Fabricación y etiquetado de microburbujas con trazadores fluorescentes y radiactivos

Resumen

Este protocolo describe la fabricación de microburbujas lipídicas y un método compatible de radioetiquetado de microburbujas de un solo recipiente con una eficiencia de etiquetado del >95% sin purificación que conserva las propiedades fisicoquímicas de las microburbujas. Este método es eficaz en diversas formulaciones de microburbujas lipídicas y puede adaptarse para generar microburbujas radiactivas y/o fluorescentes.

Resumen

Las microburbujas son partículas llenas de gas con cáscara de lípidos que han evolucionado de agentes de contraste de ultrasonido vascular a plataformas revolucionarias de terapia contra el cáncer. Cuando se combinan con el ultrasonido terapéutico focalizado (FUS), pueden superar de manera segura y local las barreras fisiológicas (por ejemplo, la barrera hematoencefálica), administrar medicamentos para cánceres que de otro modo serían inaccesibles (por ejemplo, glioblastoma y cáncer de páncreas) y tratar enfermedades neurodegenerativas. El arsenal terapéutico de las microburbujas-FUS está avanzando en nuevas direcciones, incluyendo la radioterapia combinada sinérgica, la obtención de imágenes multimodales y la carga y administración de fármacos todo en uno a partir de cubiertas de microburbujas.

El marcaje de microburbujas con radiotrazadores es clave para establecer estas capacidades teranósticas ampliadas. Sin embargo, las estrategias existentes de radiomarcaje de microburbujas se basan en metodologías de purificación conocidas por perturbar las propiedades fisicoquímicas de las microburbujas, utilizan radioisótopos de vida corta y no siempre producen una quelación estable. En conjunto, esto crea ambigüedad en torno a la precisión de las imágenes de radioburbujas y la eficiencia de la administración de radioisótopos tumorales.

Este protocolo describe una nueva metodología de etiquetado de microburbujas sin purificación en un solo recipiente que conserva las propiedades fisicoquímicas de las microburbujas al tiempo que logra una eficiencia de quelación de radioisótopos del >95%. Es versátil y se puede aplicar con éxito en formulaciones de microburbujas personalizadas y comerciales con diferentes longitudes de cadena lipídica de acilo, carga y composición de quelante/sonda (porfirina, DTPA, DiI). Se puede aplicar de forma adaptativa durante la fabricación de microburbujas molidas y a formulaciones de microburbujas prefabricadas con personalización modular de fluorescencia y propiedades multimodales de fluorescencia/radiactividad. En consecuencia, este método flexible permite la producción de microburbujas multimodales personalizadas y trazables (radio, fluorescentes o radio/fluorescentes activos) que son útiles para avanzar en aplicaciones mecánicas, de imagen y terapéuticas de microburbujas-FUS.

Introducción

Las microburbujas son agentes teranósticos supramoleculares del tamaño de una micra con un núcleo de gas estabilizado por una proteína, un polímero o, en la mayoría de los casos, una capa lipídica (Figura 1A). Cuando se inyectan en el torrente sanguíneo, las microburbujas mantienen interfaces gas/líquido que son detectables por ultrasonido durante períodos de tiempo de minutos antes de la disolución de sus núcleos de gas ^1,2. En consecuencia, el primer uso clínico de las microburbujas fue como agentes de contraste para imágenes de ultrasonido en tiempo real³

Protocolo

1. Preparación de reactivos

1. Preparar tampón de acetato de amonio (0,1 M, pH 5,5)
   1. Utilizando una balanza analítica, pese 770,8 mg de acetato de amonio en un papel de pesaje. Transfiera la cantidad pesada a un vaso de precipitados de vidrio limpio de 250 ml.
   2. Añada 90 ml de agua bidestilada (ddH₂O), medida mediante una pipeta graduada, al vaso de precipitados. Agregue una barra de agitación y coloque el vaso de precipitados en una placa de agitación magnética para disolver el acetato de amonio. Revuelva a una velocidad que cree un ligero vórtice pero sin salpicaduras de solución.
   3. Calibre un medidor d....

Resultados

Los principales resultados cuantificables en la fabricación de microburbujas radiomarcadas son la pureza radioquímica y la eficiencia del radiomarcaje. Este protocolo utiliza iTLC y un procedimiento centrífugo validado, respectivamente, para caracterizar cada uno de ellos. La Figura 2A muestra que se lograron purezas radioquímicas promedio y eficiencias de ≥95% en formulaciones comerciales que imitan microburbujas en las que el lípido huésped se sustituyó por pirolípido en composiciones de 1.......

Discusión

El protocolo actual de radiomarcaje de microburbujas lipídicas logra una pureza radioquímica del >95%, una eficiencia de quelación del >95% y la retención de las propiedades fisicoquímicas de las microburbujas sin necesidad de ninguna purificación posterior al etiquetado. Estos logros representan avances nunca antes alcanzados para los protocolos de etiquetado existentes. La falta de pasos de purificación permite un uso más rápido de los radioisótopos (en este caso, el cobre-64) y, por l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
64CuCl2	Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Instituto de Radiología Mallinckrodt	N/A	Ordene en pequeño volumen (< 10 µ L) disuelto en ácido acético 0,1 N HCl
	Cualquier empresa		≥ 95% de pureza
Papel de aluminio	Cualquier empresa
Acetato de amonio	Cualquier empresa		Pureza: ≥ 98%
Equilibrio - analítico	Cualquier empresa		Capaz de medir hasta 0,1 mg
Sonicate de baño	Cualquier empresa		Se puede calentar a 69 oC
Apertura CC - 30 micras	Beckman Coulter	A36391	Rango de diámetro de partículas: 0,6-18 mmm
Electrolito CC	Diluyente Beckman Coulter	8546719	Isoton II
Software CC Beckman	Coulter	Multisizer 4e
Unidades de filtro de centrífuga (0,5 mL 30.000 MWCO) con tubos de microcentrífuga compatibles	MilliporeSigma	UFC503096	Amicon Ultra - 0,5 mL
Tubos de centrífuga - 15 mL con tapones	Cualquier empresa
Cloroformo	Cualquier empresa		Pureza: ≥ 99,8%
Contador de rejas	Beckman Coulter	B43905	Multisizer 4e Cubierta de contador de rejas
Resbalones VWR		48393081	Cubierta de micro cubierta de vidrio VWR
CuCl2	Cualquier empresa		no se oxide
CuCl2
Cubetas, 1 cm de longitud	de recorrido Cualquier empresa
Cubetas - 10 ml de plástico para mediciones CC	Beckman Coulter	A35471	Coulter Counter Accuvette ST
ddH2O	Cualquier empresa		Se puede obtener a través de un sistema de purificación de agua ultrapura
DiI (1,1'-dioctadecilo-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina Perclorato)	Cualquier empresa		Forma de polvo
Calibrador de dosis	Cualquier empresa		Capaz de leer cobre-64
DPPA (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (sal de sodio))	Avanti Polar Lipids	830855P	Polvo DPPC
(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina)	Avanti Polar Lipids	850355P	Polvo
DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000] (sal de amonio))	Avanti Polar Lipids	880200P	Polvo
DTPA-lípido (ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-dietilentriaminapentaacético (sal de amonio))	Avanti Polar Lipids	790106P	Forma de polvo
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)	Cualquier empresa
Contador de rayos gamma	Cualquier empresa		Capaz de leer cobre-64
Tapas de empuje de tubo de conteo gamma	Globe Scientific	22-171-665	Bridado tapones para tubos de 12 mm
Tubos de conteo gamma	Sarstedt	55.1579	5 mL, 75 x 12 mm, PS
Vaso de precipitados de vidrio - 250 mL	Cualquier empresa		Capaz de soportar temperaturas de hasta 100 oC
Horno de secado de vidrio	Cualquier empresa		Se puede calentar a 80 oC
Jeringas de microlitros de vidrio - 25, 50, 100, 1000 µ L	Cualquier empresa		Compatible con disolventes orgánicos Viales
de vidrio de centelleo - 20 mL	VWR	66022-081	VWR® Frascos de centelleo, vidrio de borosilicato, con tapones de rosca, con revestimiento de lámina de pulpa
Viales de vidrio - 0,5 dram	VWR	66011-020	Vial VWR 1/2 dram, con tapón de rosca fenólico negro y revestimiento de pulpa con revestimiento de polivinilo
Glicerol	Sigma Aldrich	G7757-1L	Pureza:  ≥ 99,0%
Pipeta/pistola graduada	Cualquier empresa
Placa			Equipada con sonda de temperatura para el control automático de la temperatura
Ácido clorhídrico - 0,1 N	Cualquier empresa
Placas iTLC	Agilent	A120B12	Papel de cromatografía iTLC-SA
Tejidos de laboratorio	Cualquier empresa
Unidad de filtración al vacío de medios	Cualquier empresa		Tamaño de poro de 0,22 micras, membrana PES, capacidad de embudo de 500 ml
Metanol	Cualquier empresa		Pureza:    ≥ 99,8%, grado de HPLC, cumple con las especificaciones ACS
Tubos de microcentrífuga no estériles - 1,5 mL	Cualquier empresa
Tubos de microcentrífuga estériles - 1.5 mL	Cualquier compañía
Micropipetes - p1000, p200, p20, p10	Cualquier compañía		Asegúrese de estar calibrados
Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15	Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio Agujas prelimpiadas
- 18 G			Parafilm estéril
	Cualquier compañía
PBS	Sigma Aldrich	D8537-500ML	DPBS, modificado, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular
PFP	FluoroMed	APF-N40HP	Pureza:    ≥ 99.8%
PFP línea	Cualquier compañía		Manguera de plástico de 1/4 de pulgada de diámetro cortada de unos 50 cm de longitud
Regulador PFP	Swagelok	SS-1RF4 y SS-4HC-1-4
Medidor de pH	Cualquier empresa
Estándares de pH 4 y 7	Cualquier empresa
Puntas de pipeta para p1000, p200, p10 - no estériles	Cualquier empresa
Puntas de pipeta para p1000, p200, p10 - estériles	Cualquier empresa
Jeringa de plástico - 1 ml	Cualquier empresa
Estéril Propilenglicol	BioShop	PRO888.500	Pureza:    ≥ 99.5%
Piro-lípido	N/A		Hecho en casa
Pinzas con punta de goma	Cualquier empresa		Mezcla de bordes finos y planos/cuadrados recomendada
Tijeras Cualquier	empresa
Hidróxido de sodio - 1 N	Cualquier empresa
Hidróxido de sodio - 10 N	Cualquier empresa
Espectrofluorómetro	Cualquier empresa		Capaz de excitación de 410 nm y emisión de 600-850 nm Software de
espectrofluorometría	Espectrómetro Horiba	FluorEssence
	Cualquier empresa
Jeringa - 1 ml	Cualquier empresa		Desechable, plástico, estéril
Filtros de jeringa - 0,2 micras Tamaño de poro	Cualquiera empresa		Material de la membrana: PES u otro compatible con acetato de amonio/ácido acético y PBS
Tubo de ensayo - 10 mL
Triton X-100	Cualquier empresa
Desecador/vacío al vacío	Cualquier empresa
Vialmix	Lantheus Medical Imaging	515030-0508	Denominado en el protocolo agitador mecánico de viales
Pesar papel	Cualquier empresa		Para evitar perder producto, se recomienda cortar el papel de peso en cuadrados de 3x3 cm