes, e identifique las bandas para el análisis haciendo clic en Analizar | Geles | Seleccione Siguiente carril.
   4. Después de reconocer la banda final, mida la densitometría a través del rectángulo haciendo clic en Analizar | Geles | Carriles de la parcela.
   5. Rodee el área de la señal de la banda con una línea recta, haga clic en la herramienta de varita y haga clic en el área para calcular la intensidad de la señal de la banda.

3. Análisis del número de autofagosomas y autolisosomas

1. Día 1
   1. Cuente el número de células HeLa utilizando un contador de células y siembre 1 × 10⁵ células HeLa que expresan LAMP1-GFP y mCherry-LC3 en una placa de 3,5 cm. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
2. Día 2 (opcional)
   1. Realice los pasos descritos en la sección 1.1.2 en platos de 3,5 cm.
3. Día 3
   1. Deseche el medio de cultivo de los platos de 3,5 cm.
   2. Lavar las células con PBS, exponerlas a 400 μL de tripsina al 0,25% y 1 mM de solución de EDTA, e incubar a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 5 min.
   3. Añada 1,6 ml del medio de crecimiento a las células y pipetelas con una pipeta de transferencia Pasteur para preparar una suspensión unicelular.
   4. Cuente el número de celdas usando el contador de celdas y siembre 1 × 10⁴ celdas en un cubreobjetos de 8 cámaras. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
      NOTA: Dos pocillos del cubreobjetos con cámara están preparados para las celdas de control y de derribo STX6, respectivamente, siguiendo el tratamiento con DMSO o Baf como se describe en la sección 3.4.2.
4. Día 4
   1. Prepare el medio de crecimiento sin rojo de fenol (DMEM sin rojo de fenol, 10% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina), que contenga vehículo (DMSO) o 100 nM Baf disueltos en DMSO.
   2. Sustituir el medio de cultivo por el medio sin rojo de fenol, que contenga vehículo o 100 nM Baf, e incubar durante 4 h.
      NOTA: Para evaluar el efecto de Baf sobre el número de autofagosomas y autolisosomas, prepare las células tratadas con vehículos como controles.
   3. Teñir los núcleos con 0,33 μg/mL de Hoechst 33342 durante 30 min antes de la observación.
   4. Realice imágenes de células vivas utilizando una lente de objetivo de 60x en un microscopio láser confocal y capture diez fotogramas diferentes.
      1. Abra la imagen combinada RGB en Fiji y divídala en los respectivos componentes de imagen roja, verde y azul haciendo clic en Imagen | Colores | Canales divididos.
      2. Establezca un umbral constante para las señales roja y verde en cada imagen haciendo clic en Imagen | Ajustar | Umbral para cada experimento.
      3. Cuente el número de áreas positivas para señales rojas o verdes haciendo clic en Analizar | Analizar partículas. Marque la casilla Resumir y, a continuación, haga clic en Aceptar. Registre los valores del recuento para identificar las vesículas asociadas a autofagosomas y lisosomas.
      4. Para superponer la imagen verde sobre la imagen roja, establezca el modo de transferencia en Y haciendo clic en Editar | Control de pegado. Copie la imagen verde y luego péguela en la imagen roja para fusionarlas, resaltando las áreas que son positivas para las señales roja y verde.
      5. Para identificar los números de autolisosomas, cuente el número de áreas positivas para las señales rojas y verdes haciendo clic en Analizar | Analizar partículas. Marque la casilla Resumir , haga clic en Aceptar y registre los valores de la sección Recuento para identificar las vesículas asociadas con autofagosomas y lisosomas.
   5. Divida el número total de autolisosomas y autofagosomas por el número total de células para calcular el número de autolisosomas y autofagosomas por celda.
      NOTA: Cuente al menos 35 celdas en cada uno de los tres experimentos independientes.

4. Análisis de la formación de omegasomas

1. Día 1
   1. Cuente el número de células HeLa usando un contador de células y siembre 1 × 10⁵ células en un plato de 3,5 cm. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
2. Día 2 (opcional)
   1. Realice los pasos descritos en la sección 1.1.2.
3. Día 3
   1. Prepare una suspensión de una sola celda como se describe en los pasos 3.3.1-3.3.2.
   2. Cuente las celdas usando el contador de celdas y siembre 1 × 10⁵ celdas en un plato de 3,5 cm. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
4. Día 4
   1. Mezcle 1 μg de pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL del reactivo de transfección de ADN y 100 μL de medio sérico reducido en un tubo de baja retención. Incuba la mezcla durante 20 min, luego agrégala al medio cultivado.
   2. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
5. Día 5
   1. Tripsinice las células como se describe en los pasos 3.3.1-3.3.2.
   2. Agregue 2,5 mL del medio de crecimiento a las células. Pipetear la mezcla con una pipeta de transferencia Pasteur para preparar una suspensión unicelular.
   3. Cuente las celdas usando el contador de celdas y siembre 1 × 10⁴ celdas en un cubreobjetos de 8 cámaras. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad controlada durante 24 h.
6. Día 6
   1. Siga los pasos 3.4.1-3.4.4 para realizar imágenes de células vivas de las células del paso 4.5.3 utilizando un microscopio láser confocal. Captura diez fotogramas diferentes de imágenes.
      1. Siga los pasos 3.4.4.1-3.4.4.3 para dividir las imágenes combinadas RGB en los respectivos componentes de imagen rojo, verde y azul, establecer un umbral constante para las señales verdes en cada imagen y determinar la intensidad de la señal GFP. Registre los valores de la sección Área total para determinar la intensidad de la señal de GFP-ATG13.
      2. Divida la intensidad total de la señal por el número de celdas examinadas para calcular la intensidad de la señal por celda.
         NOTA: Cuente al menos 34 celdas en cada uno de los tres experimentos independientes.

Resultados

Como se demostró en estudios previos, el tratamiento con Baf aumentó los niveles de TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, según lo determinado por ANOVA de dos factores en EZR¹⁹) y LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, según lo determinado por ANOVA de dos vías en EZR¹⁹) en la fracción rica en EV. En particular, el tratamiento con Baf también aumentó los niveles de STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, según lo determinado por ANOVA de dos vías en EZR¹⁹) en la fracción EV (Figura 1A), lo que sugiere que STX6 puede ser un componente de los EV. No se observó antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) en la fracción EV. La inmunotransferencia de STX6 en la fracción celular reveló que los niveles de STX6 disminuyeron a la mitad con su eliminación de siRNA (Figura 1B). La caída de STX6 no afectó los niveles de TSG101 en las fracciones de celda y EV en condiciones tratadas con vehículo y Baf (Figura 1C). Sin embargo, la eliminación de STX6 aumentó los niveles de LC3-II en la fracción celular en la condición tratada con vehículo, pero no en la condición tratada con Baf. El knockdown de STX6 también aumentó los niveles de LC3-II en la fracción EV bajo la condición tratada con Baf (Figura 1D). Estos hallazgos sugieren que los métodos utilizados para detectar LC3-II en VE mediante inmunotransferencia son suficientemente sensibles, incluso si la eficiencia de derribo no es sustancial. Además, estos resultados indican que la eliminación de STX6 aumenta el número de autofagosomas intracelulares y aumenta la liberación extracelular de vesículas asociadas a autofagosomas bajo el tratamiento con Baf.

Para investigar más a fondo si la reducción de STX6 influye en el número de autofagosomas y autolisosomas intracelulares, se visualizaron autofagosomas y lisosomas utilizando el marcador de autofagosomas mCherry-LC3 y el marcador de lisosoma LAMP1-GFP. Las imágenes confocales de células vivas revelaron vesículas positivas para GFP y mCherry en células HeLa que expresaban LAMP1-GFP y mCherry-LC3 (Figura 2A). Los autolisosomas se identificaron como vesículas GFP y mCherry positivas, mientras que los autofagosomas se identificaron como vesículas GFP negativas y mCherry positivas. La eliminación de STX6 aumentó el número de autofagosomas y autolisosomas en la condición tratada con el vehículo (Figura 2B, C). Sin embargo, la reducción de STX6 no afectó los números de autofagosomas y autolisosomas en la condición tratada con Baf (Figura 2B, C).

Para determinar si el aumento en el número de autofagosomas intracelulares debido a la eliminación de STX6 se debía a una mayor formación de autofagosomas, se examinó la formación de omegasomas, un proceso necesario para la formación de autofagosomas, utilizando la intensidad de la señal del marcador de omegasomas GFP-ATG13. Las imágenes confocales de células vivas proporcionaron una imagen ensamblada de GFP-ATG13, lo que indica la formación de omegasomas (Figura 3A). La caída de STX6 disminuyó la intensidad de la señal GFP-ATG13 (P = 0,023, según lo determinado por el ANOVA de dos vías en EZR¹⁹). Si bien la caída de STX6 no influyó significativamente en la intensidad de la señal GFP-ATG13 en la condición tratada con el vehículo, disminuyó significativamente la señal en condiciones tratadas con Baf (Figura 3B). En conjunto, estos hallazgos indican que el knockdown de STX6 aumenta la liberación de vesículas positivas para LC3-II relacionadas con la acumulación de vesículas asociadas al autofagosoma.

Figura 1: Resultados de inmunotransferencia de las fracciones celulares, P1 y P2 de células HeLa transfectadas con siRNA de control o STX6 bajo tratamiento con vehículo o Baf. Las células HeLa se trataron con vehículo (DMSO) o 100 nM Baf durante 24 h después de la transfección con control o siRNA STX6 . Se aislaron las fracciones de celda P1 (pellet de 20.000 × g ) y P2 (pellet de 110.000 × g ). (A) Imágenes representativas de inmunotransferencia de cada fracción que muestran STX6, TSG101, LC3 y PCNA. (B-D) El análisis densitométrico para (B) STX6, (C) TSG101 y (D) LC3-II se realizó a partir de las imágenes de inmunotransferencia. Las intensidades de la señal se normalizaron a las células de control o transfectadas con siRNA STX6 tratadas con vehículo o Baf. Los gráficos de barras representan valores medios ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0.05 mediante una prueba t desapareada de dos colas en Excel. Abreviaturas: STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicicina A1; DMSO = sulfóxido de dimetilo; TSG101 = gen de susceptibilidad tumoral 101; LC3 = proteínas asociadas a microtúbulos 1A/1B cadena ligera 3B; PCNA = antígeno nuclear de células proliferantes; S.E.M. = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de imagen confocal de células HeLa que coexpresan Lamp1-GFP y mCherry-LC3 transfectadas con siRNA de control o STX6 en la condición tratada con vehículo y Baf. (A) Las imágenes confocales de las células HeLa que expresan de manera estable LAMP1-GFP y mCherry-LC3 se transfectaron con siRNA de control o STX6 durante 48 h, seguidas de exposición a DMSO o 400 nM Baf durante 4 h. Barra de escala = 20 μm. (B,C) La quenatación de (B) autofagosomas (LAMP1-GFP puntos negativos y mCherry-LC3 positivos) y (C) autolisosomas (LAMP1-GFP y mCherry-LC3 puntos dobles positivos) se realizó utilizando software Fiji. Los datos de los gráficos de barras se presentan como valores medios ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0.05, basado en una prueba t no apareada de dos colas en Excel. Abreviaturas: Lamp1 = proteína de membrana 1 asociada a lisosomas; LC3 = proteínas asociadas a microtúbulos 1A/1B cadena ligera 3B; STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicicina A1; GFP = proteína verde fluorescente; S.E.M. = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imagen confocal de células HeLa que expresan GFP-ATG13, transfectadas con siRNA de control o STX6 , y sometidas a tratamiento con vehículo o Baf. (A) Las células HeLa se transfectaron con siRNA de control o STX6 , seguidas de transfección con pEGFP-C1-hAtg13 y se trataron con DMSO o 400 nM Baf durante 4 h. Barra de escala = 20 μm. (B) Las intensidades relativas de la señal se determinaron normalizando la señal en cada condición a la de las células de control transfectadas con siRNA tratadas con Baf. El gráfico de barras muestra los datos como medias ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0.05 por la prueba t no apareada de dos colas en Excel. Abreviaturas: hAtg13 = gen 13 relacionado con la autofagia humana; STX6 = sintaxina 6; Baf = bafilomicicina A1; DMSO = sulfóxido de dimetilo; S.E.M. = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Análisis de inmunotransferencia de las fracciones celulares, P1 y P2 de células HeLa transfectadas con siRNA de control y tratadas con Baf. Las células HeLa se transfectaron con siRNA de control y se expusieron a 100 nM Baf durante 24 h. A continuación, se prepararon las fracciones: celda, P1 (pellet de 20.000 × g ) y P2 (pellet de 110.000 × g). Imágenes representativas de inmunotransferencia de ULK1 y PCNA, que muestran sus niveles en cada fracción para su comparación. Abreviaturas: Baf = bafilomicicina A1; ULK1 = unc-51 como la quinasa activadora de autofagia 1; PCNA = antígeno nuclear de células proliferantes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El estudio de inmunotransferencia reveló los niveles de LC3-II y TSG101 en la fracción celular, la fracción EV P1 rica en microvesículas y la fracción EV P2 rica en exosomas. Se utilizaron imágenes de células vivas para examinar autofagosomas, autolisosomas y omegasomas, lo que proporcionó información sobre si el knockdown de STX6 influye en la autofagia. Estos resultados combinados sugieren que la caída de STX6 afecta a la liberación de EVs positivos para LC3-II, potencialmente relacionada con la desregulación de la vía de autofagia. Una ventaja clave de este método es su capacidad para distinguir entre vehículos eléctricos grandes y pequeños que se originan en diferentes fuentes. El análisis de citometría de flujo utilizando marcadores específicos para microvesículas, exosomas o el aparato de Golgi puede aclarar aún más cómo la eliminación de STX6 influye en la liberación de vesículas positivas para LC3-II.

Sin embargo, una limitación del estudio de inmunotransferencia es que no está claro si el aumento observado en los niveles de LC3-II en la fracción de EV después de la reducción de STX6 bajo el tratamiento con Baf se debe a un mayor número de vesículas positivas a LC3-II que se liberan o a un aumento en los niveles de LC3-II por EV. Para distinguir entre estas posibilidades, el recuento de vesículas mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas o el análisis de citometría de flujo podría ayudar a determinar si el número de vesículas LC3-II positivas aumenta o si los niveles de LC3-II por vesícula son elevados.

Un paso crítico en el protocolo es el fraccionamiento del medio cultivado para preparar la fracción EV. Los EV se observan como pequeños gránulos en el tubo de centrifugación. Para preparar una fracción de EV comparable, es importante transferir o desechar cuidadosamente el sobrenadante después de la centrifugación para evitar diluir la concentración de proteínas de los gránulos de EV. Para examinar la contaminación de la fracción celular a la fracción EV, se compararon los niveles de una proteína citoplasmática, la quinasa activadora de autofagia tipo unc-51 (ULK1), y una proteína nuclear, PCNA, entre las fracciones de este estudio (Figura suplementaria S1). La concentración de proteínas en la fracción celular generalmente refleja el número de células, pero la concentración de proteínas celulares está influenciada por las etapas del ciclo celular²⁰ o las alteraciones en la proteostasis²¹. La autofagia es crucial para mantener la proteostasis²². La desregulación de la autofagia por el knockdown de STX6 o el tratamiento con Baf podría alterar la concentración de proteínas independientemente del número de células.

La eliminación de STX6 se logra a través de la transfección de siRNA, y la sobreexpresión de GFP-ATG13 se logra a través de la transfección de ADN. La eficiencia de la transfección está influenciada por el tipo de celda, la densidad y el número. La alineación eficiente de las secuencias de siRNA también podría afectar la eficiencia de la eliminación. Los ajustes son necesarios cuando la eficiencia de la transfección es baja.

Los resultados presentados indican que el knockdown de STX6 aumentó los niveles del marcador de autofagosomas LC3-II en la fracción EV en condiciones tratadas con Baf, pero no afectó los niveles de TSG101. Esto sugiere que STX6 suprime la liberación de vesículas derivadas de los autofagosomas, pero no de los MVB, cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

La eliminación de STX6 también aumentó los niveles celulares de LC3-II en condiciones de crecimiento, lo que sugiere que STX6 regula la autofagia. De hecho, la eliminación de STX6 aumentó el número de autofagosomas y autolisosomas, mientras que no mejoró la formación de omegasomas. La maduración de los autolisosomas provoca la reforma autofágica de los lisosomas²³. Es posible que STX6 medie el proceso de maduración de los autolisosomas, y su pérdida de función podría aumentar el número de autolisosomas inmaduros, lo que lleva a la desregulación de la fusión autofagosoma-lisosoma debido a la supresión de la reformación autofágica de los lisosomas.

El tratamiento con Baf aumentó los niveles de STX6 en la fracción EV, incluso cuando su expresión estaba regulada a la baja. Estudios previos sugirieron que las vesículas asociadas al autofagosoma se liberan como EV cuando se inhibe la función lisosomal^13,14. Se sabe que STX6 se localiza en vesículas asociadas a autofagosomas, como las vacuolas similares a los autofagosomas que contienen estreptococos del grupo A (GAS)²⁴. Por lo tanto, STX6 podría localizarse en vesículas asociadas a autofagosomas que se liberan como EV cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

La propagación de la patología TDP-43 está estrechamente relacionada con la progresión de la ELA y el FTLD-TDP³. Aunque aún no está claro cómo se propaga la patología TDP-43 a través del cerebro y la médula espinal, la vía EV puede mediar su propagación. Estudios previos han indicado que la desregulación de la vía autofagia-lisosoma da lugar a la liberación de EVs LC3-II positivos que contienen TDP-43¹³. El presente estudio sugiere un papel para STX6 en la regulación de la liberación de EV cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma. La metodología para evaluar los niveles de LC3-II en las fracciones celulares y EV mediante inmunotransferencia debería resultar útil en estudios futuros.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25 % Tripsina EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Plato	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tubo	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μ L Punta de pipeta	Nippon Genetics	FG-301	pipeteo
2-Mercaptoetanol	Nacalai Tesque	21417-52	un material para solución tampón
de muestra 3,3'-Diaminobenzidina tetraclorhidrato Nacalai	Tesque	11009-41	un material para solución DAB
3,5 cm Plato	Plato Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm	TrueLine	TR4001
Baños termostáticos de bloque de aluminio (termobaños secos)	EYELA	273860
Aspirador	SANSYO	SAP-102	solución inhalatoria
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Vector de anticuerpos IgG anti-conejo de cabra conjugada con biotina	Laboratorios	BA-1000	2º anticuerpo para inmunotransferencia
Laboratorio de vectores de anticuerpos IgG antiratón de caballo conjugado con biotina		BA-2000	2º anticuerpo para el bloqueo de inmunotransferencia
Un	Nacalai Tesque	03953-95	un material para inmunotransferencia
Azul de bromofenol	Nacalai Tesque	05808-61	un material para solución tampón de muestra
ternera Suero de ternera	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
centrífuga 5702 R	eppendolf	5703000039
portaobjetos de recuento de doble cámara	Bio-Rad	1450015J
recuento de células Sonificador digital 450	BRANSON
Dimetilsulfóxido	Nacalai Tasque	09659-14	vehículo
DMEM Alta glucosa	Nacalai Tesque	08458-45 medio de	cultivo
DMEM sin Rojo Fenol	Nacalai Tesque	08489-45 medio de	cultivo
EGTA	Dojindo	348-01311	un material para la solución A68
Excel	Microsoft	versión 16.16.27	análisis estadístico
EZR	Referencia Nº 24	versión 1.68	análisis estadístico
FBS	Sigma	173012	medio de cultivo
Fiji	NIH		Herramienta de análisis de imágenes
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	un material para solución tampón de muestra
Hoehst33342	Dojindo	Peróxido de hidrógeno H342
	Fujifilm Wako	080-0186	un material para solución DAB
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	toallita de limpieza
Tubo de baja retención	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	transfección de siRNA y ADN
LSM780 Microscopio láser confocal	Carl Zeiss
Ratón monoclonal Anti-LC3 Anticuerpo	MBL	M186-3	1er anticuerpo para inmunotransferencia
Cloruro de níquel (II) hexahidratado	Fujifilm Wako	149-01041	un material para solución de DAB
N-Lauroilsarcosina Sal de sodio	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrífuga	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Medio de suero reducido	Thermo Fisher Scientific	31985-070	transfección de siRNA y ADN
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicilina/Estreptomicina	Nacalai Tesque	26253-84 Medio de	cultivo
Pierce BCA Kits de ensayo	de proteínas Thermo Fisher Scientific	23225
Anticuerpo policlonal anti-PCNA de conejo	BioAcademia	70-080	1er anticuerpo para inmunoblotting
Conejo policlonal Anticuerpo anti-sintaxina 6	ProteinTech	10841-1-AP 1er	anticuerpo para inmunoblotting
Conejo policlonal Anticuerpo anti-TSG101	ProteinTech	28283-1-AP	1er anticuerpo para inmunotransferencia
Conejo policlonal Anticuerpo anti-ULK1	ProteinTech	20986-1-AP	1er anticuerpo para inmunoblotting
Difluoruro de polivinilideno Milliore de membrana		IPVH00010	un material para el inmunoblot
Equipo	central de desarrollo	versión 4.4.1	análisis estadístico
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA reactivo de transfección
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific		HSS115604 siRNA para la transfección
Cloruro de sodio	Nacalai Tesque	31320-05	un material para tampón Tris y solución A68
Sulfato de dodecilo sódico	Fujifilm Wako	192-13981	un material para solución tampón de muestra
SPARK Lector de microplacas	TECAN
Stealth RNAi Dúplex de control negativo, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	transfección de siRNA
Sacarosa	Fujifilm Wako	193-00025	un material para la solución A68
TC20 Contador de células automatizado con impresora térmica	Bio-Rad	1450109J1	de células
Termobaño	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubación
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	reactivo de transfección
de ADN TransIT-LT1	Mirus Bio MIR2300		reactivo
de transfección de ADNTris(hidroximetil)aminometano	Nacalai Tesque	35406-75	un material para tampón Tris, tampón de muestra y solución A68
Tinte azul de tripano 0,40%	Bio-Rad	1450021	recuento
de células Tubo abierto ultratransparente, 16 x 96 mm	361706	Beckman Coulter	para la fracción P1
EV Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059	recogida para la fracción P2
EV Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
Botella de lavado	como uno	1-4640-02	membrana de lavado
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806