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Artículo de método

Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas

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DOI:

10.3791/67385

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18 de octubre de 2024

 , 
1Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

En este artículo

Resumen

En este trabajo se presenta la metodología para evaluar de forma concisa los niveles de LC3-II del marcador autofagosoma en vesículas extracelulares (VE) mediante inmunotransferencia. El análisis de los niveles de LC3-II en EV, la formación de autolisosomas y la formación de omegasomas sugiere el nuevo papel de STX6 en la liberación de EV positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

Resumen

La (macro)autofagia representa una vía fundamental de degradación celular. En este proceso, las vesículas de doble membrana conocidas como autofagosomas engullen el contenido citoplasmático y posteriormente se fusionan con los lisosomas para su degradación. Más allá del papel canónico, los genes relacionados con la autofagia también modulan una vía de secreción que implica la liberación de moléculas inflamatorias, factores de reparación de tejidos y vesículas extracelulares (VE). En particular, el proceso de diseminación de proteínas patológicas entre las células, particularmente en las enfermedades neurodegenerativas que afectan al cerebro y la médula espinal, subraya la importancia de comprender este fenómeno. Investigaciones recientes sugieren que la proteína de unión al ADN de respuesta transactiva 43 kDa (TDP-43), un actor clave en la esclerosis lateral amiotrófica y la degeneración lobar frontotemporal, se libera de manera autofagienaria a través de EV enriquecidas con las proteínas 1A/1B asociadas a microtúbulos del marcador autofagosómico 1A/1B de cadena ligera 3B-II (LC3-II), especialmente cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

Para dilucidar el mecanismo subyacente a la formación y liberación de EVs LC3-II-positivos, es imperativo establecer un método accesible y reproducible para evaluar las vesículas intracelulares y extracelulares LC3-II-positivas. Este estudio presenta un protocolo detallado para evaluar los niveles de LC3-II mediante inmunotransferencia en fracciones celulares y EV obtenidas mediante centrifugación diferencial. La bafilomycina A1 (Baf), un inhibidor de la fusión autofagosoma-lisosoma, sirve como control positivo para mejorar los niveles de vesículas intracelulares y extracelulares positivas para LC3-II. El gen de susceptibilidad tumoral 101 (TSG101) se utiliza como marcador de cuerpos multivesiculares. Aplicando este protocolo, se demuestra que la knockdown de la sintaxina-6 (STX6) mediada por siRNA, un factor de riesgo genético para la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica, aumenta los niveles de LC3-II en la fracción EV de las células tratadas con Baf sin mostrar un efecto significativo sobre los niveles de TSG101. Estos hallazgos sugieren que STX6 puede regular negativamente la liberación extracelular de LC3-II a través de EV, particularmente en condiciones en las que la fusión autofagosoma-lisosoma está afectada. Combinado con los métodos establecidos para evaluar la autofagia, este protocolo proporciona información valiosa sobre el papel de moléculas específicas en la formación y liberación de EV positivas para LC3-II.

Introducción

La proteína de unión al ADN 43 (TDP-43) es una ribonucleoproteína nuclear heterogénea ampliamente expresada que participa en la regulación del empalme de exones, la transcripción de genes y la estabilidad del ARNm, todas ellas vitales para la supervivencia celular 1,2. En enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la degeneración lobar frontotemporal (FTLD), una proteína nuclear TDP-43 se acumula de forma anormal en el citoplasma. Este cambio da lugar a una pérdida de la función de TDP-43 en el núcleo y una ganancia de función tóxica en el citoplasma. La acumulación patológica de TDP-43 comienza en regiones específicas del cerebro y la médula espinal, diseminándose a través de estas áreas de forma similar a un prión, un proceso estrechamente asociado con la progresión de la enfermedad3. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo exacto por el cual la patología TDP-43 se propaga a través del cerebro y la médula espinal.

TDP-43 se secreta a través de vesículas extracelulares (VE) y se detectan niveles elevados de TDP-43 en el plasma y el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con ELA y FTLD-TDP 4,5,6. El líquido cefalorraquídeo de pacientes diagnosticados con ELA y FTLD induce una mala localización intracelular y la agregación de TDP-43 endógeno en células de glioma humano7. Por lo tanto, TDP-43 liberado extracelularmente a través de EV puede mediar la propagación de célula a célula de la patología de TDP-43.

La autofagia es un mecanismo de degradación celular bien conservado que implica el encierro de sustancias no deseadas dentro de vesículas de doble membrana, conocidas como autofagosomas, que están marcadas por LC3. Estos autofagosomas se fusionan con los lisosomas positivos para la proteína de membrana 1 asociada a lisosomales (LAMP1) para formar autolisosomas (LC3+/LAMP1+), lo que lleva a la degradación de su contenido8. Los análisis histológicos indican que las inclusiones envolventes de los autofagosomas se acumulan en las neuronas de los pacientes esporádicos con ELA9. Algunos genes causales de la ELA familiar y FTLD-TDP están relacionados con la regulación de la autofagia 10,11,12. Estos hallazgos sugieren que la autofagia está suprimida en pacientes con ELA y FTLD-TDP.

El estudio previo indicó que TDP-43 se secreta a través de EVs positivos para el marcador de autofagosoma LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma13. La desregulación de la vía autofagia-lisosoma podría causar no solo la acumulación intracelular de TDP-43, sino también la liberación extracelular de TDP-43 a través de EVs14. Sin embargo, aún se desconoce cómo se liberan los VE positivos para LC3-II y qué tan significativo es esto en la propagación de la patología TDP-43.

Los VE se clasifican en VE grandes (de 100 a 1000 nm de diámetro), que se producen a partir de la gemación de la superficie celular, y VE pequeños (de 50 a 150 nm de diámetro), que se producen a partir de la gemación de las membranas endosomales hacia el interior del endosoma (conocidos como exosomas) y el aparato de Golgi. Para recoger por separado los vehículos eléctricos grandes y pequeños, realizamos una centrifugación secuencial y recogemos pellets por centrifugación a 20.000 × g y 110.000 × g, respectivamente. La fracción P1 EV (20.000 × g de pellets) está preparada para recoger vehículos eléctricos grandes, y la fracción P2 EV (110.000 × g de pellets) está preparada para recoger vehículos eléctricos pequeños15. La metodología para evaluar los niveles de LC3-II en VE grandes y pequeñas derivada de la centrifugación secuencial por inmunotransferencia es estable y reproducible16. Además de analizar los niveles de LC3-II en los EV, el análisis de la formación de autolisosomas y omegasomas mejora la comprensión de cómo la desregulación de la autofagia conduce a la liberación de EV positivos para LC3-II. Aquí, el presente estudio muestra el papel supresor de la sintaxina 6 (STX6), una proteína SNARE, que promueve el movimiento de las vesículas transportadoras a las membranas diana17, en la liberación de EVs positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

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Protocolo

1. Preparación de la célula, fracción EV P1 y P2 a partir del medio cultivado de células HeLa

  1. Preparación de la fracción P1 y P2 EV a partir del medio cultivado de células HeLa
    1. Día 1
      1. Cuente las células utilizando un contador de células y siembre 1 × 106 células en una placa de 6 cm que contenga un medio de cultivo compuesto por DMEM High Glucose, 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
    2. Día 2 (opcional)
      1. Prepare 20 μM de solución de siRNA.
      2. Mezcle 100 μL de medio sérico reducido y 3 μL de siRNA en un tubo de baja retención para preparar la solución A.
      3. Mezclar 100 μL de medio sérico reducido y 5 μL de reactivo de transfección en un tubo de baja retención para preparar la solución B.
      4. Mezcle la solución A y la solución B, luego incube la mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
      5. Agregue la mezcla de soluciones A y B al medio utilizado para cultivar células HeLa. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
    3. Día 3
      1. Lavar las células con PBS y exponerlas a 500 μL de solución de tripsina al 0,25% y EDTA al 1 mM a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 5 min.
      2. Añada 2,5 mL del medio de cultivo a las células y utilice una pipeta de transferencia Pasteur con una punta de pipeta de 200 μL unida para preparar una suspensión unicelular.
      3. Cuente las celdas usando un contador de celdas y siembre 1 × 106 celdas en un plato de 10 cm. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
        NOTA: Es necesario preparar al menos 1 × 106 células para recolectar EV del medio de cultivo requerido para el análisis de inmunotransferencia.
    4. Día 4
      1. Prepare un medio de cultivo (véase el paso 1.1.1.1) que contenga vehículo (DMSO) o 100 nM de bafilomicicina A1 (Baf).
      2. Exponga las células al medio que contenga vehículo o 100 nM Baf e incube a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
    5. Día 5
      1. Recoja todo el medio de cultivo de la placa de 10 cm, transfiéralo a un tubo de 15 ml y centrifuérrelo a 3.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares.
        NOTA: Las celdas restantes de la placa de 10 cm se utilizarán en la sección 1.2.1.
      2. Para el aislamiento de la fracción P1 EV, transfiera el sobrenadante después de la centrifugación a 3.000 × g a un tubo de centrifugación y, a continuación, centrifugue a 20.000 × g a 4 °C durante 1 h.
      3. Para el aislamiento de la fracción P2 EV, transfiera el sobrenadante después de la centrifugación a 20.000 × g a un tubo de ultracentrífuga y, a continuación, centrifugue a 110.000 × g a 4 °C durante 1 h.
      4. Después de limpiar el exceso de humedad dentro del tubo con una toallita de laboratorio, vuelva a suspender los gránulos restantes en el tubo de centrifugación en 50 μL de tampón de muestra 2x [2,5% SDS, 125mM tampón Tris-HCl (pH 6,8), 30% glicerol, 10% 2-mercaptoetanol, 0,4% azul de bromofenol] para preparar la fracción P1 EV.
      5. Retire el sobrenadante por decantación, limpie el exceso de humedad dentro del tubo con una toallita de laboratorio y luego vuelva a suspender los gránulos restantes en el tubo de ultracentrifugación en 50 μL de tampón de muestra 2x para preparar la fracción P2 EV.
      6. Incubar las fracciones P1 y P2 EV a 100 °C en un bloque térmico durante 10 min.
        NOTA: No agite los tubos después de la centrifugación a 20.000 × g y 110.000 × g para evitar desechar accidentalmente los gránulos restantes. Después de inclinar el tubo para transferir el sobrenadante, mantenga la posición del tubo para evitar que el pellet se sumerja nuevamente en el sobrenadante restante.
  2. Preparación de la fracción celular a partir de células HeLa cultivadas
    1. Día 5
      1. Después de transferir el medio de cultivo de la placa de 10 cm a un tubo de 15 mL, lavar las células en la placa de 10 cm con PBS y exponerlas a 2 mL de tripsina al 0,25% y 1 mM de solución de EDTA a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 5 min.
      2. Añada 8 mL de medio de crecimiento a las células, luego use una pipeta de transferencia Pasteur con una punta de pipeta de 200 μL para pipetear las células y preparar una suspensión unicelular.
      3. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugue a 1.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
      4. Retire el sobrenadante con un aspirador, agregue PBS al pellet de celda y luego centrifugue a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
      5. Retire el PBS con un aspirador y sonique el pellet de la célula en 1 mL de tampón A68 [10 mM de tampón Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M de NaCl, 1 mM de etilenglicol bis(β-aminoethil éter)-N,N,N,N,N-ácido tetraacético (EGTA)] que contenga un 1% de sarkosil.
      6. Mida la concentración de proteínas del lisado celular utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA.
      7. Mezclar 300 μL de lisado celular con 100 μL de tampón de muestra 4x e incubar la mezcla a 100 °C en un bloque térmico durante 10 min para preparar la fracción celular.

2. Análisis de inmunotransferencia

  1. Separe las cantidades equivalentes de proteínas en las muestras por SDS-PÁGINA18.
  2. Transfiera las proteínas separadas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
  3. Después de la transferencia, bloquee las membranas con el agente bloqueante durante 20 minutos.
  4. Incubar la membrana bloqueada durante la noche con el anticuerpo primario indicado en tampón Tris que contiene un 10% (v/v) de suero de ternero en RT.
  5. Lavar la membrana con tampón Tris durante 5 s y luego incubarla con un anticuerpo secundario conjugado con biotina en RT durante 2 h.
  6. Lave la membrana con tampón Tris durante 5 s y luego incube con tampón Tris que contenga soluciones A y B al 0,4% (v/v) del kit en RT durante 1 h.
  7. Lave la membrana con PBS y luego incube con PBS que contenga 0,04% (p/v) de diaminobenzidina, 0,8% (p/v) de NiCl 2,6H2O, y 0,3% (v/v) de H2O2 para la detección colorimétrica de bandas.
    NOTA: Para la detección de señales, también es aceptable un método de quimioluminiscencia.
  8. Digitalizar la imagen de la membrana con un escáner y someterla a un análisis de densitometría utilizando Fiji.
    1. Abra la imagen digitalizada con Fiji y convierta la imagen en color RGB en una imagen de 8 bits haciendo clic en Imagen | Tipo | 8 bits.
    2. Haz clic en la herramienta rectángulo y ajusta el tamaño del rectángulo arrastrándolo para rodear las bandas. Identifique la banda que se va a analizar haciendo clic en Analizar | Geles | Selecciona Primer carril.
    3. Coloque el rectángulo en la segunda banda y en las siguientes, e identifique las bandas para el análisis haciendo clic en Analizar | Geles | Seleccione Siguiente carril.
    4. Después de reconocer la banda final, mida la densitometría a través del rectángulo haciendo clic en Analizar | Geles | Carriles de la parcela.
    5. Rodee el área de la señal de la banda con una línea recta, haga clic en la herramienta de varita y haga clic en el área para calcular la intensidad de la señal de la banda.

3. Análisis del número de autofagosomas y autolisosomas

  1. Día 1
    1. Cuente el número de células HeLa utilizando un contador de células y siembre 1 × 105 células HeLa que expresan LAMP1-GFP y mCherry-LC3 en una placa de 3,5 cm. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
  2. Día 2 (opcional)
    1. Realice los pasos descritos en la sección 1.1.2 en platos de 3,5 cm.
  3. Día 3
    1. Deseche el medio de cultivo de los platos de 3,5 cm.
    2. Lavar las células con PBS, exponerlas a 400 μL de tripsina al 0,25% y 1 mM de solución de EDTA, e incubar a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 5 min.
    3. Añada 1,6 ml del medio de crecimiento a las células y pipetelas con una pipeta de transferencia Pasteur para preparar una suspensión unicelular.
    4. Cuente el número de celdas usando el contador de celdas y siembre 1 × 104 celdas en un cubreobjetos de 8 cámaras. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
      NOTA: Dos pocillos del cubreobjetos con cámara están preparados para las celdas de control y de derribo STX6, respectivamente, siguiendo el tratamiento con DMSO o Baf como se describe en la sección 3.4.2.
  4. Día 4
    1. Prepare el medio de crecimiento sin rojo de fenol (DMEM sin rojo de fenol, 10% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina), que contenga vehículo (DMSO) o 100 nM Baf disueltos en DMSO.
    2. Sustituir el medio de cultivo por el medio sin rojo de fenol, que contenga vehículo o 100 nM Baf, e incubar durante 4 h.
      NOTA: Para evaluar el efecto de Baf sobre el número de autofagosomas y autolisosomas, prepare las células tratadas con vehículos como controles.
    3. Teñir los núcleos con 0,33 μg/mL de Hoechst 33342 durante 30 min antes de la observación.
    4. Realice imágenes de células vivas utilizando una lente de objetivo de 60x en un microscopio láser confocal y capture diez fotogramas diferentes.
      1. Abra la imagen combinada RGB en Fiji y divídala en los respectivos componentes de imagen roja, verde y azul haciendo clic en Imagen | Colores | Canales divididos.
      2. Establezca un umbral constante para las señales roja y verde en cada imagen haciendo clic en Imagen | Ajustar | Umbral para cada experimento.
      3. Cuente el número de áreas positivas para señales rojas o verdes haciendo clic en Analizar | Analizar partículas. Marque la casilla Resumir y, a continuación, haga clic en Aceptar. Registre los valores del recuento para identificar las vesículas asociadas a autofagosomas y lisosomas.
      4. Para superponer la imagen verde sobre la imagen roja, establezca el modo de transferencia en Y haciendo clic en Editar | Control de pegado. Copie la imagen verde y luego péguela en la imagen roja para fusionarlas, resaltando las áreas que son positivas para las señales roja y verde.
      5. Para identificar los números de autolisosomas, cuente el número de áreas positivas para las señales rojas y verdes haciendo clic en Analizar | Analizar partículas. Marque la casilla Resumir , haga clic en Aceptar y registre los valores de la sección Recuento para identificar las vesículas asociadas con autofagosomas y lisosomas.
    5. Divida el número total de autolisosomas y autofagosomas por el número total de células para calcular el número de autolisosomas y autofagosomas por celda.
      NOTA: Cuente al menos 35 celdas en cada uno de los tres experimentos independientes.

4. Análisis de la formación de omegasomas

  1. Día 1
    1. Cuente el número de células HeLa usando un contador de células y siembre 1 × 105 células en un plato de 3,5 cm. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
  2. Día 2 (opcional)
    1. Realice los pasos descritos en la sección 1.1.2.
  3. Día 3
    1. Prepare una suspensión de una sola celda como se describe en los pasos 3.3.1-3.3.2.
    2. Cuente las celdas usando el contador de celdas y siembre 1 × 105 celdas en un plato de 3,5 cm. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
  4. Día 4
    1. Mezcle 1 μg de pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL del reactivo de transfección de ADN y 100 μL de medio sérico reducido en un tubo de baja retención. Incuba la mezcla durante 20 min, luego agrégala al medio cultivado.
    2. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
  5. Día 5
    1. Tripsinice las células como se describe en los pasos 3.3.1-3.3.2.
    2. Agregue 2,5 mL del medio de crecimiento a las células. Pipetear la mezcla con una pipeta de transferencia Pasteur para preparar una suspensión unicelular.
    3. Cuente las celdas usando el contador de celdas y siembre 1 × 104 celdas en un cubreobjetos de 8 cámaras. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
  6. Día 6
    1. Siga los pasos 3.4.1-3.4.4 para realizar imágenes de células vivas de las células del paso 4.5.3 utilizando un microscopio láser confocal. Captura diez fotogramas diferentes de imágenes.
      1. Siga los pasos 3.4.4.1-3.4.4.3 para dividir las imágenes combinadas RGB en los respectivos componentes de imagen rojo, verde y azul, establecer un umbral constante para las señales verdes en cada imagen y determinar la intensidad de la señal GFP. Registre los valores de la sección Área total para determinar la intensidad de la señal de GFP-ATG13.
      2. Divida la intensidad total de la señal por el número de celdas examinadas para calcular la intensidad de la señal por celda.
        NOTA: Cuente al menos 34 celdas en cada uno de los tres experimentos independientes.

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Resultados

Como se demostró en estudios previos, el tratamiento con Baf aumentó los niveles de TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, según lo determinado por ANOVA de dos factores en EZR19) y LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, según lo determinado por ANOVA de dos vías en EZR19) en la fracción rica en EV. En particular, el tratamiento con Baf también aumentó los niveles de STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, según lo determinado por ANOVA de dos vías en EZR

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Discusión

El estudio de inmunotransferencia reveló los niveles de LC3-II y TSG101 en la fracción celular, la fracción EV P1 rica en microvesículas y la fracción EV P2 rica en exosomas. Se utilizaron imágenes de células vivas para examinar autofagosomas, autolisosomas y omegasomas, lo que proporcionó información sobre si el knockdown de STX6 influye en la autofagia. Estos resultados combinados sugieren que la caída de STX6 afecta a la liberación de EVs positivos para LC3-II, poten...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI [Subvención número 23K06837] (Tokio, Japón) y la Fundación de Ciencias Takeda (Osaka, Japón). Los autores agradecen al Dr. David C. Rubinsztein (Instituto de Investigación Médica de Cambridge, Cambridge, Reino Unido) por suministrar células HeLa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.25 % Tripsina EDTAFujifilm Wako201-16945
10 cm PlatoThermo Fisher Scientific150464
15 mL TuboThermo Fisher Scientific339650
200 μ L Punta de pipetaNippon GeneticsFG-301pipeteo
2-MercaptoetanolNacalai Tesque21417-52un material para
solución tampón
de muestra 3,3'-Diaminobenzidina tetraclorhidrato NacalaiTesque11009-41un material para solución DAB
3,5 cm Plato Plato Thermo Fisher Scientific150460
6 cm TrueLineTR4001
Baños termostáticos de bloque de aluminio (termobaños secos)EYELA273860
AspiradorSANSYOSAP-102solución inhalatoria
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomycin A1AdipogenBVT-0252
Vector de anticuerpos IgG anti-conejo de cabra conjugada con biotina Laboratorios BA-10002º anticuerpo para inmunotransferencia
Laboratorio de vectores de anticuerpos IgG antiratón de caballo conjugado con biotina BA-20002º anticuerpo para el bloqueo de inmunotransferencia
UnNacalai Tesque03953-95un material para inmunotransferencia
Azul de bromofenolNacalai Tesque05808-61un material para
solución tampón de muestra
ternera Suero de terneracytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220Scanner
centrífuga 5702 Reppendolf5703000039
portaobjetos de recuento de doble cámaraBio-Rad1450015J
recuento de células Sonificador digital 450BRANSON
DimetilsulfóxidoNacalai Tasque09659-14vehículo
DMEM Alta glucosaNacalai Tesque08458-45 medio decultivo
DMEM sin Rojo FenolNacalai Tesque08489-45 medio decultivo
EGTADojindo 348-01311un material para la solución A68
ExcelMicrosoftversión 16.16.27análisis estadístico
EZRReferencia Nº 24versión 1.68análisis estadístico
FBSSigma173012medio de cultivo
FijiNIHHerramienta de análisis de imágenes
GlycerolNacalai Tesque09886-05un material para
solución tampón de muestra
Hoehst33342Dojindo Peróxido de hidrógeno H342
Fujifilm Wako080-0186un material para solución DAB
Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011toallita de limpieza
Tubo de baja retenciónNippon GeneticsFG-MCT015CLBtransfección de siRNA y ADN
LSM780 Microscopio láser confocalCarl Zeiss
Ratón monoclonal Anti-LC3 AnticuerpoMBLM186-31er anticuerpo para inmunotransferencia
Cloruro de níquel (II) hexahidratadoFujifilm Wako149-01041un material para solución de DAB
N-Lauroilsarcosina Sal de sodioNacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 UltracentrífugaBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Medio de suero reducidoThermo Fisher Scientific31985-070transfección de siRNA y ADN
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
Penicilina/EstreptomicinaNacalai Tesque26253-84 Medio decultivo
Pierce BCA Kits de ensayode proteínas Thermo Fisher Scientific23225
Anticuerpo policlonal anti-PCNA de conejoBioAcademia70-0801er anticuerpo para inmunoblotting
Conejo policlonal Anticuerpo anti-sintaxina 6ProteinTech10841-1-AP 1eranticuerpo para inmunoblotting
Conejo policlonal Anticuerpo anti-TSG101ProteinTech28283-1-AP1er anticuerpo para inmunotransferencia
Conejo policlonal Anticuerpo anti-ULK1ProteinTech20986-1-AP1er anticuerpo para inmunoblotting
Difluoruro de polivinilideno Milliore de membranaIPVH00010un material para el inmunoblot
Equipocentral de desarrolloversión 4.4.1análisis estadístico
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778siRNA reactivo de transfección
siRNA STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604 siRNA para la transfección
Cloruro de sodioNacalai Tesque31320-05un material para tampón Tris
y solución A68
Sulfato de dodecilo sódicoFujifilm Wako192-13981un material para
solución tampón de muestra
SPARK Lector de microplacasTECAN
Stealth RNAi Dúplex de control negativo, Med GCThermo Fisher Scientific12935300transfección de siRNA
SacarosaFujifilm Wako193-00025un material para la solución A68
TC20 Contador de células automatizado con impresora térmicaBio-Rad1450109J1de células
TermobañoTOKYO RIKAKIKAIMG-3100incubación
TransIT-293Mirus BioMIR 2700reactivo de transfección
de ADN TransIT-LT1Mirus Bio MIR2300reactivo
de transfección de ADNTris(hidroximetil)aminometanoNacalai Tesque35406-75un material para tampón Tris, tampón de muestra y solución A68
Tinte azul de tripano 0,40%Bio-Rad1450021recuento
de células Tubo abierto ultratransparente, 16 x 96 mm 361706Beckman Coulterpara la fracción P1
EV Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mmBeckman Coulter344059recogida para la fracción P2
EV Vectastain ABC Standard KitVector Laboratories PK-4000immunoblotting
Botella de lavadocomo uno1-4640-02membrana de lavado
μ-Slide 8 Well Highibidi80806
de de R R Recuento Recogida de

Referencias

  1. Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
  2. Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).
  3. Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
  4. Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
  5. Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
  6. Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
  7. Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
  8. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  9. Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
  10. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  11. Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
  12. Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).
  13. Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).
  14. Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
  15. Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  16. Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).
  17. Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
  18. Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
  19. Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
  20. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
  21. Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550(2016).
  22. Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
  23. Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
  24. Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).

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