Artículo de método

La glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos

DOI:

10.3791/67405

⸱

7 de febrero de 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada que ofrece información completa sobre el glicoproteoma heterogéneo en microambientes tumorales complejos necesarios para comprender mejor la glicobiología de los cánceres.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La glicosilación es una modificación proteica común y estructuralmente diversa que afecta a una amplia gama de procesos tumorigénicos. La glicómica y la glicoproteómica impulsadas por espectrometría de masas han surgido como enfoques poderosos para analizar los glicanos liberados y los glicopéptidos intactos, respectivamente, ofreciendo una comprensión más profunda del glicoproteoma heterogéneo en el microambiente tumoral (TME). Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada, que emplea en primer lugar glicómicos porosos basados en carbono grafitizado LC-MS/MS para dilucidar las estructuras de glicanos y su distribución cuantitativa en el glicoma de tejidos tumorales, poblaciones celulares o fluidos corporales que se están investigando. Esto permite un análisis glucómico comparativo para identificar la glicosilación alterada en grupos de pacientes, etapas de la enfermedad o condiciones y, lo que es más importante, sirve para mejorar el análisis glucoproteómico posterior de las mismas muestras mediante la creación de una biblioteca de estructuras de glicanos conocidas, reduciendo así el tiempo de búsqueda de datos y la tasa de identificación errónea de glicoproteínas. Centrándonos en el perfil del N-glicoproteoma, en este protocolo se detallan los pasos de preparación de la muestra para el método de glicoproteómica guiado por glucómicos, y se discuten los aspectos clave de la recopilación y el análisis de datos. El método de glicoproteómica guiado por glucómica proporciona información cuantitativa sobre las glicoproteínas presentes en el TME y sus sitios de glicosilación, la ocupación del sitio y las estructuras de glicanos específicas del sitio. Se presentan resultados representativos de tejidos tumorales fijados en formol e incluidos en parafina de pacientes con cáncer colorrectal, lo que demuestra que el método es sensible y compatible con las secciones de tejido que se encuentran comúnmente en los biobancos. Por lo tanto, la glicoproteómica guiada por glucomica ofrece una visión integral de la heterogeneidad y la dinámica del glicoproteoma en TME complejos, generando datos bioquímicos sólidos necesarios para comprender mejor la glucobiología de los cánceres.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La glicosilación de proteínas es un tipo frecuente y complejo de modificación traslacional y postraduccional de proteínas producidas por especies a lo largo del árbol filogenético de la vida 1,2,3. Se sabe que los glicanos ligados a proteínas influyen en una amplia gama de procesos biológicos importantes para la salud humana, incluida la mediación y regulación de las interacciones celulares y los eventos de comunicación 4,5. Se ha pensado que la glicosilación aberrante de proteínas es una causa de transformación maligna, progresión tumoral y diseminación 6,7,8. Esto implica a los glicanos en procesos tumorales clave en el microambiente tumoral (TME) y ofrece un potencial considerable y en gran parte sin explotar para el descubrimiento de biomarcadores basados en glicanos y aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, la glicobiología está recibiendo cada vez más atención en la investigación del cáncer y en las ciencias de la vida9.

Impulsados por los desarrollos clave en glicoanalítica e informática durante la última década 10,11,12,13,14,15,16,17, la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) impulsada por glucómica y glicoproteómica se han establecido como herramientas poderosas para el perfil de todo el sistema de glicanos liberados y glicopéptidos intactos a partir de mezclas complejas de glicoproteínas extraídas directamente de los orígenes de sus muestras biológicas, como varios tipos de muestras de pacientes con cáncer (por ejemplo, tejidos tumorales, poblaciones de células, fluidos corporales)3,13,18,19,20.

La glicomica proporciona información sobre la estructura y la cantidad del repertorio de glicanos (el glicome), que es producido dinámicamente por células, tejidos e incluso organismos completos. Por otro lado, la glicoproteómica proporciona información cuantitativa sobre los transportadores de proteínas y su(s) sitio(s) de glicosilación, las tasas de ocupación del sitio (macroheterogeneidad), las composiciones de glicanos específicas del sitio y su patrón de distribución del sitio (microheterogeneidad) con información estructural de glicanos limitada (a menudo limitada a la composición de glicanos)15,16,21. Por lo tanto, la glucómica y la glicoproteómica son enfoques complementarios para estudiar los detalles bioquímicos del glicoproteoma22.

Se han desarrollado y aplicado en todos los laboratorios una miríada de diseños metodológicos y estrategias analíticas para la glucómica y la glicoproteómica en función del glicoanalito de interés (por ejemplo, ligado a N-/O-/C, glicano/glicopéptido/glicoproteína, marcado/no marcado), la naturaleza de la muestra (p. ej., células, tejidos, fluidos corporales), la cantidad (niveles de proteínas de nanogramos/microgramos/miligramos) y el instrumento analítico disponible23. 24,25,26,27,28,29,30,31,32. A pesar de los beneficios reconocidos de su uso paralelo, la glicómica y la glicoproteómica no se aplican comúnmente juntas, sino más bien como enfoques independientes en los estudios de investigación glicobiológica y oncológica debido a su alta demanda de experiencia analítica e instrumentación especializada.

Reconociendo esta brecha tecnológica, hace más de una década, introdujimos el método de glicoproteómica asistida por glucómica, que es capaz de integrar datos glucómicos y glicoproteómicos obtenidos de especímenes biológicos complejos33. En resumen, la tecnología de glicoproteómica asistida por glucómica (o guiada por glucómica como en este protocolo) perfila los N- y/o O-glicanos a través de un método LC-MS/MS de carbono grafitizado poroso (PGC)establecido34,35, que luego se utilizan para el análisis de datos de Nglicopéptidos y/o O-glicopéptidos intactos adquiridos de la(s) misma(s) muestra(s) definiendo los límites del espacio de búsqueda de glicanos36. PGC-LC-MS/MS es un método glucómico particularmente poderoso, ya que proporciona información cuantitativa sobre el glicoma con alta sensibilidad y resolución estructural, proporcionando información sobre la topología (secuencia de monosacáridos y patrón de ramificación) y los enlaces glucosídicos de los glicanos incluso dentro de mezclas complejas 35,37,38. El flujo de trabajo de glicoproteómica implica la generación de péptidos, el etiquetado opcional de péptidos, la multiplexación y el prefraccionamiento, así como el enriquecimiento antes del análisis LC-MS/MS de fase reversa que idealmente emplea diferentes métodos de fragmentación, incluida la energía de colisión escalonada/disociación colisional de mayor energía (sceHCD, para N-glicopéptidos) y la transferencia de electrones/disociación colisional de mayor energía (EThcD, para O-glicopéptidos) para la identificación de analitos. Para el análisis de N-glicoproteoma, la de-N-glicoproteómica paralela puede guiar el análisis de datos de N-glicopéptidos intactos definiendo el espacio de búsqueda proteína/péptido y proporcionando más detalles sobre los sitios de N-glicosilación ocupados y su tasa de ocupación del sitio, mientras que el análisis paralelo de péptidos no modificados revela cualquier cambio en el nivel de proteína entre las condiciones estudiadas.

Este documento proporciona un protocolo paso a paso detallado y fácil de seguir para el método de glicoproteómica guiado por glucomicas (consulte la Figura 1 para obtener una descripción general del flujo de trabajo). El protocolo proporciona detalles experimentales de los pasos de preparación de la muestra y los experimentos de glicomica y glicoproteómica basados en LC-MS/MS, y presenta resultados representativos que demuestran la aplicación del método a secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) de tumores resecados de pacientes con cáncer colorrectal (CCR), lo que permite comprender la glicobiología del TME en un valioso tipo de muestra que se archiva en biobancos de cáncer de todo el mundo. También se discute brevemente el análisis y la integración de datos glucómicos y glicoproteómicos.

figure-introduction-1
Figura 1: Descripción general del método de glicoproteómica guiado por glucomica. La descripción general muestra los pasos experimentales detallados en los flujos de trabajo de glucómica (izquierda) y glicoproteómica (derecha), con una descripción general de la información obtenida (en negrita) y cómo se integran los dos enfoques a través de un mejor análisis e interpretación de datos. Inserto: Microcolumnas de SPE de fabricación casera utilizadas para los flujos de trabajo de (i) glucómica y (ii-iii) glicoproteómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos (Ciencias Médicas) de la Universidad Macquarie, Sydney, Australia (Protocolo 5201800073).

NOTA: El método de glicoproteómica guiado por glucómica se puede aplicar a un conjunto diverso de muestras biológicas que van desde una complejidad glicoproteica baja hasta una extrema complejidad. En el caso de los enfoques de glicoproteómica sin marcadores (en los que no se realiza la agrupación de muestras), se requieren aproximadamente 100-200 μg de proteína total de mezclas complejas como material de partida para garantizar una alta cobertura de glicoproteoma después del enriquecimiento de glicopéptidos que solo pueden constituir el 1%-10% de la población de péptidos. Debido a las limitaciones de espacio, se omite la extracción inicial de proteínas de las células o tejidos, y se remite a los lectores a otros recursos15. Glycomics consume de forma conservadora ~10-20 μg de proteína por análisis para la elaboración de perfiles profundos de glicoma, dejando la mayor parte del extracto de proteína para la glicoproteómica. Si no se indica lo contrario, se han mencionado las concentraciones finales y los productos químicos deben disolverse en agua de ultra alta calidad para hacer soluciones acuosas en el protocolo a continuación.

1. Preparación de proteínas

  1. Determine la concentración de proteínas de los extractos utilizando un método establecido (por ejemplo, ensayos de ácido bicincónico o proteínas de Bradford). Ajuste la concentración de proteína a 10 μg/μL en 50 mM de TEAB (pH 8,5).
  2. Reduzca los enlaces disulfuro incubando muestras con 10 mM de DTT durante 45 min a 56 °C. Grupos tioles libres de alquilatos mediante la incubación posterior de muestras con 40 mM de IAA en la oscuridad durante 30 min a 20-25 °C. Apagar la reacción de alquilación con exceso de DTT (~40 mM).
  3. Divida cada muestra de proteína. Permita aproximadamente 10-20 μg de proteína total para la glucómica y 100-200 μg de proteína total para el flujo de trabajo de glicoproteómica.
    NOTA: Además de la(s) muestra(s) de proteína(s) de interés, incluya un modelo conocido de glicoproteína (p. ej., fetuina bovina) o mezcla de proteínas (p. ej., lisado de línea celular, plasma) para evaluar la eficiencia y la reproducibilidad de los procedimientos y para monitorear el rendimiento de LC-MS/MS.

2. Flujo de trabajo de N-glycomics

  1. Inmovilización de proteínas en una membrana de PVDF
    1. Utilice una perforadora de un solo orificio para cortar el accesorio de membrana de PVDF con el número de muestras de proteínas que se van a detectar.
    2. Humedece las membranas extirpadas con etanol o metanol, luego transfiere las membranas a una placa de fondo plano de 96 pocillos.
    3. Una vez que las membranas estén casi secas, deposite las muestras de proteína en un volumen máximo de 2,5 μL por punto para minimizar el área de superficie de la muestra de proteína depositada. Vuelva a localizar las muestras si es necesario para que la cantidad total de proteína inmovilizada en el lugar sea de ~ 10-20 μg. Para hacer esto, deje que la mancha se seque al aire antes de repetir el procedimiento de manchado.
      NOTA: Durante el manchado, puede ser necesario volver a humedecer la membrana con etanol o metanol para evitar que las membranas se sequen hasta su finalización.
    4. Secar las membranas al aire a 20-25 °C durante al menos 3 h, preferiblemente durante la noche. Evite cualquier contaminación de las membranas durante el secado.
      NOTA: Como paso opcional de control de calidad, las proteínas detectadas en las membranas se pueden visualizar mediante tinción con la solución Direct Blue 71 como se describió anteriormente34.
  2. Liberación de N-glicanos ligados a proteínas
    1. Agregue 100 μL de PVP40 al 1% (p/v) en metanol a cada pocillo que contenga las membranas manchadas. Asegúrese de que el lado de la membrana en el que se detectó la muestra de proteína esté orientado hacia arriba durante toda la preparación de la muestra.
    2. Agite la placa en la solución PVP40 durante 5 minutos a 20-25 °C, luego deseche la solución PVP40.
      NOTA: La solución de PVP40 bloquea las membranas de PVDF y los pocillos para evitar la unión inespecífica de la PNGasa F (y cualquier exoglicosidasa que se pueda aplicar para lograr información específica de enlace en experimentos paralelos; consulte la discusión a continuación) en los pasos siguientes.
    3. Lave cada pocillo que contenga las manchas de proteínas bloqueadas con 100 μL de agua ultrapura y agite el plato durante 5 minutos. Repita este paso 3 veces. Asegúrese de que el agua se deseche por completo después de cada lavado.
    4. Añadir 15 μL de solución de PNGasa F (0,5 U/μL, diluida en agua ultrapura de la solución madre de 10 U/μL) a cada pocillo, suponiendo que se han depositado 15 μg de proteína por muestra.
    5. Agregue agua a los pozos vacíos circundantes para evitar la deshidratación de la muestra durante los pasos posteriores de la incubación, y use una película transparente para sellar la placa con cuidado. Incubar la placa durante al menos 8 h a 37 °C.
    6. Sonicar la placa durante 5 minutos para ayudar a que las gotas evaporadas en el costado de los pocillos se acumulen en el fondo de la placa.
    7. Transfiera cuidadosamente las muestras de N-glicanos liberadas a tubos de microcentrífuga individuales (1,5 mL). Lave los pocillos de muestra 2 veces con 20 μL de agua ultrapura y dispense y aspire varias veces. Combine cualquier muestra restante de cada pocillo en los tubos de microcentrífuga que contienen las muestras de N-glicanos.
      NOTA: Evite el uso de tubos de baja unión para la preparación de la muestra de N-glicómica, ya que los glicanos hidrofílicos pueden unirse irreversiblemente a los tubos recubiertos.
    8. Añadir 10 μL de acetato de amonio 100 mM pH 5,0 e incubar las muestras durante 1 h a 20-25 °C.
      NOTA: Este paso hidroxiliza los residuos de N-acetilglucosamina aminados en el extremo reductor de los N-glicanos liberados, lo que permite una reducción exhaustiva en el paso siguiente. Ajuste 100 mM de acetato de amonio a pH 5.0, ya que las altas tasas de conversión de glicosilamina a hidroxilo en el extremo reductor de los N-glicanos desprendidos dependen de la acidez débil de la solución.
    9. Seque las muestras de N-glicanos en un sistema concentrador de vacío.
  3. Reducción de los N-glicanos liberados
    1. Añadir 20 μL de NaBH1 M 4 en 50 mM KOH recién preparado a las muestras de N-glicanos secos y mezclar bien.
      NOTA: NaBH4 debe estar recién preparado en KOH el día en que se utiliza.
    2. Cierre herméticamente las tapas de cada tubo e incube las muestras durante 3 h a 50 °C.
      NOTA: Los N-glicanos se someten a una reducción, que convierte los α y β anómeros del extremo reductor en una sola forma de alditol, lo que conduce a un solo pico cromatográfico en el análisis PGC-LC-MS/MS.
    3. Después de la incubación, haga girar los tubos de muestra en una microcentrífuga para llevar el líquido al fondo de los tubos.
    4. Añadir 100 μL de agua ultrapura a cada muestra. Añadir 2 μL de ácido acético glacial para neutralizar las muestras alcalinas de N-glicanos. Haga girar los tubos de muestra en una microcentrífuga para llevar las muestras al fondo de los tubos.
      NOTA: El ácido acético glacial neutraliza las muestras alcalinas, lo que conduce a la formación de gas hidrógeno (H2) y la posterior efervescencia durante la reacción.
  4. Desalinización de N-glicanos mediante PGC-C18-SPE
    1. Prepare microcolumnas PGC-C18-SPE caseras como se describe a continuación.
      1. Con una jeringa adecuada, conecte y transfiera los discos C18 a las puntas de pipeta adecuadas (10 μL).
        NOTA: En este caso, también se pueden utilizar microcolumnas comerciales C18-SPE.
      2. Pipetear 10 μL de lechada de resina PGC suspendida en metanol al 50% (v/v) en las microcolumnas C18-SPE. Coloque las microcolumnas en tubos de 2 ml equipados con adaptadores de microcentrífuga. Gire los tubos para crear microcolumnas PGC-C18-SPE con una altura de columna de ~0,5 cm (consulte la Figura 1i). Prepare una microcolumna PGC-C18-SPE para cada muestra.
        NOTA: El uso de adaptadores asegura que las microcolumnas estén suspendidas en el centro del tubo.
      3. Para los siguientes pasos de lavado y carga de muestras, ajuste una centrífuga de sobremesa a 6.000 rpm (~2.000 x g) y centrifuga durante 60 s para facilitar el paso de las fases móviles a través de las microcolumnas PGC-C18-SPE. Lave y acondiciona cada microcolumna PGC-C18-SPE secuencialmente con 50 μL de TFA al 0,1% (v/v) en ACN tres veces, seguido de 50 μL de TFA al 0,1% (v/v) tres veces.
        NOTA: Las microcolumnas PGC-SPE se pueden preparar con horas de anticipación, pero deben almacenarse hidratadas a temperatura ambiente antes de su uso.
    2. Aplique las muestras de N-glicanos a las microcolumnas PGC-C18-SPE en un volumen de carga de hasta 40 μL y centrifuga a 6.000 rpm (~2.000 x g) durante 60 s después de cada adición. Repita el paso de carga hasta que toda la muestra de N-glicano se haya aplicado a la microcolumna.
      NOTA: Si bien las fracciones de flujo no deben contener glicanos, recomendamos conservar estas fracciones hasta que los datos de glucómica se hayan adquirido con éxito en caso de retención incompleta en las microcolumnas PGC-C18-SPE.
    3. Lave las microcolumnas PGC-C18-SPE con 20 μL de agua ultrapura. Transfiera las microcolumnas PGC-C18-SPE a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en preparación para la elución de N-glicanos.
    4. Eluir los N-glicanos añadiendo 40 μL de AGT al 0,1 % en ACN al 50 % (ambos v/v) a cada microcolumna PGC-C18-SPE y, a continuación, centrifugar. Repita este procedimiento y combine el eluido.
      NOTA: Es importante monitorear las microcolumnas después de cada centrifugado para asegurarse de que la solución se haya centrifugado completamente, ya que esto facilitará una elución eficiente.
    5. Seque los N-glicanos desalados en un sistema concentrador al vacío.
  5. Adquisición de PGC-LC-MS/MS
    1. Prepare los disolventes LC como se describe a continuación.
      1. Disolvente A: Preparar 100 mL de solución madre de bicarbonato amónico (NH4HCO3) de 100 mM en agua ultrapura. Filtre la solución madre a través de un disco de filtro de nailon de 0,2 μm utilizando una unidad de filtración al vacío para eliminar las partículas. A continuación, prepare 1 L de 10 mM de solución de NH4HCO3 (disolvente A) diluyendo 100 mL de solución madre de 100 mM de NH4HCO3 en 900 mL de agua ultrapura. Sonicar el disolvente A durante 15 min para desgasificar la solución. El disolvente A puede almacenarse durante 1 semana a 20-25 °C, mientras que la solución madre de 100 mM de NH4HCO3 puede almacenarse durante 1 mes a 4 °C.
      2. Disolvente B: Preparar 1 L de 10 mM de NH4HCO3 al 70% (v/v) de ACN en agua ultrapura (disolvente B) añadiendo 100 mL de solución madre de NH4HCO3 100 mM (véase el paso anterior 2.5.1.2) a 700 mL de ACN y diluir hasta un volumen total de 1 L con agua ultrapura. Sonicar el disolvente B durante 15 min para desgasificarlo. El disolvente B puede almacenarse durante 2 semanas a 20-25 °C.
    2. Vuelva a suspender los N-glicanos desalados en 10 μL de agua ultrapura y mezcle bien. Centrifugar las muestras a 14.000 x g durante 5 minutos, luego transferir cuidadosamente el sobrenadante a los viales de muestra MS, dejando aproximadamente 0,5 μL para evitar transferir partículas y residuos visibles o invisibles que dañarían el sistema LC-MS/MS.
    3. Inyecte y separe los N-glicanos en una columna capilar PGC-LC calentada a 50 °C utilizando un gradiente lineal de 60 minutos (o de otro modo apropiado) de 0%-70% (v/v) de solvente B en solvente A en un sistema de HPLC. Asegúrese de que el sistema HPLC esté conectado al espectrómetro de masas y funcione con un caudal constante de 20 μL/min (ajuste el caudal para que coincida con la geometría de la columna PGC-LC).
    4. Detecte los N-glicanos separados utilizando un espectrómetro de masas cuadrupolar de trampa de iones lineal (u otro sistema MS adecuado de baja o alta resolución) instalado con una fuente de iones de electrospray y que funcione en modo de polaridad de iones negativos.
    5. Establezca el rango de escaneo de adquisición MS1 en m/z 150-2,000 con un ancho de pico de escaneo de zoom de m/z 0.25 y ancho completo medio máximo (FWHM) en m/z 200. Ajuste el voltaje de la fuente a 3,2 kV. Para escaneos MS1, configure el control automático de ganancia (AGC) en 5 x 104 iones con un tiempo de acumulación máximo de 50 ms (o cualquier otra configuración adecuada).
      NOTA: El m/z inicial bajo debe incluir la detección de monosacáridos y diacáridos que a menudo contribuyen al N- y O-glicoma.
    6. Para MS/MS, establezca la resolución en m/z 0,25 FWHM a m/z 200, el AGC en 2 x 104 iones y el tiempo máximo de acumulación en 300 ms. Habilite la adquisición dependiente de datos (DDA) y seleccione los cinco precursores más abundantes en cada escaneo completo de MS1 para la fragmentación mediante la disociación inducida por colisión (CID) de activación por resonancia (trampa de iones) a una energía de colisión normalizada (NCE) del 33 %. Anule la selección de la exclusión dinámica para evitar que pasen por alto los isómeros de N-glicanos isobáricos de elución cercana.
  6. Análisis de datos de LC-MS/MS glicomicas
    1. Examine los datos brutos de LC-MS/MS generados utilizando el software adecuado para garantizar una alta calidad de los datos después de confirmar el estrecho ancho de pico de LC, la separación eficaz de isómeros N-glicanos, la alta precisión, resolución y relación señal-ruido de la MS, y la alta eficiencia de fragmentación de CID-MS/MS.
    2. Identifique manualmente los N-glicanos en la muestra en función de su masa precursora monoisotópica, el patrón de fragmentación de CID-MS/MS y el tiempo de retención relativo y absoluto de PGC-LC.
      NOTA: RawMeat v2.1, GlycoMod y GlycoWorkBench v2.1 pueden ayudar en el proceso de identificación como se describe26. Las restricciones biosintéticas conocidas y la relación estructural entre los analitos observados también pueden añadir más confianza en los N-glicanos identificados26. Alternativamente, la identificación semiautomática de glicanos y la anotación espectral se pueden realizar utilizando software comercial.
    3. Para la cuantificación relativa de N-glicanos, genere una lista de transición que contenga el precursor monoisotópico m/z de todos los isómeros de N-glicanos identificados y utilice un software comercial para determinar los valores de área bajo la curva (AUC) basados en cromatogramas de iones extraídos (EIC) de todos los iones precursores de N-glicanos como se describe26.

3. Flujo de trabajo de N-glicoproteómica

  1. Digestión de la mezcla de proteínas
    1. Digiera 100-200 μg del extracto de proteína reducida y alquilada (de la parte 1) añadiendo tripsina (relación enzima:proteína 1:50, p/p) y/u otras proteasas de elección a cada muestra.
      NOTA: A diferencia de la preparación de muestras glicómicas, utilice, si es posible, tubos de microcentrífuga de baja unión para los pasos de preparación de muestras de glicoproteómica para obtener la máxima recuperación de péptidos.
    2. Incubar las muestras durante 8-12 h a 37 °C. Asegúrese de que el pH sea de ~ 8.5 ya que una solución ligeramente alcalina mejora la eficiencia de la digestión de la tripsina.
      NOTA: Se prefieren las proteasas específicas que producen patrones de escisión predecibles y dejan a la mayoría de los N-glicopéptidos con una sola lentejuela (sitio de glicosilación), como la tripsina y el Lys-C. Evite la incubación excesiva de las muestras para reducir las escisiones inespecíficas de proteínas por tripsina u otras proteasas.
    3. Detener la digestión por acidificación (para evitar escisiones inespecíficas inducidas por una digestión prolongada) mediante la adición de 1% (v/v) de TFA.
  2. Desalinización de péptidos con Oligo R3-C18-SPE
    1. Prepare microcolumnas caseras de Oligo R3-C18-SPE como se describe a continuación.
      1. Con una jeringa adecuada, conecte y transfiera los discos C18 a puntas de pipeta de 10 μL.
        NOTA: En este caso, también se pueden utilizar microcolumnas comerciales C18-SPE.
      2. Deposite una lechada de resina Oligo R3 suspendida en ACN puro en las microcolumnas C18-SPE. Coloque las microcolumnas en tubos de 2 mL equipados con adaptadores de microcentrífuga para asegurarse de que las microcolumnas estén suspendidas en el centro del tubo y gire para crear microcolumnas Oligo R3-C18-SPE con una altura de columna de ~ 1 cm (consulte la Figura 1ii). Prepare una microcolumna de Oligo R3-C18-SPE para cada muestra.
    2. Para los siguientes pasos de lavado y carga de muestras, ajuste una centrífuga de sobremesa a 6.000 rpm (~2.000 x g) y centrifuga durante 60 s para permitir que las fases móviles pasen a través de las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE. Lave y acondiciona cada microcolumna de Oligo R3-C18-SPE secuencialmente con 50 μL de ACN puro, 3x, y luego 50 μL de 0,1% (v/v) de TFA, 3x.
      NOTA: Las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE pueden prepararse con antelación y almacenarse hidratadas durante horas a temperatura ambiente antes de su uso.
    3. Coloque las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE acondicionadas en tubos nuevos de 1,5 mL junto con adaptadores de microcentrífuga. Aplique las mezclas de péptidos digeridos trípticos a las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE y centrifuga a 2.000 x g durante 60 s. Es posible que se requieran varias rondas de carga para volúmenes de muestra superiores a 50 μL.
    4. Lavar las microcolumnas Oligo R3-C18-SPE con 50 μL de TFA al 0,1% (v/v), 3x. Transfiera las microcolumnas de Oligo R3-C18-SPE a nuevos tubos de 1,5 mL en preparación para la elución de los péptidos desalados.
    5. Eluir los péptidos desalados aplicando 50 μL de AGT al 0,1% en NAC al 50% (ambos v/v), seguidos de 50 μL de AGT al 0,1% en ACN al 70% (ambos v/v) a cada microcolumna de Oligo R3-C18-SPE. Gira después de cada paso.
      NOTA: Es importante monitorear las microcolumnas después de cada centrifugado para asegurarse de que la solución se haya centrifugado completamente, ya que esto facilitará una elución eficiente.
    6. Recoja, combine y seque los péptidos desalados en un sistema concentrador de vacío.
      NOTA: Si realiza proteómica paralela y de-N-glicoproteómica (consulte la Discusión), divida las muestras de péptidos desalinizados y reserve fracciones separadas antes de secarlas.
  3. Enriquecimiento de N-glicopéptido mediante ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Prepare microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE caseras como se describe a continuación.
      1. Con una jeringa adecuada, conecte y transfiera los discos C8 a puntas de pipeta de 10 μL.
      2. Depositar una lechada de resina ZIC-HILIC suspendida en metanol en las microcolumnas C8-SPE. Coloque las microcolumnas en tubos de 2 mL equipados con adaptadores de microcentrífuga para asegurarse de que las microcolumnas estén suspendidas en el centro del tubo y gire para crear microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE con una altura de columna de ~ 1 cm (consulte la Figura 1iii). Prepare una microcolumna ZIC-HILIC-C8-SPE para cada muestra.
    2. Para los siguientes pasos de lavado y carga de muestras, ajuste una centrífuga de sobremesa a 6.000 rpm (~2.000 x g) y centrifuga durante 60 s para permitir que las fases móviles pasen a través de las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE. Lave y acondiciona cada microcolumna ZIC-HILIC-C8-SPE secuencialmente con 50 μL de metanol, 3x, y luego 50 μL de agua ultrapura, 3x, y finalmente 50 μL de 1% de TFA en 80% (ambos v/v) ACN, 3x.
      NOTA: Las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE se pueden preparar con horas de anticipación, pero deben almacenarse hidratadas a temperatura ambiente antes de su uso.
    3. Vuelva a suspender las mezclas de péptidos secos designadas para el enriquecimiento de N-glicopéptidos en 50 μL de TFA al 1% en ACN al 80% (ambos v/v) y mezcle bien.
      NOTA: Si los péptidos son difíciles de redisolver en el disolvente de carga HILIC, los péptidos pueden redisolverse primero en TFA al 10% (v/v) y luego diluirse rápidamente en ACN para alcanzar las concentraciones del disolvente de carga HILIC. Evite calentar la muestra mientras se encuentra en una alta concentración de TFA para evitar inducir hidrólisis.
    4. Coloque las microcolumnas acondicionadas ZIC-HILIC-C8-SPE en tubos nuevos de 1,5 mL junto con adaptadores de microcentrífuga. Aplique las mezclas de péptidos resuspendidos a las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE y centrifuga a 2.000 x g durante 60 s. Es posible que se requieran varias rondas de carga para volúmenes de muestra superiores a 50 μL.
    5. Recoja la(s) fracción(es) de flujo y vuelva a aplicar la(s) fracción(es) a la misma microcolumna ZIC-HILIC-C8-SPE. Repita la reaplicación 2 veces y mantenga los tubos de flujo.
    6. Lave las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE 2 veces con 50 μL de TFA al 1% en ACN al 80% (ambos v/v), centrifugue y combine este flujo con el flujo del paso 3.3.4.
      NOTA: La fracción de flujo combinada generalmente contiene ~ 90% del material peptídico total, formando efectivamente la fracción peptídica no modificada que, por lo tanto, se puede usar para análisis posteriores por separado (en lugar de llevar a cabo un experimento de tipo proteómico por separado).
    7. Transfiera las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE a los nuevos tubos de microcentrífuga de baja unión de 1,5 mL. Eluir los N-glicopéptidos retenidos secuencialmente con 50 μL de AGT al 0,1% (v/v), seguido de 50 μL de bicarbonato amónico de 25 mM y luego 50 μL de ACN al 50% (v/v). Girar a 2.000 x g durante 60 s después de cada paso.
      NOTA: El eluido generalmente contiene ~ 10% del material peptídico total, la mayoría de los cuales deben ser N-glicopéptidos si se logra una alta eficiencia de enriquecimiento. Es importante monitorear las microcolumnas después de cada centrifugado para asegurarse de que la solución se haya centrifugado completamente, ya que esto facilitará una elución eficiente.
    8. Recoja, combine y seque los N-glicopéptidos enriquecidos y (si es necesario) el flujo de péptidos no modificados a través de fracciones en un sistema concentrador de vacío.
  4. LC-MS/MS de fase reversa de N-glicopéptidos intactos
    1. Prepare los disolventes LC como se describe a continuación.
      1. Disolvente A: Preparar 1 L de ácido fórmico al 0,1% (v/v) en agua ultrapura. Sonicar durante 15 min para desgasificar el disolvente. El disolvente A puede almacenarse durante un mes a 20-25 °C.
      2. Disolvente B: Preparar 1 L de ácido fórmico al 0,1% en ACN al 99,9% (ambos v/v). Sonicar durante 15 min para desgasificar. El disolvente B puede almacenarse durante un mes a 20-25 °C.
    2. Vuelva a suspender las fracciones peptídicas secas en ácido fórmico al 0,1% (v/v) hasta una concentración de aproximadamente 0,2-0,5 μg de péptido/μL y mezcle bien. Gire las muestras a 14.000 x g durante 5 minutos, luego transfiera con cuidado el sobrenadante a los viales de muestra MS, dejando aproximadamente 0,5 μL para evitar transferir partículas y desechos no deseados.
    3. Para cada muestra, inyecte ~0,5-1 μg de péptido total en una columna trampa C18-LC y separe los péptidos en una columna analítica C18-LC a un caudal constante de 250 nL/min utilizando un sistema UPHLC conectado al espectrómetro de masas con un gradiente de 2%-30% de solvente B durante 100 min, 30%-50% B durante 18 min, 50%-95% B durante 1 min, y 9 min al 95% (todo v/v) B en solvente A (o una configuración apropiada).
    4. Detecte los péptidos con un espectrómetro de masas de alta resolución acoplado al sistema nanoLC equipado con una fuente de iones nano-electrospray y que funciona en modo de polaridad de iones positivos.
    5. Para MS1, utilice un rango de escaneo de adquisición de m/z 350-1.800, alta resolución a 60.000-120.000 FWHM a m/z 200 y un voltaje de fuente de ~2,5 kV. Ajuste el AGC a 3 x 106 iones con un tiempo de acumulación máximo de 50 ms (o cualquier otra configuración adecuada).
    6. Para MS/MS, seleccione los 20 iones precursores más abundantes de cada escaneo completo de MS1 para la fragmentación utilizando el modo DDA empleando HCD-MS/MS con un NCE fijo del 35% o sceHCD con NCE del 25%, 35% y 45%. Es importante destacar que fije el valor m/z más bajo en 110 (por ejemplo, rango de escaneo m/z 110 - 1.800) para observar todos los iones de oxonio de baja masa en cada espectro de fragmento.
    7. Seleccione precursores que lleven más de 2 cargas (Z ≥ 2) para la fragmentación. Adquiera espectros (sce)HCD-MS/MS a una resolución de 30.000-45.000 FWHM a m/z 200 con un AGC de 1 x 105 iones y un tiempo de acumulación de 90 ms utilizando una ventana de aislamiento de precursores de ± 1,0 Th. Permitir la exclusión dinámica de 30 s después del aislamiento y la fragmentación únicos de un ion precursor dado.
      NOTA: Si se dispone de ETD, considere también la posibilidad de adquirir EThcD-MS/MS de muestras de N-glicopéptidos intactas utilizando el disparo iónico dependiente del producto. Lleve a cabo este paso cuando los iones de oxonio glicano de diagnóstico (por ejemplo, m/z 138.0545, 204.0867 y 366.1396) se encuentren entre los 20 iones de fragmentos principales dentro de cada espectro HCD-MS/MS39. Detecte los fragmentos EThcD-MS/MS con una resolución de 30.000-45.000 FWHM a m/z 200 con un AGC de 4 x 105 iones, un tiempo de inyección de 250 ms, un NCE HCD del 15% y un ancho de aislamiento de precursores de 1,6 Th.
  5. Análisis de datos de glicoproteómica LC-MS/MS
    1. Confirmar el enriquecimiento de los datos brutos de LC-MS/MS con N-glicopéptidos comprobando que la mayoría de los espectros HCD-MS/MS contienen iones de glicano oxonio (por ejemplo, m/z 138.0545, 204.0867 y 366.1396) y (para las estrategias de etiquetado) presentan una separación de referencia de los iones reporteros TMT de baja masa, una alta eficiencia de fragmentación en los espectros MS/MS y un ancho de pico LC estrecho, y una alta precisión MS, resolución y relación señal-ruido.
    2. Utilizando un motor de búsqueda (hay varios disponibles; ver más abajo), busque los datos de MS/MS de N-glicopéptidos intactos en una base de datos adecuada de proteínas/péptidos dirigida a la muestra que se está investigando (por ejemplo, obtenida de un experimento de de-N-glicoproteómica) o en todas las proteínas humanas UniProtKB revisadas. Adapte la búsqueda contra la N-glicosilación del péptido mediante la búsqueda de péptidos con Asn localizado en secuencias. Es importante destacar que seleccione una base de datos de N-glicanos informada por la glucómica, es decir, glicanos identificados a partir de los datos de la glucómica en el paso 2, para restringir el espacio de búsqueda a los glicanos que se sabe que existen en la(s) muestra(s).
      NOTA: Se pueden considerar búsquedas paralelas utilizando una amplia base de datos de N-glicanos predefinida para descartar la existencia de composiciones adicionales de N-glicanos en los datos.
    3. Adapte las variables de búsqueda restantes de acuerdo con la muestra que se está estudiando, los procedimientos específicos de manejo de muestras realizados y la configuración de MS empleada y la instrumentación utilizada. La configuración de búsqueda común para la búsqueda de datos de N-glicoproteómica incluye:
      Tolerancia de masa de precursores y productos: 10 ppm y 20 ppm
      Especificidad de la proteasa: Totalmente específica y/o semiespecífica (N-ragged)
      Escotes perdidos permitidos: 2
      Modificaciones corregidas: Carbamidometilación de Cys (+57.021 Da)
      Modificaciones variables: Oxidación met (+15.994 Da) (común 1)
      Modificaciones de variables permitidas por péptido: 1 o 2
      Modificaciones de glicanos: base de datos de glicanos informada por glicomicas (raro 1)
      Base de datos de señuelos y contaminantes de proteínas: Habilitado
    4. Filtre todas las búsquedas al <1% de tasa de falsos descubrimientos (FDR) a nivel de proteínas y péptidos. Considere solo los N-glicopéptidos identificados con alta confianza (p. ej., puntuaciones PEP 2D < 0.001) y realice la anotación/curación manual de la salida filtrada para reducir aún más la tasa de identificación incorrecta de N-glicopéptidos como se discutió 36,40,41.
      NOTA: Los glicopéptidos con N-glicanos y glicopéctidos sialilados y multifucosilados que llevan otras modificaciones variables además de los glicanos (es decir, oxidación Met y desamidación Asn/Gln) son particularmente propensos a interpretaciones erróneas por parte de los motores de búsqueda41. Se debe prestar especial atención a la validación de dichos candidatos antes de presentar un informe.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En esta sección se proporcionan resultados representativos del método de glicoproteómica guiado por glucómica aplicado a un portaobjetos de tejido FFPE de un paciente con CCR en estadio II.

Para lograr suficiente material de partida proteico para el protocolo, se combinaron extractos de proteínas de dos portaobjetos (pilas z) del mismo bloque de tejido FFPE siguiendo un protocolo publicado y se aplicó un enfoque de etiquetado TMT para aumentar la sensibilidad del experimento de glicoproteómica...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pasos críticos en el protocolo
En este documento de protocolo, hemos descrito paso a paso el método de glicoproteómica guiado por glucómicos, que proporciona una visión completa de la heterogeneidad y la dinámica del glicoproteoma en el complejo TME.

Un paso crítico en el protocolo es garantizar una proteólisis completa sin digerir en exceso la mezcla de proteínas. Las escisiones inespecíficas de las proteínas aumentan inherentemente el esp...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El THC cuenta con el apoyo de una beca del Programa Internacional de Formación en Investigación financiada por el gobierno australiano. NB cuenta con el apoyo de las Becas Internacionales de Excelencia en Investigación de la Universidad de Macquarie financiadas por la Universidad de Macquarie. AC cuenta con el apoyo de una beca del Programa de Formación en Investigación financiada por el Gobierno de Australia. RK contó con el apoyo del Instituto del Cáncer de Nueva Gales del Sur (ECF181259). La MTA es la beneficiaria de una beca Future Fellowship (FT210100455) del Consejo Australiano de Investigación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
químicos
acetato de amonio Sigma AldrichA1542Alternativas disponibles
Bicarbonato de amonio, pureza ≥ 99.0%Sigma AldrichA6141Alternativas disponibles
Acetonitrilo anhidro (ACN), grado LC-MSSigma Aldrich34851Alternativas disponibles
Fetuin bovinoSigma AldrichF3004Alternativas disponibles
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternativas disponibles
EtanolSigma AldrichE7023Alternativas disponibles
Ácido fórmico, grado LC-MSSigma Aldrich00940Alternativas disponibles
Ácido acético glacialSigma AldrichA6283Alternativas disponibles
Yodoacetamida (IAA)Sigma AldrichI1149Alternativas disponibles
MetanolSigma AldrichM1775Alternativas disponibles
Péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGasa F (10 U/μ L) expresado recombinantemente en Escherichia coli 
Polivinilpirrolidona 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternativas disponibles
Hidróxido de potasio (KOH)Sigma Aldrich484016 Alternativas disponibles
Tripsina porcina de grado secuencial PromegaV5113Alternativas disponibles
Borohidruro de sodio (NaBH4)Sigma Aldrich213462Alternativas disponibles
Bicarbonato de trietilamonio (TEAB), grado LC-MSSigma AldrichT7408Alternativas disponibles
Ácido trifluoroacético (TFA), grado LC-MSSigma AldrichT6508Alternativas disponibles
Tools/Materials
C18discos Empore66883-U
C8Empore66882-U
Placa de polipropileno de 96 pocillos de fondo plano Membrana de3364
Immobilon-PSQMillipore IPVH20200Tamaño de poro: 0,45 μ m 
MicrocentrífugaEppendorf5452000069Alternativas disponibles Adaptadores
de microcentrífugas collar de columna MiniSpinNest Group, Inc., MASS18V
Oligo R3 resinaThermo1133903tamaño de partícula 30 μ m
ParafilmParafilm MPM996
Tubos Protein LoBind 1,5 mLEppendorf0030108450
Tubos Protein LoBind 2,0 mLTubos Eppendorf0030108442
Safe-lock 1,5mL Tubos Eppendorf0030120086
Safe-lock 2,0mL Eppendorf Agitador 0030120094
5382000066Alternativas disponibles
Perforadora de un solo agujeroSwingline74005
Concentradora SpeedVacMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternativas disponibles
Resina Supelclean ENVI-Carb SPESupelco57088Tamaño de partícula 120-400 malla. La resina se puede extraer manualmente de los cartuchos y se puede almacenar a largo plazo en metanol al 50% (v/v) en agua MilliQ
Jeringa Sigma Aldrich Z116866 5 mLAlternativas disponibles
Incubadora de temperatura controladaThermolineE7.30Alternativas disponibles
Baño ultrasónicoUnisonicsFXPAlternativas disponibles
Resina ZIC-HILICMerck150455Tamaño de partícula/poro, 5 μ m/200 Å. La resina se puede extraer manualmente de la columna LC y se puede almacenar a largo plazo en metanol al 50% (v/v) en
microcolumnas de extracción en fase sólida (SPE) ZipTip C18 de agua MilliQ MilliporeZTC18S096Alternativamente, las microcolumnas C18-SPE de fabricación casera pueden reemplazar el sistema de
LC-MS/MS de producto
1260 Infinity Capillary Analysis AgilentAlternativas disponibles
Columna analítica LC preempaquetada con resina ReproSil-Pur C18 AQDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemaniar13.aq.s2570Tamaño de partícula/poro: 3 μ m/120 Å, longitud/diámetro interior: 25 cm/75 μm. También están disponibles columnas comerciales C18 nano-LC/ 
Sistema Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC Alternativas térmicasdisponibles
HyperCarb KAPPA PGC capilar LC columna Tamaño determodescontinuado, 3 μ m/250 Å; longitud de la columna, 30 mm; diámetro interior, 0,180 mm. Las geometrías más grandes de las columnas HyperCarb PGC-LC, que producen datos de calidad similares, están disponibles comercialmente (por ejemplo, Thermo #35003-031030). Columna SupelTMCarb LC de Merck con un tamaño de partícula/poro, 2,7 μ m/200 y con diferentes longitudes de columna y diámetro interno también están disponibles (por ejemplo, Merck #59994-U). 
Acetonitrilo de grado LCMSLiChrosolv100029Alternativas disponibles
Trampa lineal cuadrupolar (LTQ) Espectrómetro de masas de trampa de iones Velos Pro (glicómica) ThermoAlternativas disponibles
Espectrómetro de masas tricríbrido Orbitrap Fusion Lumos (glicoproteómica)ThermoTambién están disponibles otros sistemas MS de alta resolución con o sin ETD (solo necesarios para O-glicoproteómica) (por ejemplo, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker o espectrómetros de masas de alto rendimiento similares de otros proveedores)
Viales de tornillo de vidrio transparente de recuperación total de 0,9 mlAlternativas ThermoTHC11093563disponibles
Viales de rosca de vidrio transparente de recuperación total tapas a juegoAlternativas ThermoTHC09150869disponibles
Columna Trap LC empaquetada internamente con resina ReproSil-Pur C18 AQ Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemaniar15.aq.s0202Tamaño de partícula/poro: 5 μ m/120 Å, longitud/diámetro interior: 2 cm/100 μm. También están disponibles columnas comerciales C18 trap LC. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 o superiorMotor de búsqueda comercial de glicopéptidos y PTM, que acepta datos brutos de LC-MS/MS de la mayoría de los proveedores de MS
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 o superiorSoftware comercial para la inspección manual de candidatos a glicopéptidos y la anotación automática de espectros de glicanos MS/MS
GlycoModSoftware de acceso abierto Expasy, que ayuda a la anotación de datos glicómicos (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Software de acceso abierto, que ayuda a la anotación de datos glucómicos y al dibujo de dibujos animados de glicanos
RawMeatVAST Scientificv2.1Software de acceso abierto, que extrae m/z de iones precursores de glicanos a partir de datos espectrales brutos
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 o superiorSoftware de acceso abierto para la cuantificación relativa de glicanos
XcaliburThermov2.2 o superiorPara navegar por datos LC-MS/MS sin procesar
difluoruro de polivinilideno (PVDF) Corning El de , viene con columnas MicrospinEppendorf HPLC capilar Infinity partícula/poro

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 265-278 (2022).
  2. Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).
  3. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, glycoproteomics, and glycogenomics: An inter-taxa evolutionary perspective. Mol Cell Proteomics. 20, 100024(2021).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  5. Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B., Novak, J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (6), 346-366 (2019).
  6. Leite-Gomes, E., et al. Bringing to light the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mucosal glycosylation as a key player. Inflamm Bowel Dis. 28 (6), 947-962 (2022).
  7. He, K., et al. Decoding the glycoproteome: A new frontier for biomarker discovery in cancer. J Hematol Oncol. 17 (1), 12(2024).
  8. Mereiter, S., Balmana, M., Campos, D., Gomes, J., Reis, C. A. Glycosylation in the era of cancer-targeted therapy: Where are we heading. Cancer Cell. 36 (1), 6-16 (2019).
  9. Seeberger, P. H., et al. What comes next in glycobiology. Cell. 187 (11), 2628-2632 (2024).
  10. Abrahams, J. L., et al. Recent advances in glycoinformatic platforms for glycomics and glycoproteomics. Curr Opin Struct Biol. 62, 56-69 (2020).
  11. Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Schulz, B. L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease. Mol Cell Prot. 15 (6), 1773-1790 (2016).
  12. Gaunitz, S., Nagy, G., Pohl, N. L., Novotny, M. V. Recent advances in the analysis of complex glycoproteins. Anal Chem. 89 (1), 389-413 (2017).
  13. Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Towards structure-focused glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (1), 161-186 (2021).
  14. Hu, H., Khatri, K., Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis. Mass Spectrom Rev. 36 (4), 475-498 (2017).
  15. Bagdonaite, I., et al. Glycoproteomics. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 48(2022).
  16. Peng, W., et al. MS-based glycomics and glycoproteomics methods enabling isomeric characterization. Mass Spectrom Rev. 42 (2), 577-616 (2023).
  17. Aoki-Kinoshita, K. F., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 705-718 (2022).
  18. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: Growing up fast. Curr Opin Struct Biol. 68, 18-25 (2021).
  19. Thaysen-Andersen, M., Kolarich, D., Packer, N. H. Glycomics & glycoproteomics: From analytics to function. Mol Omics. 17 (1), 8-10 (2021).
  20. Trbojevic-Akmacic, I., et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 122 (20), 15865-15913 (2022).
  21. Oliveira, T., Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Kolarich, D. The hitchhiker's guide to glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (4), 1643-1662 (2021).
  22. Rudd, P. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 689-704 (2022).
  23. Madunić, K., et al. Colorectal cancer cell lines show striking diversity of their O-glycome reflecting the cellular differentiation phenotype. Cell Mol Life Sci. 78 (1), 337-350 (2021).
  24. Parker, R., et al. Mapping the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-derived peptidome presented by HLA class II on dendritic cells. Cell Rep. 35 (8), 109179(2021).
  25. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  26. Chatterjee, S., et al. Serum N-glycomics stratifies bacteremic patients infected with different pathogens. J Clin Med. 10 (3), 516(2021).
  27. Osimanjiang, W., et al. Analysis of N- and O-linked glycosylation: Differential glycosylation after rat spinal cord injury. J Neurotrauma. 37 (18), 1954-1962 (2020).
  28. Chatterjee, S., et al. Trends in oligomannosylation and α1,2-mannosidase expression in human cancers. Oncotarget. 12 (21), 2188-2205 (2021).
  29. Chang, D., Klein, J. A., Nalehua, M. R., Hackett, W. E., Zaia, J. Data-independent acquisition mass spectrometry for site-specific glycoproteomics characterization of SARS-CoV-2 spike protein. Anal Bioanal Chem. 413 (29), 7305-7318 (2021).
  30. Pan, J., et al. Glycoproteomics-based signatures for tumor subtyping and clinical outcome prediction of high-grade serous ovarian cancer. Nat Commun. 11 (1), 6139(2020).
  31. Venkatakrishnan, V., et al. Glycan analysis of human neutrophil granules implicates a maturation-dependent glycosylation machinery. J Biol Chem. 295 (36), 12648-12660 (2020).
  32. Sethi, M. K., et al. In-depth matrisome and glycoproteomic analysis of human brain glioblastoma versus control tissue. Mol Cell Proteom. 21 (4), 100216(2022).
  33. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  34. Jensen, P. H., Karlsson, N. G., Kolarich, D., Packer, N. H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins. Nat Protoc. 7 (7), 1299-1310 (2012).
  35. Hinneburg, H., et al. Post-column make-up flow (pcmf) enhances the performance of capillary-flow PGC-LC-MS/MS-based glycomics. Anal Chem. 91 (7), 4559-4567 (2019).
  36. Chau, T. H., et al. Glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased N-glycoproteome profiling of complex biological specimens. Meth Mol Biol. 2628, 235-263 (2023).
  37. Madunic, K., Wagt, S., Zhang, T., Wuhrer, M., Lageveen-Kammeijer, G. S. M. Dopant-enriched nitrogen gas for enhanced electrospray ionization of released glycans in negative ion mode. Anal Chem. 93 (18), 6919-6923 (2021).
  38. Zhang, T., Wang, W., Wuhrer, M., De Haan, N. Comprehensive O-glycan analysis by porous graphitized carbon nanoliquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 96 (22), 8942-8948 (2024).
  39. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R., Khoo, K. H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides. Anal Chem. 86 (2), 5478-5486 (2014).
  40. Kawahara, R., et al. The complexity and dynamics of the tissue glycoproteome associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteom. 20, 100026(2021).
  41. Chau, T. H., Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Critical considerations in N-glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 73, 102272(2023).
  42. Carnielli, C. M., et al. Comprehensive glycoprofiling of oral tumors associates N-glycosylation with lymph node metastasis and patient survival. Mol Cell Proteom. 22 (7), 100586(2023).
  43. Sethi, M. K., et al. In-depth N-glycome profiling of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals cancer-, stage- and EGFR-specific protein N-glycosylation. Glycobiology. 25 (10), 1064-1078 (2015).
  44. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  45. Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wiśniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
  46. Tian, Y., Gurley, K., Meany, D. L., Kemp, C. J., Zhang, H. N-linked glycoproteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J Proteome Res. 8 (4), 1657-1662 (2009).
  47. Cozzolino, F., et al. New label-free methods for protein relative quantification applied to the investigation of an animal model of huntington disease. PLoS One. 15 (9), e0238037(2020).
  48. Sethi, M. K., et al. Quantitative proteomic analysis of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals signature proteins and perturbed pathways involved in CRC progression and metastasis. J Proteomics. 126, 54-67 (2015).
  49. Rosati, D., et al. Differential gene expression analysis pipelines and bioinformatic tools for the identification of specific biomarkers: A review. Comput Struct Biotechnol J. 23, 1154-1168 (2024).
  50. Niu, B., et al. Nonspecific cleavages arising from reconstitution of trypsin under mildly acidic conditions. PLoS One. 15 (7), e0236740(2020).
  51. Delafield, D. G., Li, L. Recent advances in analytical approaches for glycan and glycopeptide quantitation. Mol Cell Proteom. 20, 100054(2021).
  52. Viner, R. I., Snovida, S., Bodnar, E., Perreault, H., Saba, J. A novel workflow for glycopeptide analysis using cellulose-based separation cartridges, TMT-labeling and LTQ Orbitrap ETD. J Biomol Tech. 21 (3 Suppl), S25(2010).
  53. Kawahara, R., et al. Community evaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies for serum glycopeptide analysis. Nat Meth. 18 (11), 1304-1316 (2021).
  54. Polasky, D. A., Nesvizhskii, A. I. Recent advances in computational algorithms and software for large-scale glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 72, 102238(2023).
  55. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nat Meth. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  56. Goodson, H., et al. Α-mannosylated HLA-II glycopeptide antigens dominate the immunopeptidome of immortalised cells and tumour tissues. Glycobiology. 34 (11), cwae057(2024).
  57. Shajahan, A., Heiss, C., Ishihara, M., Azadi, P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 409 (19), 4483-4505 (2017).
  58. Rosenbalm, K. E., Tiemeyer, M., Wells, L., Aoki, K., Zhao, P. Glycomics-informed glycoproteomic analysis of site-specific glycosylation for SARS-CoV-2 spike protein. STAR Prot. 1 (3), 100214-100214 (2020).
  59. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  60. Chandler, K. B., et al. Multi-isotype glycoproteomic characterization of serum antibody heavy chains reveals isotype- and subclass-specific N-glycosylation profiles. Mol Cell Proteomics. 18 (4), 686-703 (2019).
  61. Haab, B. B., Klamer, Z. Advances in tools to determine the glycan-binding specificities of lectins and antibodies. Mol Cell Proteom. 19 (2), 224-232 (2020).
  62. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins. MAbs. 8 (3), 524-535 (2016).
  63. Goumenou, A., Delaunay, N., Pichon, V. Recent advances in lectin-based affinity sorbents for protein glycosylation studies. Front Mol Biosci. 8, 746822(2021).
  64. Parker, B. L., et al. Terminal galactosylation and sialylation switching on membrane glycoproteins upon TNF-alpha-induced insulin resistance in adipocytes. Mol Cell Proteomics. 15 (1), 141-153 (2016).
  65. Blazev, R., et al. Integrated glycoproteomics identifies a role of N-glycosylation and galectin-1 on myogenesis and muscle development. Mol Cell Proteomics. 20, 100030(2021).
  66. Thaysen-Andersen, M., et al. Human neutrophils secrete bioactive paucimannosidic proteins from azurophilic granules into pathogen-infected sputum. J Biol Chem. 290 (14), 8789-8802 (2015).
  67. Loke, I., Ostergaard, O., Heegaard, N. H. H., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Paucimannose-rich N-glycosylation of spatiotemporally regulated human neutrophil elastase modulates its immune functions. Mol Cell Proteom. 16 (8), 1507-1527 (2017).
  68. Loke, I., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Complementary LC-MS/MS-based N-glycan, N-glycopeptide, and intact N-glycoprotein profiling reveals unconventional ASN71-glycosylation of human neutrophil cathepsin g. Biomolecules. 5 (3), 1832-1854 (2015).
  69. Tjondro, H. C., et al. Hyper-truncated Asn355- and Asn391-glycans modulate the activity of neutrophil granule myeloperoxidase. J Biol Chem. 296, 100144(2021).
  70. Kawahara, R., et al. Glycoproteome remodeling and organelle-specific N-glycosylation accompany neutrophil granulopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (36), e2303867120(2023).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Microambiente tumoralespectrometr a de masasestructuras de glucanosperfilado del N glucoproteomacarbono graf tico porosoLC MS MSenriquecimiento de glucop ptidosglicosilaci n sitio espec ficatejido de c ncer colorrectal

Artículos relacionados