En este trabajo se presenta la metodología para evaluar de forma concisa los niveles de LC3-II del marcador autofagosoma en vesículas extracelulares (VE) mediante inmunotransferencia. El análisis de los niveles de LC3-II en EV, la formación de autolisosomas y la formación de omegasomas sugiere el nuevo papel de STX6 en la liberación de EV positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas
En este artículo
Resumen
Resumen
La (macro)autofagia representa una vía fundamental de degradación celular. En este proceso, las vesículas de doble membrana conocidas como autofagosomas engullen el contenido citoplasmático y posteriormente se fusionan con los lisosomas para su degradación. Más allá del papel canónico, los genes relacionados con la autofagia también modulan una vía de secreción que implica la liberación de moléculas inflamatorias, factores de reparación de tejidos y vesículas extracelulares (VE). En particular, el proceso de diseminación de proteínas patológicas entre las células, particularmente en las enfermedades neurodegenerativas que afectan al cerebro y la médula espinal, subraya la importancia de comprender este fenómeno. Investigaciones recientes sugieren que la proteína de unión al ADN de respuesta transactiva 43 kDa (TDP-43), un actor clave en la esclerosis lateral amiotrófica y la degeneración lobar frontotemporal, se libera de manera autofagienaria a través de EV enriquecidas con las proteínas 1A/1B asociadas a microtúbulos del marcador autofagosómico 1A/1B de cadena ligera 3B-II (LC3-II), especialmente cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.
Para dilucidar el mecanismo subyacente a la formación y liberación de EVs LC3-II-positivos, es imperativo establecer un método accesible y reproducible para evaluar las vesículas intracelulares y extracelulares LC3-II-positivas. Este estudio presenta un protocolo detallado para evaluar los niveles de LC3-II mediante inmunotransferencia en fracciones celulares y EV obtenidas mediante centrifugación diferencial. La bafilomycina A1 (Baf), un inhibidor de la fusión autofagosoma-lisosoma, sirve como control positivo para mejorar los niveles de vesículas intracelulares y extracelulares positivas para LC3-II. El gen de susceptibilidad tumoral 101 (TSG101) se utiliza como marcador de cuerpos multivesiculares. Aplicando este protocolo, se demuestra que la knockdown de la sintaxina-6 (STX6) mediada por siRNA, un factor de riesgo genético para la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica, aumenta los niveles de LC3-II en la fracción EV de las células tratadas con Baf sin mostrar un efecto significativo sobre los niveles de TSG101. Estos hallazgos sugieren que STX6 puede regular negativamente la liberación extracelular de LC3-II a través de EV, particularmente en condiciones en las que la fusión autofagosoma-lisosoma está afectada. Combinado con los métodos establecidos para evaluar la autofagia, este protocolo proporciona información valiosa sobre el papel de moléculas específicas en la formación y liberación de EV positivas para LC3-II.
Introducción
La proteína de unión al ADN 43 (TDP-43) es una ribonucleoproteína nuclear heterogénea ampliamente expresada que participa en la regulación del empalme de exones, la transcripción de genes y la estabilidad del ARNm, todas ellas vitales para la supervivencia celular 1,2. En enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la degeneración lobar frontotemporal (FTLD), una proteína nuclear TDP-43 se acumula de forma anormal en el citoplasma. Este cambio da lugar a una pérdida de la función de TDP-43 en el núcleo y una ganancia de función tóxica en el c....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de la célula, fracción EV P1 y P2 a partir del medio cultivado de células HeLa
- Preparación de la fracción P1 y P2 EV a partir del medio cultivado de células HeLa
- Día 1
- Cuente las células utilizando un contador de células y siembre 1 × 106 células en una placa de 6 cm que contenga un medio de cultivo compuesto por DMEM High Glucose, 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar las celdas a 37 °C con 5% de CO2 y humedad controlada durante 24 h.
- Día 2 (opcional)
- Prepare 20 μM de solución de siRNA. ....
- Día 1
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Como se demostró en estudios previos, el tratamiento con Baf aumentó los niveles de TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, según lo determinado por ANOVA de dos factores en EZR19) y LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, según lo determinado por ANOVA de dos vías en EZR19) en la fracción rica en EV. En particular, el tratamiento con Baf también aumentó los niveles de STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, según lo determinado por ANOVA de dos vías en EZR
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El estudio de inmunotransferencia reveló los niveles de LC3-II y TSG101 en la fracción celular, la fracción EV P1 rica en microvesículas y la fracción EV P2 rica en exosomas. Se utilizaron imágenes de células vivas para examinar autofagosomas, autolisosomas y omegasomas, lo que proporcionó información sobre si el knockdown de STX6 influye en la autofagia. Estos resultados combinados sugieren que la caída de STX6 afecta a la liberación de EVs positivos para LC3-II, poten.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI [Subvención número 23K06837] (Tokio, Japón) y la Fundación de Ciencias Takeda (Osaka, Japón). Los autores agradecen al Dr. David C. Rubinsztein (Instituto de Investigación Médica de Cambridge, Cambridge, Reino Unido) por suministrar células HeLa.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.25 % Tripsina EDTA | Fujifilm Wako | 201-16945 | |
| 10 cm Plato | Thermo Fisher Scientific | 150464 | |
| 15 mL Tubo | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 200 μ L Punta de pipeta | Nippon Genetics | FG-301 | pipeteo |
| 2-Mercaptoetanol | Nacalai Tesque | 21417-52 | un material para solución tampón |
| de muestra 3,3'-Diaminobenzidina tetraclorhidrato Nacalai | Tesque | 11009-41 | un material para solución DAB |
| 3,5 cm Plato | Plato Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| 6 cm | TrueLine | TR4001 | |
| Baños termostáticos de bloque de aluminio (termobaños secos) | EYELA | 273860 | |
| Aspirador | SANSYO | SAP-102 | solución inhalatoria |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Bafilomycin A1 | Adipogen | BVT-0252 | |
| Vector de anticuerpos IgG anti-conejo de cabra conjugada con biotina | Laboratorios | BA-1000 | 2º anticuerpo para inmunotransferencia |
| Laboratorio de vectores de anticuerpos IgG antiratón de caballo conjugado con biotina | BA-2000 | 2º anticuerpo para el bloqueo de inmunotransferencia | |
| Un | Nacalai Tesque | 03953-95 | un material para inmunotransferencia |
| Azul de bromofenol | Nacalai Tesque | 05808-61 | un material para solución tampón de muestra |
| ternera Suero de ternera | cytiva | SH30073.03 | |
| CanoScan LiDE 220 | Canon | CSLIDE220 | Scanner |
| centrífuga 5702 R | eppendolf | 5703000039 | |
| portaobjetos de recuento de doble cámara | Bio-Rad | 1450015J | |
| recuento de células Sonificador digital 450 | BRANSON | ||
| Dimetilsulfóxido | Nacalai Tasque | 09659-14 | vehículo |
| DMEM Alta glucosa | Nacalai Tesque | 08458-45 medio de | cultivo |
| DMEM sin Rojo Fenol | Nacalai Tesque | 08489-45 medio de | cultivo |
| EGTA | Dojindo | 348-01311 | un material para la solución A68 |
| Excel | Microsoft | versión 16.16.27 | análisis estadístico |
| EZR | Referencia Nº 24 | versión 1.68 | análisis estadístico |
| FBS | Sigma | 173012 | medio de cultivo |
| Fiji | NIH | Herramienta de análisis de imágenes | |
| Glycerol | Nacalai Tesque | 09886-05 | un material para solución tampón de muestra |
| Hoehst33342 | Dojindo | Peróxido de hidrógeno H342 | |
| Fujifilm Wako | 080-0186 | un material para solución DAB | |
| Kimwipe S-200 | NIPPON PAPER CRECIA | 62011 | toallita de limpieza |
| Tubo de baja retención | Nippon Genetics | FG-MCT015CLB | transfección de siRNA y ADN |
| LSM780 Microscopio láser confocal | Carl Zeiss | ||
| Ratón monoclonal Anti-LC3 Anticuerpo | MBL | M186-3 | 1er anticuerpo para inmunotransferencia |
| Cloruro de níquel (II) hexahidratado | Fujifilm Wako | 149-01041 | un material para solución de DAB |
| N-Lauroilsarcosina Sal de sodio | Nacalai Tesque | 20117-12 | |
| Optima XE-90 Ultracentrífuga | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Medio de suero reducido | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | transfección de siRNA y ADN |
| pEGFP-C1-hAtg13 | Addgene | 22875 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Nacalai Tesque | 26253-84 Medio de | cultivo |
| Pierce BCA Kits de ensayo | de proteínas Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Anticuerpo policlonal anti-PCNA de conejo | BioAcademia | 70-080 | 1er anticuerpo para inmunoblotting |
| Conejo policlonal Anticuerpo anti-sintaxina 6 | ProteinTech | 10841-1-AP 1er | anticuerpo para inmunoblotting |
| Conejo policlonal Anticuerpo anti-TSG101 | ProteinTech | 28283-1-AP | 1er anticuerpo para inmunotransferencia |
| Conejo policlonal Anticuerpo anti-ULK1 | ProteinTech | 20986-1-AP | 1er anticuerpo para inmunoblotting |
| Difluoruro de polivinilideno Milliore de membrana | IPVH00010 | un material para el inmunoblot | |
| Equipo | central de desarrollo | versión 4.4.1 | análisis estadístico |
| RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778 | siRNA reactivo de transfección |
| siRNA STX6 | Thermo Fisher Scientific | HSS115604 siRNA para la transfección | |
| Cloruro de sodio | Nacalai Tesque | 31320-05 | un material para tampón Tris y solución A68 |
| Sulfato de dodecilo sódico | Fujifilm Wako | 192-13981 | un material para solución tampón de muestra |
| SPARK Lector de microplacas | TECAN | ||
| Stealth RNAi Dúplex de control negativo, Med GC | Thermo Fisher Scientific | 12935300 | transfección de siRNA |
| Sacarosa | Fujifilm Wako | 193-00025 | un material para la solución A68 |
| TC20 Contador de células automatizado con impresora térmica | Bio-Rad | 1450109J1 | de células |
| Termobaño | TOKYO RIKAKIKAI | MG-3100 | incubación |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | reactivo de transfección |
| de ADN TransIT-LT1 | Mirus Bio MIR2300 | reactivo | |
| de transfección de ADNTris(hidroximetil)aminometano | Nacalai Tesque | 35406-75 | un material para tampón Tris, tampón de muestra y solución A68 |
| Tinte azul de tripano 0,40% | Bio-Rad | 1450021 | recuento |
| de células Tubo abierto ultratransparente, 16 x 96 mm | 361706 | Beckman Coulter | para la fracción P1 |
| EV Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | recogida para la fracción P2 |
| EV Vectastain ABC Standard Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | immunoblotting |
| Botella de lavado | como uno | 1-4640-02 | membrana de lavado |
| μ-Slide 8 Well High | ibidi | 80806 |
Referencias
- Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
- Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
