A pesar de los considerables esfuerzos para tratar las heridas crónicas, el éxito ha sido limitado. Los procesos celulares y moleculares que interrumpen la curación normal y contribuyen al inicio y desarrollo de heridas crónicas no se comprenden bien. Como resultado, el desarrollo de tratamientos efectivos para estas heridas ha demostrado ser un desafío. Esto se debe principalmente a la falta de modelos animales que imiten las heridas crónicas en humanos y porque la experimentación en humanos con heridas crónicas es limitada. Anteriormente, hemos publicado un modelo de ratón para estudiar heridas crónicas que comparten muchas características con las heridas crónicas diabéticas en humanos. Este modelo incluye la presencia de biofilms formados de forma natural a partir de bacterias que se encuentran en la microbiota cutánea y en el medio ambiente sin necesidad de introducir bacterias externas en las heridas. Por lo tanto, este modelo puede avanzar potencialmente en la comprensión fundamental de cómo las heridas se vuelven crónicas. Aquí, presentamos una actualización del protocolo original para desarrollar este modelo de ratón. Nos hemos concentrado en disminuir la mortalidad de ratones de ~30% a ~5%. También describimos cómo se ha utilizado este modelo para comprender el inicio y la progresión de la cronicidad de la herida mediante el uso de enfoques transcriptómicos de próxima generación, dilucidando la dinámica de la población bacteriana durante la infección y el desarrollo de biopelículas, y demostrando el valor de probar la eficacia de los tratamientos, incluidas las moléculas pequeñas. Hasta ahora, este es el único modelo de herida crónica que no se cura sin intervención.
Artículo de método
Protocolo para crear heridas crónicas en ratones diabéticos: una actualización del protocolo publicado
En este artículo
Resumen
Introducción
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Protocolo
ACTUALIZACIONES:
Esta es una actualización del protocolo presentado anteriormente1
Todos los experimentos se completaron de acuerdo con las regulaciones federales y la política y los procedimientos de la Universidad de California han sido aprobados por la Universidad de California, Riverside IACUC.
1. Animal
Agregue la siguiente nota al paso 1.1:
NOTA: Si los ratones diabéticos homocigotos se compran directamente a los proveedores, aloje a los ratones en un vivero convencional para permitir la colonización de la piel con flora cutánea normal. Se pueden utilizar tanto hombres como mujeres.
Agregue la siguiente sección después del paso 1.3:
1.4.Realizar genotipado
NOTA: Realice el genotipado después de criar al animal como se describió anteriormente hasta el paso 1.31. El siguiente protocolo fue modificado de un procedimiento publicado previamente2. Tanto los ratones machos como las hembras se pueden genotipar a los 14-21 días al destete.
1.4.1. Extracción de ADN crudo
1.4.1.1. Recoger la biopsia por punción auricular del ratón y colocar la muestra de tejido en un tubo de microcentrífuga.
1.4.1.2. Añadir 180 μl de NaOH 50 mM, asegurando que la muestra quede sumergida.
1.4.1.3. Incubar la muestra a 95 °C durante 10 min, despresurizando y agitando el tubo en vórtice cada 5 min.
1.4.1.4. Enfriar la muestra en hielo durante al menos 1 min.
1.4.1.5. Añadir 20 μl de 1 M Tris HCl a pH 8,0 y vórtice.
1.4.1.6. Almacenar las muestras a -20 °C hasta su uso.
1.4.2. Reacción en cadena de la polimerasa
1.4.2.1 Ensamble la siguiente mezcla de cebadores en un tubo de microcentrífuga (Tabla de cebadores).
NOTA: Los cebadores amplifican la región alrededor de la mutación puntual de LepR.
1.4.2.2. Configurar 20 μl de reacciones en cadena de la polimerasa en tubos de PCR. Agregue 10 μL de mezcla maestra de polimerasa Taq 2x (que contiene ADN polimerasa Taq , dNTP, MgCl2 y KCI), 1 μL de mezcla de cebadores (consulte la Tabla de cebadores), 4 μL de extracto de ADN crudo y 5 μL de H2O.
1.4.2.3. Configurar los parámetros de termociclado como sigue: 94 °C durante 2 min; 40 ciclos de 97 °C durante 30 s, 52 °C durante 45 s y 72 °C durante 45 s; seguido de 72 °C durante 2 min y 10 °C para una fijación infinita.
1.4.2.4. Una vez completada la PCR, añadir 4 μl de colorante de carga de ADN 6x a los productos de PCR y separar en un gel de agarosa al 2% (figura 1).
NOTA: Cada reacción de PCR genera 3 productos de PCR: producto común de 610 pb, producto del alelo T mutante de 406 pb y alelo G de tipo salvaje de 264 pb. El genotipo de tipo salvaje consta de los productos de 610 pb y 264 pb, el genotipo heterocigoto consta de los tres productos y el genotipo db / db consta de los productos de 610 pb y 406 pb.
2. Vivero y cría
Reemplace el paso 2.1 con el siguiente paso y la nota:
2.1 Alojar ratones db / db en un vivero convencional (no una instalación libre de barreras / patógenos específicos) para que una microflora pueda establecerse en la piel de los ratones db / db . Para modelar específicamente a los humanos que sufren de heridas crónicas, no tome precauciones especiales para evitar la exposición a patógenos naturales que se encuentran en el entorno de los ratones, ya que los patógenos esenciales del estudio pueden perderse con condiciones de limpieza de vivero más estrictas.
NOTA: Como estos ratones son muy grandes y diabéticos, es mejor albergar hasta 3 db / db de ratones por jaula antes de usarlos para experimentos de heridas crónicas.
3. Requisitos para el desarrollo de heridas crónicas
Agregue el siguiente paso después del paso 3.2
3.3. Mantenga la herida cubierta con un apósito de película transparente en todo momento para evitar que el tejido de la herida se seque.
5. Configuración del reactivo
Agregue la siguiente nota después de 5.2
NOTA: Utilice únicamente ATZ de la empresa que figura en la Tabla de materiales. ATZ de otras compañías no es compatible con este modelo y aumentará la mortalidad.
6. Cirugía
6.1. Tratamiento y anestesia
NOTA: A continuación se describe un régimen de anestesia actualizado.
6.1.5. En un sistema abierto, administrar isoflurano al 5% administrado con O2 al ratón a un caudal (2-3,5 L/min) para inducir la anestesia. Supervise continuamente el estado del mouse.
NOTA: Una vez que el ratón esté inconsciente o ya no se mueva, colóquelo sobre una almohadilla quirúrgica blanca y coloque la cabeza con un cono nasal que esté asegurado al vaporizador para permitir la administración continua de isoflurano durante la cirugía.
6.1.6. En un sistema abierto, administrar isoflurano al 1% al mismo caudal durante la cirugía y ajustar el flujo de isoflurano para mantener la profundidad de la anestesia.
6.3. Herida
6.3.5. Suspender la administración de isoflurano al 1% al ratón al final del procedimiento.
7. Tratamiento postoperatorio y recuperación
Reemplace el paso 7.1 en el protocolo original con el siguiente paso y tenga en cuenta:
7.1. Después de aplicar el apósito de película transparente inmediatamente después de la cirugía, con una jeringa de insulina, deposite MSA tópicamente en la parte superior de la herida creada en el dorso del ratón penetrando el apósito de película transparente con la aguja. Use 150 mg / kg de MSA en una solución estéril de PBS dentro de los 10 minutos posteriores a la cirugía. Esta concentración se determinó después de una extensa búsqueda bibliográfica, como se explicó anteriormente 3,4.
NOTA: La MSA tiende a precipitarse si no se agita constantemente. Asegúrese de que la MSA se disuelva completamente en la solución antes de aplicarla a la herida para administrar la dosis calculada al ratón.
Reemplace el paso 7.4 en el protocolo original por el siguiente paso:
7.4. Administrar la segunda dosis de Buprenex 6 h después de la cirugía. Luego, dosifique a los ratones periódicamente de acuerdo con las reglas locales de IACUC durante las primeras 48 h.
NOTA: No se recomienda utilizar formulaciones de liberación prolongada de analgésicos que deben administrarse por vía subcutánea en este modelo de ratón. La buprenorfina unida a lípidos puede suspenderse en el aceite de triglicéridos de ácidos grasos de cadena media (MCT). Si bien el efecto del aceite MCT se ha probado en ratones db / db muy jóvenes, los efectos de MCT en ratones db / db más viejos u obesos geriátricos no se han probado 5,6. Dado el peso de los ratones, grandes volúmenes de analgésicos inyectados por vía subcutánea cerca de la herida pueden afectar significativamente los procesos celulares y moleculares de cicatrización de heridas y el inicio y desarrollo de heridas crónicas. Además, este analgésico se disolverá en los altos niveles de grasa en estos ratones y, por lo tanto, podría no ser efectivo para matar el dolor y podría volverse tóxico.
8. Recopilación de datos, manejo de los ratones después de la herida, estrategias de supervivencia y consejos adicionales
8.1 Recopilación de datos
Agregue los siguientes pasos después del paso 8.1.3.
8.1.4. Asegúrese de que el tejido recogido para el análisis incluya solo tejido que esté a 2 mm del margen de la herida tanto en las heridas de control como en las crónicas. Las heridas se pueden recoger mediante escisión tan pronto como 1-2 h después de la aplicación de MSA.
8.1.5. Recoja el exceso de líquido acumulado de la herida, o el exudado de la herida, con una jeringa estéril perforando el apósito de película transparente. Almacenar a -20 °C para estudios bacterianos o -80 °C para estudios químicos y moleculares.
8.1.6 Para recolectar tejidos completos de la herida, incluida la biopelícula, después de 10 días, aplique PFA al 4% en PBS a la herida, tópicamente durante 10 minutos antes de extirpar con fórceps y tijeras. Al extraer el tejido, agregue un margen adicional de 5-10 mm para que el tejido de la herida se sostenga con tejido normal adicional. Continuar la fijación en PFA al 4% en PBS y los lavados posteriores y la preparación para la inclusión.
NOTA: Las heridas crónicas 10 días después de la cirugía pueden volverse demasiado frágiles para ser recolectadas para histología.
8.5. Estrategias de supervivencia
8.5.1. Proporcionar apoyo adicional de hidratación: Verifique si los ratones se vuelven letárgicos y no comen ni beben activamente porque la cirugía y la generación de cronicidad son estresantes. Administrar solución salina tibia (35-38 °C) por vía subcutánea o intraperitoneal a un volumen de 0,25 mL por 10 g de peso corporal durante las primeras 48-72 h postoperatorias. Es posible que se necesite apoyo de hidratación hasta 2-3 veces al día, dependiendo de qué tan letárgicos estén los ratones. Además, se pueden colocar gránulos de comida y geles de agua en la ropa de cama para facilitar el acceso, aunque es posible que se requieran cambios de jaula más frecuentes.
8.5.2. Proporcionar soporte de calor adicional: La supervivencia después de la cirugía aumenta significativamente si los ratones se colocan en jaulas sobre una almohadilla calentada por agua circulante (93 °C) inmediatamente después de la cirugía y cuando están en el vivero. Coloque la jaula 1/2 encima y 1/2 fuera de la almohadilla para permitir que el animal se aleje del calor si se calienta demasiado y se mueva encima de la almohadilla si se enfría.
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Resultados
Figura 1: Genotipado para identificar heterocigotos para crear reproductores. Un gel de ejemplo muestra los resultados de 8 muestras de ratón desconocidas. Las muestras 2 y 5 son heterocigotos, ya que contienen 3 bandas (610 pb, 406 pb y 264 pb). Las muestras 1, 3, 4, 6, 7 y 8 son tipos salvajes ya que solo contienen 2 bandas (610 pb y 264 pb).
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Discusión
Hallazgos utilizando este modelo de heridas crónicas:
Este modelo se ha utilizado para realizar varios estudios en un intento de comprender los mecanismos celulares y moleculares del inicio y la progresión de heridas crónicas. Se ha demostrado que al inhibir las enzimas antioxidantes, se pueden crear heridas crónicas en los ratones db / db. Las heridas inicialmente contenían una comunidad polimicrobiana que, con el tiempo, se selecci...
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Punzón para la oreja | de 1 mm Fisherbrand | 13812201 | diámetro del orificio de 2 mm |
| 3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70% etanol | |||
| Acu Punch Punzones de biopsia de piel de 7 mm Acuderm | Inc. | P750 | |
| agarosa | |||
| B6. BKS(D)-Leprdb/J | El laboratorio Jackson | 00697 | Homocigotos y heterocigotos disponibles |
| Buprenex (buprenorfina HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml, |
| Tinte de carga de gel de clase 3, púrpura (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Guantes | |||
| Loción depilatoria con aloe calmante y lanolina | Nair | depilatoria química | |
| HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| Almohadilla térmica | Conair | Adaptadores de manguera de almohadilla térmica húmeda y seca | |
| Adroit MedicalSystems | |||
| BD | 329461 | 0,35 mm (28 G) x 12,7 mm (1/2") | |
| Isoflurano | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Vaporizador de isoflurano | JA Baulch & Asociados | ||
| Maxi-Therm de Kimwipes | |||
| Cincinnati Sub-Zero | Cat No. 247 | 22" x30" Almohadilla reutilizable de alta resistencia | |
| Ácido mercaptosuccínico (MSA) | Cono | ||
| oxígeno | debe ser compatible con el sistema de vaporización | ||
| Solución tampón de fosfato (PBS) | autoclave estéril | ||
| Tijeras quirúrgicas afiladas pequeños recipientes | |||
| Hidróxido de sodio | |||
| Pregunta 2X Master Mix | New England Biolabs | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Apósito de película transparente (6 cm x 7 cm) |
| Espátula | |||
| Pinzas | |||
| tubos | |||
| Tri-HCl | |||
| Wahl Cortapelos | Wahl | Ion Litio Pro |
Referencias
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
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