Describimos un protocolo de transfección para producir células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) dirigidas a patógenos fúngicos utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente. Para evaluar la activación específica del antígeno, cocultivamos las células modificadas con tubos germinativos de Aspergillus fumigatus y medimos la secreción de IFN-γ.
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Artículo de método
Ingeniería de células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico dirigidas a infecciones fúngicas utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente
En este artículo
Resumen
Resumen
Las terapias celulares basadas en receptores de antígenos quiméricos (CAR) han demostrado una eficacia impresionante en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas. Recientemente, se están desarrollando estas terapias para enfermedades infecciosas, pero los estudios dirigidos a las infecciones fúngicas siguen siendo escasos. Para identificar objetivos óptimos y optimizar los productos celulares, desarrollamos un método para diseñar células asesinas naturales con receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) y evaluamos su respuesta a la estimulación por hongos. Este artículo describe un método sencillo y robusto para generar células CAR-NK adaptadas a objetivos fúngicos utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente. Las células NK-92 se transfectan con la transposasa hiperactiva SB100X vectorizada como ADN de minicírculo (MC) junto con un transposón CAR codificado por plásmido. La eficiencia de la transfección se evalúa 1 semana después mediante análisis de citometría de flujo. Antes de las pruebas funcionales, las células que expresan el transgén se enriquecen mediante clasificación celular activada magnéticamente y se cultivan durante 1 semana más. Para evaluar la activación específica del antígeno, las células modificadas se cocultivan con tubos germinativos de Aspergillus fumigatus durante al menos 6 h. Posteriormente, se mide la concentración del interferón-gamma secretado (IFN-γ) mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.
Introducción
El Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) es un hongo ubicuo, que en una persona promedio inhala entre 100 y 1.000 conidios a diario. En pacientes con inmunodeficiencias adquiridas o congénitas, como los que reciben quimioterapia o los que padecen leucemia, A. fumigatus puede provocar una apsergilosis invasiva grave. Cada año, más de 200.000 personas en todo el mundo contraen aspergilosis. A pesar del uso de antimicóticos para la prevención y el tratamiento con derivados azoles, la tasa de mortalidad se mantiene entre el 30% y el 95%2,3. Además, el tratamiento tiene efectos secundarios significativos, y el 7% de los cultivos de A. fumigatus ya son resistentes a los azoles4.
La terapia con células T modificadas con receptores de antígenos quiméricos (CAR) ha demostrado éxito clínico en el tratamiento de enfermedades malignas y ha logrado resultados preclínicos prometedores en la lucha contra enfermedades infecciosas como la aspergilosis invasiva 5,6,7,8. Nuestras células Af-CAR-T previamente descritas dirigidas a una proteína en la pared celular de las hifas de A. fumigatus han mostrado resultados prometedores en modelos preclínicos6.
La reducción del riesgo de enfermedad de injerto contra huésped, síndrome de liberación de citocinas y neurotoxicidad hacen que las células CAR-NK sean una alternativa valiosa a las células CAR-T como tratamiento "listo para usar" para las infecciones agudas9. Además, se ha demostrado que las células NK desempeñan un papel crucial en la respuesta inmunitaria antifúngica. Cuando se estimulan con A. fumigatus, las células NK secretan citocinas como IFN-ɣ y quimiocinas como CCL-3 y CCL-4 y liberan gránulos citotóxicos10,11.
La línea celular NK-92 es una fuente popular de células NK para ingeniería genética, ofreciendo la ventaja de una rápida proliferación y expansión en condiciones de cultivo relativamente simples12. Varios estudios preclínicos han demostrado el potencial terapéutico de las células NK-92 transducidas por CAR en el tratamiento de tumores hematológicos y sólidos. Se están llevando a cabo numerosos ensayos clínicos para investigar su seguridad, eficacia y posible uso como terapia celular "lista para usar"13.
Lograr altas eficiencias de transfección y una expresión estable de transgenes en células NK es un desafío. Si bien los métodos virales prometen altas eficiencias, conllevan el riesgo de mutaciones de inserción con oncogénesis posterior 9,14. La última generación de vectores de transposones de la Bella Durmiente (SB) ofrece un sistema seguro, potente y económicamente viable para la transferencia estable de genes, superando las limitaciones de los métodos de administración de genes virales y transitorios no virales15.
Por lo tanto, este protocolo describe una metodología novedosa para la generación de células Af-CAR-NK-92, que potencialmente puede servir como una opción terapéutica "lista para usar" para pacientes con aspergilosis invasiva potencialmente mortal. La eficacia de este enfoque se ejemplifica con el aumento de la producción de IFN-ɣ tras la estimulación con hifas de A. fumigatus .
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Protocolo
Todos los experimentos descritos aquí deben realizarse en condiciones estériles. En este protocolo, mostramos dos condiciones: (I) Simulacro de transfección sin ADN que servirá como control y (II) Transfección de CAR utilizando el Af-CAR6 descrito anteriormente. El plásmido Af-CAR contiene una secuencia truncada del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRt) aguas abajo del CAR, que se utilizará como marcador de transfección (Figura suplementaria S1). Para cada condición, se requieren 4 × 106 celdas NK-92.
1. Cultivo de las células NK-92
- Uno o dos días antes de la transfección, prepare un medio de cultivo celular fresco con la siguiente composición: 75% (v/v) de medio alfa-MEM (con nucleósidos) + 12,5% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor + 12,5% (v/v) de suero de caballo inactivado por calor + 2 mM de L-glutamina.
- Vuelva a suspender al menos 107 células NK-92 a una densidad de células de 5 × 105 células/ml.
- Agregue IL-2 a la suspensión celular a una concentración de 150 UI/mL.
- Cultivar las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
NOTA: La IL-2 se puede utilizar en una concentración final de 5 ng/mL.
2. Transfección no viral
- Verifique la calidad de las células bajo el microscopio. Una suspensión de grupos celulares y un fondo claro indican un cultivo celular sano.
- En una placa de 6 pocillos, agregue 2 mL de medio de cultivo celular por pocillo para cada condición. Coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
NOTA: Los antibióticos pueden reducir la viabilidad celular después de la transfección. Mantenga el medio libre de antibióticos. - Cuente las células y verifique la viabilidad celular usando (por ejemplo, tinción con azul de tripano).
- Transfiera 8 × 106 células NK-92 a un tubo de fondo cónico de 15 mL. Centrifugar a 200 × g durante 5 min con una aceleración y deceleración de 3. Utilice este programa para todos los siguientes pasos de centrifugación.
- Durante la centrifugación, prepare dos tubos de reacción de 1,5 mL. Pipetee el ADN de Af-CAR (8 μg de ADN plasmídico y 4 μg de SB100X Mini Circle, Tabla 1) en uno de los tubos. Mantenga el segundo libre de ADN para que sea un control simulado.
- Cuando la centrífuga esté lista, deseche suavemente el sobrenadante y llene el tubo que contiene las células con hasta 15 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada.
- Centrífuga (paso 2.4).
- Durante la centrifugación, prepare un tubo del sistema de transfección para cada condición agregando 3 mL de tampón electrolítico en cada tubo. Coloque el primer tubo en la estación de pipetas.
- Cuando la centrífuga esté lista, deseche suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celdas en 200 μL de tampón de resuspensión (100 μL/4 × 106 celdas).
NOTA: Evite dejar las células en tampón de resuspensión durante más de 15-30 minutos, ya que esto reduce la viabilidad de las células y la eficiencia de la transfección. - Añadir 100 μL de la suspensión celular en cada uno de los dos tubos de reacción. Mezclar suavemente.
NOTA: Evite las burbujas de aire durante el pipeteo, ya que las burbujas de aire causan arcos eléctricos, lo que conduce a la muerte celular. - Pipetear la mezcla de ADN y células del primer tubo de reacción con la pipeta del sistema de transfección e insertar la pipeta verticalmente en el tubo colocado en la estación de pipetas.
NOTA: Asegúrese de que la punta encaje correctamente. - Ajuste el primer pulso a 1.650 V y el tiempo de pulso a 20 ms y pulse Start.
- Una vez finalizado, ajuste el segundo pulso a 500 V y el tiempo de pulso a 100 ms. Presione Inicio.
- Una vez finalizado, retire lentamente la pipeta de la estación de pipetas e inmediatamente transfiera las células a un pocillo de la placa de cultivo preparada que contenga 2 mL de medio de cultivo celular precalentado (consulte el paso 2.2). Mueva suavemente la placa en círculos para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente.
- Para la muestra simulada, tome 100 μL de la suspensión celular del tubo de reacción sin ADN (consulte el paso 2.9) y repita el mismo procedimiento desde el paso 2.11 hasta el paso 2.14, utilizando un nuevo tubo y una nueva punta de pipeta.
- Incubar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
- Después de 30 minutos de incubación, agregue IL-2 a una concentración final de 150 UI/mL.
3. Comprobación de la eficiencia de la transfección mediante citometría de flujo
- Después de 1 semana de cultivar y dividir las células cada dos días, tome de 1 a 5 × 105 células de cada condición en un tubo de poliestireno de fondo redondo.
- Lave las células añadiendo 1 mL de tampón (PBS + 0,5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA); centrifugar y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 50 μL de tampón. Agregue 1 μL de 7-AAD para detectar las células muertas.
- Añadir 5 μL de anticuerpo anti-tEGFR-Alexa fluor 647 para teñir las células transfectadas.
- Incubar durante 20 min a 4 °C.
- Lave las celdas (consulte el paso 3.2).
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 200 μL de tampón.
- Mida las muestras en un citómetro de flujo.
NOTA: Si la eficiencia de la transfección no es satisfactoria, proceda con el enriquecimiento de las células que expresan transgén.
4. Enriquecimiento de células que expresan transgenes mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)
NOTA: Para obtener resultados óptimos, inicie el protocolo con 8-10 × 106 celdas. Todas las etapas de centrifugación se realizan a 4 °C.
- Prepare el búfer como se describe en el paso 3.2. Diluir las células a una concentración de 1-2 × 106/100 μL con el tampón en un tubo de fondo cónico de 15 mL.
- Agregue 1 μL de anti-EGFRt-biotina por 1-2 × 106 células, y agite suavemente el tubo para asegurar una solución distribuida uniformemente.
- Incubar durante 25 minutos a 4 °C y, a continuación, llenar el tubo con hasta 10 ml de tampón.
- Centrífuga. Deseche el sobrenadante.
- Añadir 8 μL/1 × 106 celdas de tampón frío.
- Añadir 2 μL de perlas magnéticas anti-biotina por 1 × 106 células.
- Incubar durante 15 min a 4 °C.
- Lavar llenando hasta 10 ml con tampón.
- Centrífuga. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón.
- Coloque una columna LS en el imán MACS y lave con 3 mL de tampón.
- Tan pronto como el búfer haya migrado completamente a través de la columna, agregue la suspensión de celdas.
- Lave la columna 3 veces, cada una con 3 mL de tampón.
- Retire la columna del imán y colóquela en un tubo inferior cónico limpio de 15 ml.
- Agregue 5 mL de tampón a la columna. Con el émbolo, enjuague las células positivas para EGFR lo más rápido posible.
- Cultivar las células durante unos días; A continuación, compruebe la eficiencia mediante citometría de flujo.
5. Pruebas funcionales
NOTA: Para el próximo experimento, prepare y use el siguiente medio: RPMI + 20% FBS.
- Día 1 - Siembra de conidios de Aspergillus fumigatus
- Prepare una suspensión de conidios de A. fumigatus a una concentración de 2,5 × 105 conidios/mL en el medio.
- En una placa de cultivo de 96 pocillos, pipetear 100 μL de la suspensión de conidios por pocillo e incubar a 25 °C durante 16 h.
NOTA: Después del período de incubación, los conidios germinarán (Figura 1).
- Día 2 - Cocultivo con células CAR NK-92
- Lave las celdas Mock y Af-CAR NK-92 2 veces con el medio.
- Co-cultivo con el hongo en una proporción efector-objetivo de 2:1 mediante la adición de 5 × 104 células en 100 μL de medio por pocillo (Figura 2).
- Para un control positivo, agregue 1 ng de PMA y 100 ng de ionomicina por pocillo en 100 μL de medio. Use las celdas en el medio solo como un control negativo.
- Incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 durante al menos 6 h.
- Centrifugar la placa a 300 × g durante 5 min.
- Coseche 100 μL de cada pozo; Evite tocar la parte inferior. Transfiera los sobrenadantes a los tubos de reacción.
NOTA: Asegúrese de que solo se pipetee el sobrenadante y no el hongo crecido. En caso de duda, agregue otro paso de centrifugación. - Realice IFN-ɣ ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante o almacene las muestras a -80 °C hasta su uso.
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Resultados
Todo el proceso de generación de células Af-CAR NK-92, incluida la transfección, la recuperación, el enriquecimiento y la expansión, dura aproximadamente 14 días. Después de la transfección, las células se cultivan y se dividen cada dos días. La viabilidad celular puede disminuir durante la primera división dos días después de la transfección. Típicamente, las células se recuperan 4 días después de la transfección y comienzan a proliferar, con un tiempo de duplicación de 48 h.
Después de la re...
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Discusión
El protocolo proporcionado ofrece un método simple y confiable para crear células CAR-NK que se dirigen a patógenos fúngicos utilizando el sistema de transposones no viral de la Bella Durmiente. Este método permite la inserción estable y permanente de transgenes de gran tamaño, lo que posibilita la expansión de las células para obtener las cantidades necesarias para su posterior análisis14,16.
Varios f...
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Divulgaciones
M.H.: Inventor en solicitudes de patentes y patentes concedidas relacionadas con la tecnología CAR, licenciadas en parte a la industria. Cofundador y accionista de T-CURX GmbH, Würzburg. Ponentes honorarios: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Apoyo a la investigación: BMS. M. B. informa sobre el apoyo para viajes de la compañía farmacéutica "Eli Lilly and Company", que no está relacionado con este estudio. Los demás autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
La financiación y el apoyo al proyecto fueron proporcionados por Wilhelm Sander Stiftung, proyecto 2020.017.1 a M.H., y J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Centro de Investigación Colaborativa/Transregio 124 Hongos patógenos y su huésped humano: Redes de interacción-FungiNet; proyecto A8 a M.H. y H.E.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de fondo cónico de 15 ML | Greiner Bio-One | 188271 | PP, 17/120 MM, CELLSTAR, ESTÉRIL Tubos |
| fondo cónico de 50 ML | Greiner Bio-One | 227270 | PP, 30/115 MM, CELLSTAR, ESTÉRIL |
| placa de cultivo celular de 6 y 96 pocillos | Corning Inc. LifeSciences | 83-3736/ 83-3474 | Placas de pocillos múltiples tratadas con TC, fondos planos, Tratados para una fijación óptima de las células, Esterilizado por irradiación gamma, BD |
| Biosciences | 559925 | colorante de ácido nucleico fácil de usar para la exclusión de células no viables en ensayos de citometría de flujo | |
| Alexa Fluor 647 anti-EGFR humano | Biolegend | 352918 | clon de Biolegend AY13 |
| MicroBeads anti-biotina | Miltenyi Biotec | 13-105-637 | MicroBeads ultrapuras conjugadas con anti-biotina de ratón monoclonal anticuerpos |
| Aspergillus fumigatus | ATCC | 46645 | |
| Biosphere Puntas de filtro (20 y 100 μ L) | Sarstedt | 70.3030.365 / 70.3030.275 | |
| Dulbecco′ s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Modificado, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular, endotoxina, probado |
| ELISA MAX Deluxe Set IFN-& gamma humano; | Biolegend | 430104 | |
| Solución salina disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | para biología molecular, 0.5 M en H2O, DNasa, RNasa, NICKasa y proteasa, no se detectó ninguna, 0,2 μ m filtrado. |
| FACS clean | BD Biosciences | 340345 | |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS Solución de enjuague BD | Bioscience | 340346 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | estéril filtrado, apto para cultivo celular, inactivado por calor antes de usar |
| Gibco, MEM α, nucleósidos | Thermofisher Scientific | 22571020 | Rojo de fenol, ribonucleósidos, desoxirribonucleósidos, bicarbonato de sodio |
| Suero de caballo | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Estéril Filtrado, inactivado por calor antes de usar |
| IL-2 IS humano, grado de investigación | Miltenyi Biotec | 130-097-742 | Grado de investigación. El ED50 es ≤ 0,3 ng/mL, correspondiente a una actividad de ≥ 3 y veces; 106 UI/mg. |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | de Streptomyces conglobatus, utilizada como control positivo para la secreción de citocinas |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | W368401 | para cultivo celular |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Columnas y émbolos, embalados estériles |
| NK-92 | DSMZ | ACC 488 | |
| Neon Transfektionssystem 100 μ L-Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Tampón de resuspensión R, Tampón electrolítico E2, 100 μ L Puntas de neón, tubos de electroporación de neón |
| Phorbol-12-myristat-13-acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | utilizado como control positivo para la secreción de citocinas |
| Tubo de poliestireno de fondo redondo, 5 mL | BD Bioscience | S-452400 | utilizado para citometría |
| de flujo Tubo de reacción, 1,5 ML | Greiner Bio-One | 7,26,90,001 | PP, transparente, tapón adherido, con graduación inyectada. Esterilizado antes de usar. |
| RPMI 1640 Medio, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 72400021 | GlutaMax I, Rojo de fenol, HEPES, TipOne |
| 1000 con filtro estéril μ L XL Punta de filtro graduada | StarLab | S1122-1730 | |
| Equipment | |||
| BD FACSCalibur | BD Bioscience | ||
| CO2 Incubadora C60 | Labotect | ||
| Heraeus Multifuge 3SR | Thermo Scientific | ||
| HydroFLEX lavadora de microplacas | Tecan | ||
| NanoQuant Infinite M200 Pro | Tecan | ||
| Neon Transfection System | Invitrogen | ||
| Pipetas | Separador Eppendorf | ||
| Quadro MACS | Miltenyi Biotec |
Referencias
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