La medicina tradicional china (MTC) representa un rico tesoro de opciones de tratamiento natural y desempeña un papel importante en la atención de diversas necesidades de salud en todo el mundo. Este estudio presenta una investigación experimental exhaustiva sobre la extracción, separación y propiedades fisicoquímicas de la rutina, el componente activo clave de Flos sophorae immaturus.
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Artículo de método
Extracción y caracterización del flavonoide rutina de la medicina tradicional china Flos sophorae immaturus
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Resumen
Resumen
La medicina tradicional china (MTC) ha servido durante mucho tiempo como un rico repositorio de soluciones terapéuticas naturales, desempeñando un papel fundamental para abordar diversas necesidades de atención médica en todo el mundo. Entre las diversas hierbas utilizadas en la medicina tradicional china, Sophora flavescens es conocida por su amplia gama de propiedades medicinales. Su aplicación se remonta a siglos atrás y sigue siendo muy valorada en la medicina moderna, particularmente por sus beneficios terapéuticos en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. La rutina, un compuesto flavonoide bioactivo, está ampliamente distribuida en todo el reino vegetal, y la concentración más alta se encuentra en Flos sophorae immaturus. Se ha informado que la rutina reduce la permeabilidad y fragilidad capilar anormal y actúa como agente protector de los vasos cardiovasculares y cerebrovasculares. Este estudio presenta un protocolo experimental detallado para la extracción, separación y caracterización de las propiedades fisicoquímicas de la rutina derivada de Flos sophorae immaturus. Además, se presenta y describe el protocolo para la extracción de flavonoides de la MTC utilizando el método de extracción alcalina y precipitación ácida.
Introducción
Flos sophorae immaturus (FSI), el capullo de flor seco de Sophora japonica L., ha sido una piedra angular de la medicina tradicional china (MTC) durante siglos. Sus principales componentes activos incluyen rutina, isoquercitrina, Sophorae Flos y otros flavonoides y saponinas. Estos componentes confieren colectivamente una variedad de efectos farmacológicos, como eliminar el calor y desintoxicar, enfriar la sangre y la hemostasia, y reducir la presión arterial. En la práctica clínica, la FSI se valora principalmente por su capacidad para proteger la permeabilidad capilar1, mantener la función del sistema cardiovascular2, enfriar la sangre, detener el sangrado y regular el fuego hepático3. Sus propiedades terapéuticas se atribuyen a una alta concentración de rutina (quercetina-3-rutinósido), un flavonoide bioactivo que constituye hasta el 20%-30% de su peso seco4.
La rutina es un flavonoide ampliamente distribuido en las plantas. Su nombre químico es Que-3-O-rutina (C27H30O16) (Figura 1). A temperatura ambiente, la rutina aparece como un polvo cristalino de color amarillo claro a amarillo verdoso. Su punto de fusión varía con la forma y la pureza del cristal, y suele oscilar entre 125 °C y 195 °C. La rutina exhibe características polares pronunciadas: es ligeramente soluble en agua fría, altamente soluble en solventes orgánicos polares como etanol y metanol, y casi insoluble en solventes no polares como éter y cloroformo. Además, su solubilidad es sensible al pH y aumenta significativamente en condiciones alcalinas debido a la disociación de los grupos hidroxilo fenólicos formando sales de sodio o potasio. Estas propiedades físicas están estrechamente asociadas con los grupos polihidroxilo y glucósido en su estructura molecular5, influyendo directamente en su proceso de extracción y aplicaciones en medicina, alimentos y otras industrias6. La rutina, aunque es ubicua en las plantas, es más abundante en FSI y exhibe múltiples actividades farmacológicas, incluida la estabilización capilar7, antiinflamatoria, antioxidante8, antimicrobiana9 y efectos reguladores metabólicos10.
A pesar de su potencial clínico11, la escasa solubilidad y estabilidad acuosa de la rutina plantean desafíos para la extracción y formulación5. Para abordar estas limitaciones, el método de precipitación ácida de extracción alcalina (AEAP) ha surgido como una alternativa efectiva, aprovechando el comportamiento dependiente del pH de sus grupos hidroxilo fenólicos.
Basado en las propiedades físicas de la rutina, el método AEAP se ha convertido en una técnica estandarizada para aislar la rutina de la FSI, utilizando su solubilidad en soluciones alcalinas y su posterior cristalización en condiciones ácidas12. AEAP aprovecha la ionización conmutable por pH de los grupos hidroxilo fenólicos para mejorar el rendimiento y lograr una extracción de rutina de alta pureza de FSI. En condiciones alcalinas (pH >10), los grupos -OH fenólicos se desprotonan para formar iones -O- hidrófilos, lo que permite una solubilización completa de los tejidos vegetales y minimiza la degradación oxidativa. La acidificación a pH 2-3 revierte esta ionización, precipitando los fenólicos objetivo con una coprecipitación mínima de impurezas polares. Como polifenol con solubilidad dependiente del pH, la rutina se disuelve fácilmente en soluciones alcalinas (por ejemplo, hidróxido de sodio) pero precipita en condiciones ácidas debido a la protonación del grupo hidroxilo. AEAP proporciona una alternativa rentable, escalable y respetuosa con el medio ambiente, alineada con los principios de la química verde al evitar los disolventes tóxicos13. Refleja una tendencia más amplia en la química de productos naturales que favorece las técnicas de separación basadas en el pH14. Se emplean métodos comparables para aislar la curcumina (de la cúrcuma) y la berberina (de Coptis chinensis), aprovechando los cambios de solubilidad a valores específicos de pH para la extracción selectiva. El método AEAP es ideal para la producción de rutina de alto rendimiento a partir de fuentes ricas en flavonoides como FSI, que solo requiere equipo de laboratorio básico (por ejemplo, medidores de pH, centrífugas). Para matrices vegetales con bajo contenido de rutina o compuestos complejos que interfieren, se puede considerar en el futuro el pretratamiento de hidrólisis enzimática para mejorar la eficiencia de extracción.
En conclusión, AEAP representa un enfoque conveniente para la extracción de rutina, equilibrando eficacia, seguridad y escalabilidad. Su papel en la modernización de la medicina tradicional china destaca su potencial para unir las prácticas tradicionales con los estándares farmacéuticos contemporáneos.
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Protocolo
La rutina es un flavonoide que contiene múltiples grupos hidroxilo fenólicos y es soluble en soluciones alcalinas calientes, seguidas de acidificación y precipitación. Se puede extraer mediante el proceso de extracción alcalina-precipitación ácida. Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación experimental
- Obtenga los siguientes materiales: Flos sophorae immaturus (20 g), bórax (0,8 g), varios vasos de precipitados, polvo de cal (1,5 g), ácido clorhídrico concentrado, termómetro y tiras reactivas de pH. Consulte la Figura 2 para obtener una versión más grande de esta imagen.
2. Extracción de rutina
NOTA: Utilice una proporción de bórax a agua de 0,8 g de bórax por 200 ml de agua. Use una proporción de leche de lima de 1,5 g de polvo de cal por 10 ml de agua. Ajuste el pH de forma rápida y precisa. Reponga el agua perdida según sea necesario.
- Extracción alcalina
NOTA: Filtrar con papel de filtro redondo de 6 cm.- Agregue 250 ml de agua y 0,8 g de bórax a un vaso de precipitados de 500 ml. Caliente hasta que hierva, luego agregue 20 g de Flos sophorae immaturus. Continúe hirviendo durante 2-3 min.
- Después de hervir, ajuste el pH a 8-9 con leche de lima revolviendo. Continúe calentando durante 20 min. Filtrar a través de una gasa mientras está caliente para obtener un filtrado de color marrón amarillento.
- Extracción por precipitación ácida
- Ajuste el extracto a pH 2-3 con ácido clorhídrico concentrado y deje que se asiente. Un cambio de una solución clara de color marrón amarillento a una turbia, junto con la formación gradual de precipitado floculante de color amarillo anaranjado en el fondo del recipiente, indica una separación efectiva de la rutina.
- Después de reposar durante 6 h, someta el precipitado a filtración por succión a presión atmosférica. Recoger y secar para obtener rutina cruda.
NOTA: Corte la película filtrante de acuerdo con el tamaño del embudo Brinell utilizado (150 mm de diámetro). - Lave el precipitado con agua hasta que esté neutro durante la filtración por succión a presión atmosférica.
3. Refinación de la rutina
- Después de un pesaje grueso, recristalice la rutina con agua caliente en una proporción de solubilidad de 1:200. Hervir la solución acuosa durante 30 min y filtrar caliente. Asegúrese de que el volumen final de la solución de rutina sea de 210 ml.
- Filtra el residuo. Deje reposar el filtrado sin tocarlo, luego filtre nuevamente y seque al vacío en un horno a 60-70 ° C para obtener rutina refinada (Figura 3).
NOTA: Corte la película filtrante de acuerdo con el tamaño del embudo Brinell utilizado (150 mm de diámetro).
4. Identificación fisicoquímica de la rutina
- Reacción de clorhidrato-sal de magnesio: identificación de núcleos parentales flavonoides
- Disuelva 1-2 ml de la muestra en metanol y agregue 50 mg de magnesio en polvo.
- Agrega unas gotas de ácido clorhídrico concentrado. Agite suavemente. La solución debe volverse roja (Figura 4).
- Reacción de Molisch - identificación de compuestos de azúcar
- Agregue una solución de etanol al 10% de α-naftol y agite. Incline el tubo de ensayo y agregue con cuidado ácido sulfúrico concentrado gota a gota a lo largo de la pared interna.
- Observe la formación de un anillo marrón en la interfaz (Figura 5).
- Reacción verdeante de zirconio-ácido cítrico
- Agregue 1-2 ml de solución de α-naftol al 10% a la solución de etanol de la muestra. Agitar bien. Agregue lentamente 10 gotas de H2SO4 concentrado a lo largo de la pared del tubo sin agitar.
- Agregue una solución de metanol de ácido cítrico al 2%. El color de la solución debe aclararse (Figura 6).
- Discriminación de capa delgada
- Utilice tanto la rutina refinada como el estándar de rutina.
- Utilice cloroformo: metanol: ácido fórmico (15: 5: 1) como agente de desarrollo y una solución de etanol al 1% de AlCl3 como agente cromogénico. Observe la fluorescencia bajo una lámpara UV a 365 nm.
5. Examen TLC de rutina
NOTA: Se empleó un método de cromatografía en capa fina (TLC) para evaluar la pureza de la rutina. Se utilizó una placa de gel de sílice como fase estacionaria.
- Coloque la muestra de rutina refinada y el estándar de rutina (1 mg / ml en metanol) en la placa. Desarrollar la placa en una fase móvil compuesta por acetato de etilo:ácido fórmico:agua (8:1:1, v/v/v).
- Después del secado, visualice la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm.
- Calcule el factor de retención (Rf) del punto de muestra y compárelo con el estándar.
NOTA: Un solo punto con un valor de Rf idéntico (aproximadamente 0,35-0,50 en estas condiciones) indica alta pureza, mientras que los puntos adicionales sugieren la presencia de impurezas.
6. Determinación de la pureza de la rutina por HPLC
NOTA: La pureza de la rutina se analizó cuantitativamente mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Las condiciones de análisis fueron las siguientes: columna cromatográfica- (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); acetonitrilo (A) de fase móvil y solución acuosa de ácido acético al 0,2% (B). Programa de elución en gradiente lineal: 0-15 min, 20%-30% A; 15-30 min, 30%-60% A. Caudal-1 mL/min. Volumen de inyección-10 μL. Longitud de onda de detección-355 nm. Temperatura de la columna-40 °C.
- Pese con precisión 0,1 g de polvo de muestra de rutina y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 10 ml. Agregue 5,0 ml de solución de etanol al 60% y agite bien.
- Ajuste el baño de agua a temperatura constante o el horno de columna a 30 °C y haga ultrasonidos en la muestra durante 30 min.
- Centrifugar la muestra a 55.900 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Utilice el sobrenadante como solución de prueba para el análisis de HPLC.
7. Determinación de rutina por LC-MS
NOTA: Los compuestos aislados se identificaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Las condiciones de LC coincidieron con el método HPLC. La espectrometría de masas se realizó mediante ionización por electrospray (ESI) en modo de iones negativos con un voltaje capilar de 3,5 kV. Temperatura de desolvatación-350 °C; Rango de escaneo masivo-M/Z 100-1000.
- Pesar 10 mg de muestra de rutina purificada y transferirla a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Agregue 0,6 ml de DMSO deuterado con una pipeta hasta que la muestra se disuelva por completo. Prepare soluciones estándar de rutina utilizando el mismo procedimiento.
- Analice las muestras tratadas y los patrones mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones (RMN de 1H).
- Procesar los datos espectrales utilizando un software compatible15.
- Compare los datos espectrales con referencias bibliográficas o de bases de datos como NIST o PubChem para su verificación.
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Resultados
En el experimento de identificación fisicoquímica de rutina, la solución se volvió roja después de la adición de polvo de magnesio y una pequeña cantidad de ácido clorhídrico concentrado, seguido de agitación, lo que indica la presencia de un núcleo padre flavonoide. En la reacción de Molisch, se formó un anillo púrpura en la interfaz, lo que indica un resultado positivo y la presencia de restos de azúcar en la estructura molecular. La solución de muestra se volvió de color amarillo brillante tras la adición de un reacti...
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Discusión
La extracción de rutina se basa principalmente en el método de precipitación ácida de extracción alcalina (AEAP)6, que ofrece las ventajas de requisitos de equipo simples, facilidad de operación, alta eficiencia y bajo costo. Esta técnica a menudo se complementa con la extracción asistida por microondas (MAE)7 y la extracción asistida por ultrasonido (EAU)8, que reducen el consumo de reactivos, aceleran el tiempo de ...
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Divulgaciones
Los autores de este artículo declaran por la presente que han revelado todos y cada uno de los conflictos de intereses que puedan haber surgido en el curso de la realización de esta investigación y la redacción de este artículo. Confirmamos que no tenemos relaciones financieras, personales o profesionales que puedan sesgar nuestra interpretación de los resultados o conclusiones presentados en este trabajo. Específicamente, no tenemos vínculos con ninguna compañía farmacéutica, institución de investigación u otras entidades que puedan beneficiarse de los hallazgos informados aquí. Finalmente, afirmamos que nuestros hallazgos y conclusiones se basan únicamente en los datos y análisis presentados en este documento y no están influenciados por ningún factor externo. Seguimos comprometidos con los más altos estándares de integridad académica y conducta ética en todas nuestras actividades de investigación.
Agradecimientos
Nos gustaría expresar nuestra profunda gratitud al Laboratorio de Química Farmacéutica de la Universidad de Medicina China de Beijing por proporcionar la plataforma experimental. Su apoyo y recursos han sido invaluables en la realización de nuestras investigaciones y experimentos. Apreciamos profundamente su dedicación a la excelencia científica y su compromiso para fomentar el desarrollo de jóvenes investigadores.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-Naftol | MACKLIN | C16245764 | |
| Ácido acético | MACKLIN | C12662811 | |
| Acetonitrilo | MACKLIN | C16129374 | |
| Cloruro de aluminio | MACKLIN | C16485922 | |
| Ácido cítrico | MACKLIN | C16429480 | |
| DMSO | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20230306 | |
| Etanol | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20250102 | |
| Acetato de etilo | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20240318 | |
| Flos sophorae immaturus | Pekín Tongrentang | 10092026329782 | |
| Ácido fórmico | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20150402 | |
| MestReNova | Investigación Mestrelab | / | |
| Metanol | Innochem | C16365684 | |
| Gel de sílice 60F254 | STEEMA | 20210222 | |
| Xcalibur | Thermo Fisher Scientific | / | |
| Octahidrato de cloruro de circonilo | MACKLIN | C15350627 |
Referencias
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