Artículo de método

Fabricación de dispositivos de fijación de electroacupuntura de ratón para el pretratamiento de electroacupuntura en el modelo de ratón de miocardiopatía diabética

DOI:

10.3791/67427

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18 de abril de 2025

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1College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Acupuncture, Affiliated Hospital of Hubei University of Chinese Medicine, 4Hubei Province Academy of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para establecer un modelo de ratón de miocardiopatía diabética y un dispositivo de fijación de electroacupuntura de ratón para el uso de la electroacupuntura en ratones, que puede fijar a los ratones más suavemente durante el tratamiento.

Resumen

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La miocardiopatía diabética (MCD) es una complicación de la diabetes que puede progresar a insuficiencia cardíaca y está limitada por el uso de medicamentos. La electroacupuntura es una forma eficaz como método de tratamiento externo de la medicina tradicional china para tratar la miocardiopatía diabética. Un dispositivo de fijación de electroacupuntura para ratones puede fijar fácil y suavemente a los ratones durante el tratamiento de electroacupuntura y exponer los puntos de acupuntura en el abdomen y las extremidades de los ratones. Este artículo describe los métodos utilizados para fabricar el dispositivo de fijación de electroacupuntura de ratón con todos los pasos y precauciones, estableciendo un modelo de ratón de miocardiopatía diabética con medidas integrales para registrar de manera integral los cambios en los índices bioquímicos de la sangre, como la glucosa en la sangre. El experimento se realizó con 3 grupos: un grupo de control, un grupo modelo y un grupo de pretratamiento, con 10 ratones en cada grupo. El grupo de pretratamiento fue tratado con puntos de acupuntura Biaoben, electroacupuntura, pretratamiento una vez cada día alterno durante un total de 7 sesiones. Después de la electroacupuntura, los ratones del grupo previo al tratamiento mostraron una disminución de la glucosa en sangre acompañada de una reducción de los síntomas de la diabetes.

Introducción

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La miocardiopatía diabética (MCD) es una complicación común de la diabetes mellitus caracterizada por cambios en la estructura cardíaca y en la función diastólica y contráctil ventricular de una lesión específica, que se convierte en insuficiencia cardíaca. Es una de las principales causas de muerte en pacientes con diabetes mellitus 1,2, y su creciente prevalencia ha atraído una amplia atención en los últimos años3. Se ha encontrado que la patogenia de esta enfermedad incluye principalmente resistencia a la insulina, respuesta inflamatoria, metabolismo anormal de los lípidos, estrés oxidativo, daño mitocondrial 4,5.

En la actualidad, el tratamiento clínico de la miocardiopatía diabética se basa principalmente en la medicación oral para controlar la glucemia y aliviar los síntomas de la cardiopatía, pero tiene ciertas limitaciones, como reacciones medicamentosas, efectos de la función renal y dependencia de medicación a largo plazo6. La acupuntura, como método de tratamiento externo de la medicina tradicional china, tiene un mejor efecto regulador sobre la glucosa en sangre, los lípidos en sangre y la respuesta inflamatoria en pacientes con miocardiopatía diabética, y la eficacia clínica es notable7. La acupuntura no tiene efectos negativos sobre las funciones gastrointestinales y renales, y el tratamiento a largo plazo no produce dependencia. La teoría de los puntos de acupuntura de Biaoben es un método importante para seleccionar y utilizar los puntos de acupuntura en la teoría tradicional de la acupuntura8. Define los puntos de acupuntura que pueden mejorar los síntomas de las enfermedades como puntos de acupuntura Biao, y los puntos de acupuntura que pueden regular las funciones básicas del cuerpo relacionadas con las enfermedades y tratar las causas fundamentales de las enfermedades se denominan puntos de acupuntura Ben. La estimulación de los puntos de acupuntura de Biao y los puntos de acupuntura de Ben al mismo tiempo que la acupuntura puede lograr el propósito de tratar las enfermedades, así como aumentar la resistencia del cuerpo a las enfermedades y prevenir la exacerbación y recurrencia de las enfermedades. Puede prevenir el agravamiento y la recurrencia de la enfermedad. La investigación moderna ha demostrado que la acupuntura con puntos de acupuntura Biaoben es efectiva para la diabetes y sus muchas complicaciones, incluyendo la enfermedad cardíaca diabética, la nefropatía diabética, la retinopatía diabética, el pie diabético, etc.10,11. Un esquema de selección de puntos de acupuntura en línea con la teoría de los puntos de acupuntura de Biaoben es seleccionar PC6 (Neiguan), que puede regular las funciones del corazón y mejorar la respuesta inflamatoria como el punto de acupuntura de Biao12, y ST36 (Zusanli), que puede mejorar la glucosa en sangre y la situación del azúcar en sangre, mejorar la resistencia a la insulina y reducir el estrés oxidativo, como el punto de acupuntura de Ben13.

Los modelos animales son una herramienta importante en el estudio de la miocardiopatía diabética porque se ha demostrado experimentalmente que los modelos de rata o ratón imitan bien las anormalidades estructurales y los cambios funcionales del corazón causados por la miocardiopatía diabética y proporcionan las muestras necesarias para los índices de detección bioquímica de la miocardiopatía diabética14,15. El uso de piensos con alto contenido de azúcar y grasa combinados con solución de estreptozotocina para inducir ratones puede conducir a la formación de modelos diabéticos en 4-5 semanas, acortando efectivamente el tiempo de modelado y mejorando la tasa de éxito, y no existen requisitos especiales para el entorno de cría16,17. La miocardiopatía diabética es un tipo de miocardiopatía causada por el daño a la estructura y función cardíaca causado por la hiperglucemia continua. Con la prolongación del curso de la enfermedad, el modelo de cardiopatía diabética puede ser desarrollado naturalmente por el modelo diabético bajo hiperglucemia a largo plazo 18,19,20. El pretratamiento de acupuntura se refiere al pretratamiento de ratones después de la formación de diabetes y antes de la formación de una lesión miocárdica evidente. Sin embargo, después de la estimulación experimental repetida, los ratones a menudo se vuelven móviles y difíciles de inmovilizar, y las técnicas de manipulación experimental violentas pueden causar lesiones a los ratones o hacerlos maníacos o deprimidos. Por lo tanto, se necesita un método adecuado para inmovilizar a los ratones. Los métodos comúnmente utilizados para la inmovilización del ratón incluyen la anestesia y el vendaje22. Aunque el método de anestesia puede exponer mejor los puntos de acupuntura, puede afectar la conducción nerviosa y, en última instancia, afectar los resultados experimentales. El método de vendaje es un método de inmovilización física y no produce los mismos efectos fisiológicos que la anestesia, pero los ratones atados experimentarán una tensión significativa, un aumento del tono muscular y una mayor defecación22,23. Además, la aguja no puede alcanzar fácilmente la posición deseada. Aquí, presentamos un dispositivo de fijación de electroacupuntura para ratones que se puede usar para garantizar que los ratones no se muevan y también exponer los puntos de acupuntura durante el tratamiento de electroacupuntura para que el tratamiento de electroacupuntura se pueda realizar de manera conveniente, segura, no violenta y sin secuelas.

Este artículo describe en detalle la fabricación del dispositivo de fijación de electroacupuntura para ratones y el establecimiento de un modelo de ratón de miocardiopatía diabética. Tratamos la miocardiopatía diabética mediante el pretratamiento de electroacupuntura con puntos de acupuntura de Biaoben, demostramos cómo se realizaba su funcionamiento en el dispositivo de fijación de ratones y evaluamos el efecto terapéutico del pretratamiento con electroacupuntura de Biaoben sobre la miocardiopatía diabética mediante la medición de índices relacionados con el metabolismo de los glicolípidos.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales cumplen con el principio de las 3R de ética animal y han sido revisados y aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Hubei (autorización ética número HUCMS00309300). Aquí, se obtuvieron 30 ratones de grado SPF del Centro Provincial de Control y Prevención de Enfermedades de Hubei (certificado de calidad NO.42010200009690).

1. Fabricación del dispositivo de fijación de electroacupuntura

  1. Para el montaje de un dispositivo de fijación de electroacupuntura, obtenga un tubo de plástico hueco acrílico transparente y un instrumento de terapia de electroacupuntura como cuerpo principal (Figura 1A). En el tubo, mantenga un cuerpo de tubo y prepare lengüetas de cierre ubicadas en las aberturas en cada extremo. Haga ranuras en el tubo hueco en el centro de cada extremo y asegure las lengüetas de cierre en las ranuras de cada extremo con tornillos giratorios manualmente.
  2. En el centro del tubo hueco, haga tres agujeros ovalados de unos 2 cm de largo y 1 cm de ancho distribuidos uno al lado del otro. Los orificios en ambos lados se usan para sacar las extremidades delanteras del ratón para la fijación para el tratamiento de electroacupuntura de las extremidades anteriores, y el orificio en el medio se puede usar para exponer los puntos de acupuntura de las regiones torácica y abdominal del ratón para el tratamiento de electroacupuntura de las regiones torácica y abdominal.
  3. En el extremo del tubo hueco, haga un orificio ovalado distribuido simétricamente a ambos lados de la ranura central, que se puede usar para sacar las extremidades traseras del ratón para el tratamiento de electroacupuntura de las extremidades traseras (Figura 1B).
  4. Verifique la integridad del tubo de plástico hueco e instale las lengüetas de cierre. Mueva las lengüetas de cierre en el cuerpo del tubo a medida que los tornillos se deslizan en las ranuras, asegurándose de que pueda ajustar la longitud de fijación para adaptarse a la longitud del mouse.
  5. Encienda el instrumento de terapia de electroacupuntura y asegúrese de que esté operativo. Cada botón se puede ajustar presionándolo una vez (Figura 1C).
  6. Prepare el instrumento de terapia de electroacupuntura que se colocará junto a los tubos de plástico huecos para realizar tratamientos de electroacupuntura en ratones. El instrumento de terapia de electroacupuntura consta de una máquina de terapia de electroacupuntura y varios pares de clips energizantes; Cada par de clips energizantes puede proporcionar dos polos de energización.
  7. Cuando use los clips para sujetar el mango de la aguja para energizar la aguja, use un clip para fijar la aguja.
  8. La máquina de terapia de electroacupuntura tiene 11 botones. Use los 5 superiores para establecer la frecuencia, el tiempo y la forma de onda de la electroacupuntura y se usan de izquierda a derecha para la frecuencia, el tiempo, la onda continua, la onda dispersa y densa y la onda intermitente. Utilice los 6 inferiores para establecer la intensidad actual de la electroacupuntura. Cada uno de estos botones tiene una muesca debajo para colocar clips energizantes; El número de clips energizantes puede aumentar o disminuir con el número de ratones, hasta un máximo de 6.

2. Establecimiento de un modelo murino de miocardiopatía diabética

  1. Divida los 30 ratones en 3 grupos por el método de la tabla de números aleatorios: un grupo de control, un grupo modelo y un grupo de pretratamiento, con 10 ratones en cada grupo. Sujetar a un total de 20 ratones en el grupo modelo y en el grupo de pretratamiento para establecer el modelo de miocardiopatía diabética. Trate al grupo de pretratamiento con electroacupuntura de puntos de acupuntura Biaoben.
    NOTA: El modelo se construyó durante un largo período de tiempo y se desarrolla una miocardiopatía significativa después de 16 semanas. Nuestro tiempo de tratamiento es desde el día 36 hasta el día 70 (semana 6 a semana 10). Este tratamiento se seleccionó después del establecimiento de la diabetes, pero antes de un daño miocárdico significativo. Al final de las 6 semanas, se extirpó el corazón del ratón y se encontró que tenía miocardiopatía diabética significativa. Por lo tanto, la selección del tratamiento en este momento pertenece a la categoría de pretratamiento.
  2. Alimente a los ratones del grupo de control con comida normal durante 16 semanas. Alimente a los ratones del grupo modelo y del grupo de pretratamiento con una dieta alta en grasas y azúcares durante 16 semanas para inducir un estado metabólico muy parecido a la enfermedad diabética. La composición del alimento con alto contenido de grasa y azúcar es 67.0% de comida estándar, 10.0% de manteca de cerdo, 2.5% de colesterol, 20.0% de sacarosa y 0.5% de sales biliares.
  3. Inyectar solución de estreptozotocina por vía intraperitoneal para establecer un modelo de miocardiopatía diabética en ratón.
    1. Prepare la solución al 1% de estreptozotocina el día 29. Disuelva la estreptozotocina en un tampón preparado mezclando ácido cítrico con citrato trisódico (pH = 4,4).
    2. Proporcione solo agua y nada de comida durante 12 h el día 29. A continuación, administre a cada ratón una única inyección intraperitoneal de 150 mg/kg de solución de estreptozotocina como se describe a continuación.
    3. Agarra al ratón por la cola con la mano derecha y sácalo de la jaula. Coloca al ratón en la superficie de la jaula y tira suavemente de su cola hacia afuera. Inmoviliza el ratón con la mano izquierda y gíralo para exponer el abdomen.
    4. Inyectar al ratón por vía intraperitoneal con la mano derecha una jeringa de 1 ml preparada con la cantidad adecuada de la solución de estreptozotocina ya extraída del tratamiento.
  4. Realizar el tratamiento de acupuntura mediante puntos de acupuntura Biaoben.
    1. Seleccione los puntos de acupuntura de acuerdo con la teoría de los puntos de acupuntura de Biaoben13 , incluidos los bilaterales PC6 y ST36. Para el grupo de pretratamiento, realice la acupuntura el día 36, una vez cada dos días para un total de 18 tratamientos, con una duración total de 5 semanas (desde el día 36 hasta el día 70; Figura 2).
      1. Punto de acupuntura de Biao: Seleccione PC6 bilateral como punto de acupuntura de Biao; el PC6 se localiza en el lado medial de la extremidad anterior, entre las suturas cubital-radiales a unos 3 mm de las articulaciones de la muñeca. Punto de acupuntura de Ben: Seleccione ST36 bilateral como puntos de acupuntura de Ben; el ST36 se localiza en la cara posterior-lateral de la articulación de la rodilla, aproximadamente 2 mm por debajo de la tuberosidad del peroné.
    2. Agarra al ratón, pellizca su cola y colócalo en la superficie de la jaula. Mantenga la boca del tubo de plástico hueco acrílico en un ángulo de 30° con respecto al plano horizontal, con el pequeño orificio en el centro mirando hacia el suelo y la boca del tubo alineada con la cabeza del ratón.
    3. Acomoda la cabeza del ratón a la boca del tubo. Gire lentamente la cabeza del mouse en el tubo con un movimiento voluntario y un ligero empujón. Golpee suavemente las nalgas del ratón para que el ratón sea empujado de forma autónoma y completa dentro del tubo.
    4. Ajuste las lengüetas de cierre, levante la cola del mouse fuera de la ranura, apriete la tuerca y use las pestañas de cierre en los extremos superior e inferior para restringir el movimiento del mouse. En este punto, el ratón ya no puede moverse libremente en el cuerpo del tubo.
    5. Use pinzas para sacar suavemente las cuatro extremidades del ratón de cada uno de los cuatro agujeros pequeños a ambos lados. Después de sacar las cuatro extremidades de los pequeños orificios, asegúrelas suavemente al exterior del cuerpo del tubo. En este punto, las cuatro extremidades del ratón ya no podían ser desplazadas.
    6. Sujete el mango de la aguja desechable de acero inoxidable (0,3 mm x 13 mm) con el pulgar y el índice de la mano derecha y sujete el tubo acrílico y los ratones inmóviles con la mano izquierda.
    7. Toque y localice dónde se encuentran PC6 y ST36 con el dedo medio de la mano derecha, luego pinche suavemente la piel del ratón con la punta de la aguja. Inserte rápidamente la aguja inyectada oblicuamente alrededor de 3 mm y retire rápidamente la mano derecha.
  5. Realizar el pretratamiento de electroacupuntura
    1. Encienda la máquina de terapia de electroacupuntura y ajústela a onda intermitente, 1 Hz. Para cada ratón, realice un tratamiento de electroacupuntura durante 15 min.
    2. Utilice el clip energizado a juego de la máquina de terapia de electroacupuntura para sujetar el mango de la aguja, un clip por un mango de aguja.
    3. Ajuste la corriente del botón con el clip conectado a 1 mA (Figura 3).
    4. Espere 15 min y observe el estado de los ratones durante el pretratamiento de electroacupuntura.
    5. Al final del tratamiento, suelte el clip y retire la aguja de acupuntura. Ajuste las lengüetas de cierre y libere a los ratones del dispositivo de fijación de electroacupuntura.
    6. Examine todo el cuerpo de los ratones y observe si los ratones están heridos o tienen alguna anomalía.
  6. Realice tratamientos de acupuntura cada dos días después de 7 días de inyección de solución de estreptozotocina para un total de 18 tratamientos en un dispositivo de electroacupuntura de ratón desde el día 36 hasta el día 70.
  7. Fin del experimento el día 112 (final de la semana 16).
    1. Anestesiar mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2% y confirmar la anestesia mediante respuesta de pinzamiento de los dedos del pie. Mida la función cardíaca de los ratones mediante una ecocardiografía.
      1. Registre el diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDD), el diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo (LVESD), la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) y el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS).
    2. Eutanasia de los ratones por luxación cervical. Retirar el corazón, lavar con solución salina fisiológica y sumergir en paraformaldehído al 4%.

3. Tinción con hematoxilina-eosina (HE)

  1. Deshidratar, incrustar, cortar, desparafinar el corazón y realizar la tinción HE según el procedimiento estándar.
  2. Observe los cambios patológicos del tejido del corazón del ratón bajo un microscopio óptico.

4. Observaciones en ratones

  1. Mida el azúcar en la sangre con un medidor de glucosa en la sangre los días 27, 36 y 49.
  2. Observe cuánto comen los ratones, cuantifique su ingesta de agua y volumen de micción todos los días y registre sus cambios de peso.

5. Análisis estadístico

  1. Recopile datos de glucosa en sangre y utilice el ANOVA de un factor para identificar la significación estadística. Establecer la significación estadística como p < 0,05.
  2. Cuantificar los datos por asistentes que son ciegos a las condiciones experimentales. Expresa los datos como media ± desviación estándar.

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Resultados

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Seguimos el procedimiento descrito anteriormente y establecimos un modelo murino de miocardiopatía diabética. Como se puede observar en las imágenes teñidas con HE (Figura 4), los ratones del grupo control tenían una estructura de tejido miocárdico intacta, una disposición regular de los cardiomiocitos y ninguna lesión evidente. En el grupo modelo, las células miocárdicas estaban dispuestas de forma irregular, algunas células miocárdicas estaban dañadas y desintegradas (flecha negra) y se ob...

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Discusión

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En este estudio, los ratones que tenían glucosa alta en sangre y mostraban signos de diabetes fueron obtenidos por inyección intraperitoneal de la solución de estreptozotocina, que es un método eficaz y reconocido de modelado27. PC6 fue seleccionado como el punto de Biao, y ST36 fue seleccionado como el punto de Ben de acuerdo con la teoría de los puntos de acupuntura de Biaoben28. Todos estos puntos se encuentran en las extremidades del ra...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención del proyecto conjunto de la Fundación de Ciencias Naturales de Hubei 2022CFD024; Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, No. 81704142; Universidad de Medicina Tradicional China de Hubei 2023 doble proyecto de investigación científica especial clave de construcción de primera clase,2023ZZXT005; Estudiar el mecanismo del precondicionamiento de la electroacupuntura de los puntos de acupuntura de Biaoben en la regulación de la ferroptosis de las células miocárdicas en ratas con lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (MIRI) en el marco del proyecto clave de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Hubei,ZY2025D001; Proyecto de Innovación del Conocimiento de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Wuhan, No. 2023020201010172; Proyecto de ingeniería de talento de Hubei Shi Zhen, E Wei Han [2024]256.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
acrílico de plástico huecoHenan ZhikeZK-GDQ
aguja de acupunturaHwato0,3 mm x 13 mm
C57BL/6  ratonesCentro Provincial de Hubei para el Control y la Prevención de Enfermedades
ácido cítrico monohidratoSigmaC1909
instrumento de terapia de electroacupunturaHwatoSDZ-V
balanza electrónicaHenan ZhikeZK-DST
medidores de glucosaLifeScanOneTouch VerioVue
tira reactiva de glucosaLifeScanOneTouch Verio
estreptozotocinaCitratoS0130
DihidratoPinzas SigmaW302600
Labshark130302001
trisódico Sigma

Referencias

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