Artículo de método

Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/67438

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14 de febrero de 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un método para diferenciar y expandir las células asesinas naturales que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) derivado de iPSC humano con una matanza mejorada contra varias neoplasias malignas. Este protocolo demuestra la diferenciación y expansión de células CAR-NK derivadas de iPSC optimizadas para asesinos naturales (NK) y la medición de la actividad antitumoral frente a varias líneas celulares tumorales.

Resumen

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Las células asesinas naturales (NK) son células inmunitarias innatas que desempeñan un papel crucial en la defensa del cuerpo contra tumores e infecciones virales. La generación de células NK derivadas del receptor de antígeno quimérico (CAR) derivadas de células madre pluripotentes humanas (iPSC) que expresan células NK se ha convertido en una vía prometedora para la inmunoterapia contra el cáncer "lista para usar". Aquí, utilizamos una construcción CAR optimizada para células NK que incluye el dominio transmembrana de NKG2D, el dominio coestimulador 2B4 y el dominio de señalización CD3ζ, que se ha demostrado que estimula una actividad antitumoral robusta mediada por células NK específicas de antígeno. El uso de iPSCs para la generación de células CAR NK ofrece varias ventajas, entre ellas la expresión homogénea de CAR, la escalabilidad, la reproducibilidad y el potencial de aplicación clínica. Este protocolo detallado paso a paso, desde la ingeniería celular hasta la diferenciación, permite la generación de células NK optimizadas para células NK derivadas de iPSC que expresan CAR, proporcionando una inmunoterapia contra el cáncer estandarizada y dirigida con una actividad antitumoral mejorada y destacando su potencial como una opción de tratamiento prometedora para diversas neoplasias malignas.

Introducción

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Las células NK, un tipo de linfocito dentro del sistema inmune innato, son fundamentales en la defensa temprana contra tumores y células infectadas viralmente 1,2,3. A diferencia de las células T, las células NK no requieren la presentación de antígenos a través de las principales moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC). En cambio, las células NK tienen un repertorio de receptores activadores e inhibidores que regulan su actividad3. La actividad citotóxica mediada por células NK utiliza varios mecanismos, incluida la liberación de perforina y granzimas, la participación de receptores de muerte y la producción de citocinas proinflamatorias como IFN-γ y TNF-α. Este modo de acción único posiciona a las células NK como un candidato atractivo para la inmunoterapia contra el cáncer, particularmente en el tratamiento de cánceres sólidos donde la evasión inmune es un obstáculo importante 1,2,3,4.

El carcinoma hepatocelular (CHC) es una de las formas más comunes y mortales de cáncer de hígado en todo el mundo5. Los abordajes terapéuticos tradicionales, como la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, suelen proporcionar un beneficio clínico limitado y dan lugar a altas tasas de recurrencia 6,7. Los avances recientes en inmunoterapia y terapia dirigida han tenido un impacto significativo en el tratamiento del CHC 8,9. Los inhibidores de puntos de control inmunitario, como el nivolumab y el pembrolizumab, han mostrado resultados prometedores al mejorar la respuesta de las células inmunitarias contra las células cancerosas10,11. Estas terapias han mejorado las tasas de supervivencia y la calidad de vida de algunos pacientes. Sin embargo, también pueden causar efectos adversos relacionados con el sistema inmunológico, lo que puede limitar su uso en ciertos pacientes12. Las terapias dirigidas, como el sorafenib y el lenvatinib, inhiben específicamente las vías que promueven el crecimiento de las células cancerosas y la angiogénesis13. Estos tratamientos tienen eficacia conocida para controlar la progresión de la enfermedad y prolongar la supervivencia 8,14. Sin embargo, generalmente se desarrolla resistencia a las terapias dirigidas y los efectos secundarios del tratamiento son comunes15,16. Entre las vías prometedoras en las estrategias inmunoterapéuticas contra el cáncer, el advenimiento de las células CAR-T con receptor de antígeno quimérico (CAR) ha revolucionado el tratamiento del cáncer, especialmente en el tratamiento de neoplasias hematológicas como el linfoma y el mieloma múltiple 17,18,19.

Las células NK que expresan CAR, que combinan la actividad citotóxica innata de las células NK con la precisión de la tecnología CAR, representan un enfoque innovador y potencialmente transformador para tumores sólidos como el HCC 20,21,22,23,24. Las células modificadas con CAR pueden reconocer y matar específicamente las células tumorales que expresan el antígeno diana, sin afectar a los tejidos normales, reduciendo así el riesgo de efectos fuera del objetivo asociados con las terapias convencionales 25,26,27. Las células CAR-NK producidas a partir de células NK aisladas de sangre periférica o sangre del cordón umbilical se producen típicamente mediante la transducción de células NK con construcciones CAR que constan de un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular, un dominio transmembrana y dominios de señalización intracelular necesarios para la activación y proliferación 28,29,30.

El desafío de diseñar una población estable y homogénea de células NK funcionalmente modificadas para el tratamiento clínico puede abordarse mediante el empleo de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)31,32. La ingeniería de iPSCs humanas con CARs optimizadas para células NK proporciona una señal mejorada de activación y proliferación de células NK y proporciona una población inagotable y homogénea de células NK que expresan CAR como una "terapia estandarizada" 20,33. En este protocolo, la modificación genética de las iPSCs para generar células NK derivadas de iPSC que expresan CAR implica la integración de una construcción CAR optimizada para células NK que incluye dominios transmembrana y de señalización derivados de células NK (NKG2D-2B4-CD3ζ) y un scFv anti-glipican-3 (GPC3) como se describe en nuestros estudios previos23. A continuación, las iPSCs modificadas genéticamente se diferencian y expanden utilizando un protocolo de diferenciación de células NK desarrollado previamente34. Estas células NK derivadas de iPSC que expresan CAR tienen la capacidad de reconocer y eliminar el CHC y otras células tumorales que expresan antígenos específicos asociados al tumor, como el glipican 3 (GPC3), que se sobreexpresa en el CHC y otras neoplasias malignas 35,36,37,38.

La aplicación de las células CAR-NK derivadas de iPSC para el tratamiento de diversos cánceres es muy prometedora 30,39,40; muchas de estas células CAR-NK derivadas de iPSC se encuentran actualmente en ensayos clínicos 41,42,43. Para facilitar el avance en esta área, este protocolo permite la producción eficiente de células CAR-NK derivadas de iPSC modificadas, desde la ingeniería celular hasta la diferenciación en células NK maduras y la expansión in vitro.

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Protocolo

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1. Método de cultivo sin alimentador de iPSC humanas

NOTA: Descongele las iPSC humanas indiferenciadas congeladas y cultive con el uso de mTeSR 1-plus en placas prerrevestidas de Matrigel (en adelante denominadas matriz de membrana basal [BMM]), como se describió anteriormente23,34. Es muy importante asegurarse de que las iPSC no estén diferenciadas antes y después de la ingeniería. Las iPSC recién descongeladas deben cultivarse durante unos 2-3 pasajes para exhibir una morfología de pluripotencia consistente con las células madre pluripotentes humanas. Las siguientes instrucciones se utilizan para pasar células de un pocillo de una placa de 6 pocillos.

  1. Antes de pasar las iPSC, cubra la nueva placa de 6 pocillos con 1x BMM (1 mL/pocillo) e incube en una incubadora a 37 °C durante 2-4 h antes de su uso.
  2. Preparación de 1x BMM solubilizado.
    1. Descongele un vial de 5 ml de BMM a 4 °C durante la noche.
    2. BMM alícuota rápidamente utilizando puntas preenfriadas en tubos de microcentrífuga preenfriados.
    3. Almacenar a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
    4. Para preparar 1x solución de trabajo BMM, vuelva a suspender una alícuota BMM en una proporción de 1:100 en un medio DMEM/F12 frío. La solución de trabajo 1x BMM puede almacenarse a -4 °C durante 2 semanas.
    5. Cubra la placa con suficiente volumen para cubrir la superficie (p. ej., use 1 ml por pocillo de placa de 6 pocillos).
    6. Incubar en una incubadora a 37 °C durante 2-4 h antes de su uso.
  3. Descongele un vial de iPSC congeladas (normalmente 1 × 106 células/vial) en un baño de agua a 37 °C.
  4. Agregue gradualmente las iPSC descongeladas en un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de medio mTeSR Plus precalentado, permitiendo que las células se aclimaten agregándolas gota a gota para minimizar el choque celular.
  5. Centrifugar las células a 300 × g durante 5 min.
  6. Aspirar el sobrenadante y lavar las células una vez con 5 mL de PBS.
  7. Vuelva a suspender las células en el medio mTeSR Plus y póngalas a una densidad de aproximadamente 200.000 células/3 mL/pocillo en la placa de 6 pocillos prerrevestida de BMM.
  8. Paso de iPSCs.
    1. Una vez que las iPSC alcancen el 70-80% de confluencia, aspire el medio y realice el paso de una sola célula con TrypLE durante 5 min a 37 °C (1 mL/pocillo en placa de 6 pocillos).
    2. Después de 5 minutos, agregue 3 mL de 1x PBS para detener la reacción de disociación y lave las células una vez con 3 mL de PBS.
    3. Centrifugar las células a 300 × g durante 5 min. Después del lavado, vuelva a suspender las iPSC de una sola celda en el medio mTeSR Plus, luego coloque la placa en una placa de 6 pocillos prerrevestida de BMM.
      NOTA: El volumen total de medios requerido es de 3 mL/pocillo en una placa de 6 pocillos. El medio debe cambiarse cada 2-3 días, y el paso 1.8 debe repetirse cuando las celdas tengan una confluente del 70-80% durante al menos 1-2 pasajes antes de diseñar las iPSC.
  9. Comprobar periódicamente la pluripotencia de las iPSCs. Teñir las iPSCs con el anticuerpo TRA-1-81 conjugado con aloficocianina (APC) y el anticuerpo conjugado PE-Cy7 con antígeno embrionario específico de la etapa 4 (SSEA-4) durante 30 min en hielo, luego analizarlas mediante citometría de flujo como se describió anteriormente 23,41.
    NOTA: Las iPSCs utilizadas en este experimento están adaptadas a TrypLE. Las iPSC que no han sido previamente pasadas con TrypLE generalmente requieren de 8 a 10 pasadas para adaptarse completamente a TrypLE, lo que garantiza la producción de cuerpos embrioides de espín (EB) de alta calidad.

2. Ingeniería de iPSCs humanas para expresar CAR anti-GPC3 utilizando el vector piggyBac

  1. Cubra una nueva placa de 6 pocillos con BMM e incube a 37 °C durante al menos 1 h (puede ser más largo siempre que el líquido no se seque).
  2. Precalentamiento de mTeSR Plus con 10 μM de inhibidor de la proteína quinasa (ROCK) asociado a Rho y bobinado (Y-27632) (a partir de 1 mM de caldo preparado en agua destilada estéril) a 37 °C.
  3. Encienda el sistema Nucleofection. Seleccione la unidad X y, a continuación, seleccione las ubicaciones de los pozos que se van a transfectar. Elija la solución P3 e introduzca manualmente el código (CA-137).
  4. Coseche las iPSC al 70-80% de confluencia con 1 mL de TrypLE e incube a 37 °C durante 5 min. Verifique bajo el microscopio para confirmar la disociación.
  5. Pipetear 4-6 veces para obtener una suspensión unicelular, luego neutralizar con 5 mL de PBS y pellet a 300 × g durante 5 min.
  6. Lave suavemente las células una vez más para eliminar todos los rastros de TrypLE.
  7. Vuelva a suspender en 1 mL de mTeSR Plus con Rock-Inhibitor y cuente las células.
  8. Para crear iPSCs CAR anti-GPC3, use 1 × 106 celdas por transfección en un tubo de microcentrífuga y gire a 300 × g durante 5 min.
  9. Durante el centrifugado, combine el ADN del transposón que expresa CAR con el vector de expresión de la transposasa Super PiggyBac en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en una proporción de 3:1 (por ejemplo, 3 μg de plásmido que contiene el transposón por 1 μg de plásmido de transposasa).
  10. Incluya un control positivo de proteína verde fluorescente (GFP) (Tabla de materiales) utilizando 0,5 μL de solución de 1 mg/mL, y un control negativo no transfectado para confirmar la expresión de GFP.
  11. Vuelva a suspender el pellet celular cuidadosamente en 20 μL de solución Nucleofector P3 a temperatura ambiente (RT) con el suplemento proporcionado en el kit de nucleofección. A continuación, añada esta mezcla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga ADN plasmídico, lo que da como resultado un volumen final de aproximadamente 22-25 μL.
    NOTA: Vuelva a suspender todas las iPSCs que se van a transfectar en la solución P3 Nucleofector antes de añadir plásmidos GPC3 CAR o plásmidos de control GFP a las células.
  12. Transfiera la suspensión de célula/ADN a tiras de 20 μL y 16 pocillos. Asegúrese de que la muestra cubra el fondo de la cubeta sin burbujas.
  13. Golpee suavemente las tiras de 16 pocillos en la parte superior de la mesa para eliminar las burbujas de aire y asentar las celdas en la parte inferior.
  14. Coloque las tiras de 16 pocillos que contienen iPSC y la mezcla de ADN CAR en el sistema Nucleofection, seleccione el programa CA-137, solución P3 y luego inicie el programa. Este programa terminará en 1 s y mostrará una marca verde.
  15. Agregue 80 μL de mTeSR Plus precalentado con medio ROCK-Inhibitor al pocillo y transfiera cuidadosamente las celdas a la placa de 6 pocillos recubierta con BMM (volumen final 1 mL por pocillo).
  16. Revise brevemente las células bajo el microscopio de fluorescencia después de 4 h para detectar cualquier expresión de GFP para confirmar la tasa de éxito de la transfección.
  17. Cribado de iPSCs para la expresión de GFP con el fin de evaluar la eficiencia de la transfección 24 h después de la transfección mediante citometría de flujo23,41 para confirmar la expresión de GFP.
  18. Incubar durante 4 días a 37 °C, cambiando el medio según sea necesario antes de proceder a la selección del fármaco.
    NOTA: Cada nucleofección requiere 0,2-2 x 106 iPSCs por reacción. Dependiendo del número de reacciones, se pueden utilizar placas de 24 pocillos o placas de 6 pocillos.

3. Selección clonal y confirmación de la pluripotencia de las iPSCs GPC3-CAR

  1. Realice una serie de selecciones de zeocina (1:10.000) en las iPSC transfectadas para seleccionar clonalmente las iPSC que expresan GPC3-CAR.
  2. Para confirmar la eficiencia de la transfección, se midió la expresión de GFP utilizando un microscopio fluorescente y citometría de flujo23,41.
    NOTA: La construcción CAR se incorpora con una etiqueta FLAG44,45 con el fin de evaluar la expresión de CAR tanto durante la etapa iPSC como después de la diferenciación de células NK.
  3. Mantener las iPSCs de CAR transfectadas bajo selección de fármacos hasta que alcancen una expresión óptima del gen CAR y de GFP.
  4. Para garantizar una expresión homogénea de GFP y CAR, prolongue la duración de la selección del fármaco durante 2-3 semanas.
  5. Realizar una clasificación celular basada en la expresión de GFP o CAR mediante citometría de flujo para obtener una población homogénea de iPSCs clonalmente seleccionadas23.
  6. La construcción CAR utilizada aquí contiene un marcador de selección de fármacos zeocina. Seleccione las células transfectadas con el gen GPC3 CAR añadiendo zeocina (50 μg/mL de zeocina) al medio de cultivo.
  7. Después de la selección de zeocina, diluya las iPSC transfectadas con el gen GPC3 CAR y colóquelas en una placa de 96 pocillos para obtener aproximadamente una célula por pocillo. Esto se puede hacer a través de la dilución en serie o utilizando un clasificador de células.
    NOTA: Utilice la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar células transfectadas individuales en función de la expresión de un marcador fluorescente vinculado a la construcción CAR.
  8. Permita que las células individuales se expandan en colonias en la placa de 96 pocillos.
  9. Alimente las células con medio de cultivo fresco cada 3-4 días una vez y monitoree los pocillos para el crecimiento de la colonia.
  10. Filtra las colonias para detectar la expresión de CAR. Esto se puede hacer mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o Western blot para verificar la presencia de la construcción CAR23,47.
  11. Alternativamente, se utiliza la citometría de flujo 23,41 para detectar la expresión superficial de la proteína CAR.
    NOTA: En este estudio, la expresión de CAR se cuantificó mediante la expresión de la etiqueta FLAG mediante citometría de flujo.
  12. Además, realice el cariotipo para identificar cualquier anomalía cromosómica.
    NOTA: Esto puede ser realizado por organizaciones de terceros como Wicell (wicell.org) o Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. Una vez que los clones CAR positivos se hayan identificado sin ninguna anomalía, se expandan estos clones en recipientes de cultivo más grandes, como una placa de 6 pocillos y un matraz T75.
  14. Criopreservar las iPSC CAR expandidas clonalmente utilizando un medio de criopreservación en múltiples viales para su uso futuro.
    NOTA: En este paso se recomiendan los siguientes puntos: (i) Mantener unas condiciones de cultivo óptimas para las iPSC a fin de evitar la diferenciación. (ii) Espere de 1 a 4 semanas para lograr una población homogénea de expresión de CAR y GFP en iPSC después de la selección del fármaco. iii) Seguir vigilando la estabilidad de las células para determinar la estabilidad de la expresión de CAR y los marcadores de pluripotencia. iv) Utilizar controles apropiados durante las etapas de selección y verificación. (v) Después de la selección y expansión clonal, verificar la pluripotencia evaluando la expresión de TRA-1-81 y SSEA-4 en las iPSC que expresan CAR.

4. Generación de células progenitoras hematopoyéticas a partir de iPSC CAR modificadas mediante la formación de cuerpos embrioides de espín (EB)

NOTA: Se utiliza un protocolo de espín EB u organoide hematopoyético para producir progenitores hematopoyéticos23,34. Las células dentro de las EB se diferencian en células estromales para apoyar el desarrollo de linfocitos38, eliminando así la necesidad de células estromales xenoderivadas como OP9 23,34,48. A continuación se muestran las instrucciones para recolectar células de un solo pocillo de una placa de 6 pocillos para la formación de EB.

  1. Paso ~ 200,000 celdas / pocillo de placa prerrevestida de BMM de 6 pocillos 2 días antes de la formación de EB de espín. Asegúrese de que alcance el 70-80% de confluencia el día de la configuración de los EB de giro. Generalmente, 1 pocillo de una placa de 6 pocillos es suficiente para dos placas de espín EB.
  2. Retirar el medio de cultivo y separar las células incubando con 1 mL de TrypLE Select precalentado a 37 °C 5 min.
  3. Disocie cuidadosamente los agregados celulares en una suspensión de una sola célula utilizando una micropipeta de 1 mL y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL. Agregue 3 mL de 1x PBS para detener la reacción de disociación, y lave las células una vez con 3 mL de PBS.
  4. Vuelva a suspender las células en el medio mTesR Plus y filtre a través de un filtro de células de 70 μM para eliminar los agregados.
  5. Gire las células para eliminar el sobrenadante y lave las células una vez más con 5 ml de PBS. A continuación, vuelva a suspender las células en 1 mL de medio STEMdiff APEL (medio de formación EB).
  6. Cuente y diluya las células hasta obtener la densidad adecuada utilizando el medio de formación de EB que contenga las siguientes citocinas (SCF: 40 ng/mL, BMP4: 20 ng/mL, VEGF: 20 ng/mL) más 10 μM de inhibidor de ROCK.
  7. Siembre 3000-10000 células/pocillo en 100 μL de medio (100.000 células/mL) en las placas de 96 pocillos.
    NOTA: El número de celdas utilizadas en la formación de EB puede variar dependiendo de la línea iPSC. Se recomienda analizar entre 3.000 y 10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos.
  8. Con una pipeta multicanal, cargue la suspensión de la célula en placas de 96 pocillos a 100 μL/pocillo.
    NOTA: Para una mejor formación de cuerpos embrioides (EB), se recomienda utilizar placas de 96 pocillos de fondo redondo de fijación ultrabaja.
  9. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 300 × g durante 5 min, luego incubar las placas a 37 °C con 5% de CO2 durante 6 días.
    NOTA: Los estudios preliminares han encontrado que 6 días son suficientes para dar lugar a un >30% de células CD34+ para las líneas CAR iPSC en este estudio.
  10. Comprobación de la calidad de la EB mediante citometría de flujo23,41.
    1. Prepare 4 mL de tripsina precalentada al 0,25% con suero de pollo al 0,4% (16 μL para 4 mL de tripsina) para disociar EBs.
    2. Transfiera de 10 a 30 EB a un tubo cónico de 15 mL.
    3. Añadir la solución de tripsina/suero de pollo a los EB e incubar en un baño de agua durante 10 min, vórtice cada 30 s para asegurar la disociación completa de los EBs.
    4. Pipetear los EB tripsinizados. Mezcle hacia arriba y hacia abajo varias veces para disociar completamente el EBS.
    5. Agregue 5 mL de 1x PBS para detener el proceso de tripsinización.
    6. Filtre la solución celular a través de un filtro celular de 70 μm en un tubo cónico nuevo.
    7. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min.
    8. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 3-5 mL de medio fresco.
    9. Recuento de las células, tinción con marcadores EB típicos como CD34, CD31, CD43 y CD45, y análisis mediante citometría de flujo23,41 (Figura 3).
    10. Añadir el volumen recomendado de anticuerpos de acuerdo con las instrucciones del fabricante a cada tubo que contenga células individuales disociadas de EB en 100 μL de tampón de flujo e incubar en hielo durante 30 min39,41.
    11. Después de la incubación, lave las células dos veces con tampón de flujo, agregue la tinción azul viva/muerta SYTOX y analice mediante citometría de flujo.
      NOTA: Por lo general, se obtienen >30% de células CD34+ de la población total de cuerpos embrioides Spin disociados en el día 6 utilizando las iPSC utilizadas en este estudio, aunque este porcentaje puede variar según la fuente de iPSC y las condiciones de cultivo.

5. Diferenciación de las células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC a partir de Spin EB

NOTA: Los Spin EB que expresan GPC3 CAR se pueden transferir a placas de 24 pocillos o placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina al 2% o sin recubrimiento. Para cambios medios, las placas de 6 pocillos son más adecuadas, mientras que el recubrimiento de gelatina al 2% mejora la adherencia de los EB.

  1. Prepare platos de 6 pocillos recubiertos de gelatina siguiendo los pasos a continuación.
    1. Prepare una solución de gelatina al 2% (p/v) disolviendo gelatina en agua apta para cultivo de tejidos.
    2. Esterilice la solución esterilizándola en autoclave a 121 °C, 15 psi durante 30 min.
    3. Cubra la superficie de cada pocillo con 5-10 μL de solución de gelatina porcm2 (~1 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos).
    4. Incubar las placas a 37 °C durante 2-4 h antes de su uso. Después de la incubación, aspire cualquier solución de gelatina restante antes de proceder con la transferencia de EB.
  2. Prepare el medio de diferenciación de células NK: Agregue 56,6% de DMEM+ GlutaMAX-I, 28,3% de F12+ GlutaMAX-I, 15% de suero AB humano inactivado por calor, 1% P/S, 2 mM de L-glutamina, 1 μM de β-mercaptoetanol, 5 ng/mL de selenito de sodio, 50 μM de etanolamina y 20 mg/L de ácido ascórbico. Conservar a 4 °C en la oscuridad.
  3. Agregue 3 mL de medio de diferenciación NK que contenga las siguientes citocinas a cada pocillo de las placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina (IL-3: 5 ng/mL, SCF: 20 ng/mL, IL-7: 20 ng/mL e IL-15: 10 ng/mL).
  4. El día 6, transfiera los Spin EB directamente a las placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina preparadas que contienen medio de diferenciación NK siguiendo los pasos a continuación.
    1. Transfiera con cuidado los EB de placas de 96 pocillos a una placa de 10 cm, utilizando una pipeta serológica de 10 ml para eliminar la mayor parte del medio.
    2. Agregue 3 mL de medio de diferenciación NK que contenga las citocinas anteriores a cada pocillo de la placa de 6 pocillos recubierta de gelatina.
    3. Distribuya de 16 a 20 EB en cada pocillo de la placa de 6 pocillos con una micropipeta de 1 mL.
      NOTA: En promedio, los EB de una sola placa de 96 pocillos se pueden usar para sembrar una placa de 6 pocillos para la placa de diferenciación NK.
  5. Realice cambios de medio cada 5-7 días. Después de la primera semana de diferenciación de las células NK, excluir la IL-3 de los medios.
    NOTA: Después de 14 días, el medio debe cambiarse cada 3-4 días.
  6. Continúe con los cambios medios durante 3-4 semanas. Evaluar la expresión de marcadores de células NK (CD45+CD56+) mediante citometría de flujo24,42 en células en suspensión.
  7. Cuando el >80% de las células en suspensión expresen CD45+CD56+, recoja las células pasándolas a través de un filtro de 70 μm para eliminar los grumos.
  8. Cocultivo recolectado de células NK con 100 aAPCs34,48 irradiadas grises y cultivo en medio de expansión NK que contiene IL-2 (100ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL).

6. Expansión de las células NK derivadas de iPSC CAR anti-GPC3

NOTA: Por lo general, se puede obtener un rendimiento de 2-20 × 106 celdas NK de una sola placa de 6 pocillos, incluso antes de la expansión. Para facilitar una mayor expansión de las células NK para aplicaciones posteriores, se emplean células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) para generar células NK >1 × 109 .

  1. Utilice células K562 diseñadas que expresan 41BBL e IL-21 unida a la membrana (41BBL-mbIL-21)48 como aAPC para inducir la expansión de las células NK.
  2. Antes de cocultivar aAPCs con células NK, irradiar aAPCs con 100 gray y conservarlas como existencias congeladas.
  3. Recoja las células de suspensión de la placa de 6 pocillos y cultive las células NK en un medio de expansión NK suplementado con 50 U/mL de IL-2 e IL-15 (10 ng/mL; se añadirá fresco) a una densidad de 5 × 105 células/mL.
  4. Agregue aAPC irradiadas descongeladas a las células NK en una proporción de 1:1.
  5. Reponer el medio de cultivo cada 3-4 días, añadiendo IL-2 e IL-15 frescas a una concentración de 50 U/mL y 10 ng/mL, respectivamente.
  6. Asegurar que las células NK derivadas de CAR iPSC mantengan la capacidad de expansión durante un período de >3 meses, manteniendo tanto la viabilidad celular como la actividad citolítica.

7. Caracterización fenotípica y funcional de células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC

NOTA: La caracterización de las células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC implica una evaluación exhaustiva de su perfil fenotípico y actividad funcional.

  1. Evaluar la expresión de los receptores de activación NK, incluidos CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL y FasL, en las células NK derivadas de iPSC CAR anti-GPC3 a través de citometría de flujo24,42 para determinar la actividad y el estado de maduración de las células CAR NK (Figura 4).
  2. Evalúe la actividad funcional in vitro de las células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC mediante ensayos Caspasa-3/7 basados en citometría de flujo, ensayos de liberación de gránulos CD107a, ensayos de liberación de citocinas IFN-γ y TNF-α frente a diversas dianas tumorales.
  3. Para el ensayo Caspasa3/7, siga los pasos que se indican a continuación.
    1. Cuente las células objetivo y tiña previamente con un colorante fluorescente de trazado celular a una concentración final de 5 μM en PBS durante 15 min a 37 °C.
    2. Lave las células diana teñidas en un medio de cultivo completo antes del cocultivo con células NK derivadas de iPSC CAR en varias proporciones efectora-diana (E:T) a 37 °C.
    3. Después de 3 h y 30 min de cocultivo, agregue el reactivo de detección verde Caspasa-3/7 durante otros 30 min de incubación, lo que da como resultado un tiempo total de incubación de 4 h.
    4. Agregue 1 μL de solución de tinción de células muertas durante los últimos 5 minutos de tinción y mezcle suavemente.
    5. Analice las células teñidas mediante citometría de flujo23,41 (Figura 5).
  4. Implementar este protocolo para garantizar una comprensión completa de las características fenotípicas y la actividad funcional de las células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC, lo que permite una evaluación sólida de su potencial terapéutico.
    NOTA: Por lo general, se tarda de 4 a 5 semanas en obtener el >90% de las células CD45 + CD56 + de las condiciones de diferenciación de células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC basadas en espín EB y condiciones de expansión de NK utilizando líneas GPC3 CAR iPSC. Es posible que algunas líneas celulares iPSC solo requieran 3 semanas, y algunas líneas pueden demorar más (alrededor de 4-5 semanas).

8. Solución de problemas de elementos y soluciones

NOTA: La solución de problemas de diferenciación, expansión y pruebas funcionales de células GPC3 CAR NK derivadas de iPSC mediante el método de cuerpo embrioide de espín (EB) puede implicar varios pasos. A continuación se presentan algunos problemas comunes que pueden encontrarse, junto con soluciones sugeridas:

  1. Síntomas de la formación inconsistente de EB
    1. Compruebe si los EB son demasiado pequeños o demasiado grandes, con formas irregulares.
  2. Solución para la formación inconsistente de EB
    1. Ajuste la velocidad y la duración de la centrífuga utilizada para formar EB. Lo habitual es una velocidad de unos 200-300 × g durante 5-10 minutos.
    2. Asegúrese de que se utilicen las placas de cultivo de fondo en U adecuadas o placas de cultivo de fijación ultra baja para facilitar la formación de EB.
    3. Confirmar que las iPSCs son homogéneas y están libres de células diferenciadas que puedan afectar a la formación de EB.
  3. Síntomas de una mala diferenciación de las iPSCs a las células NK
    1. Compruebe si hay una expresión baja de marcadores de células NK (por ejemplo, CD56, NKp46).
    2. Compruebe si no se han formado EB o EB mal formados.
  4. Solución para la mala diferenciación de iPSCs a células NK
    1. Asegúrese de que las concentraciones de factores de crecimiento esenciales (por ejemplo, VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF e IL-3) sean óptimas para la formación de EB y la diferenciación de células NK. Ajustar las concentraciones en base a estudios previos 23,34,41.
    2. Asegúrese de que la densidad de siembra inicial de las iPSC sea la adecuada. Normalmente, se recomienda una densidad de 8000-10.000 células/100 μL para la formación de EB de espín.
    3. Verifique que el medio de diferenciación esté correctamente formulado, incluidos los suplementos necesarios (p. ej., alternativas con suero o sin suero, otras citocinas).
    4. Deje tiempo suficiente para la formación de EB, un mínimo de 6 días a un máximo de 12 días antes de cambiar a un medio de diferenciación de células NK.
  5. Síntomas de mala expansión de las células NK
    1. Compruebe si el rendimiento de las celdas es limitado durante la expansión.
    2. Compruebe la viabilidad reducida de las células NK expandidas.
  6. Soluciones para la mala expansión de las células NK
    1. Aumentar la concentración de IL-15 e IL-2 durante la fase de expansión. Esto puede mejorar significativamente la proliferación de células NK.
    2. Considere la posibilidad de utilizar células alimentadoras, como las aAPC irradiadas, para mejorar la supervivencia y la expansión de las células NK.
    3. Controle la densidad celular con regularidad y haga pasar las células antes de que alcancen el hacinamiento para mantener las condiciones óptimas de crecimiento.
  7. Síntomas de resultados de pruebas funcionales subóptimos
    1. Comprobar la reducción de la citotoxicidad frente a las células diana.
    2. Verifique si hay niveles bajos de secreción de citocinas (por ejemplo, IFN-γ, TNF-α).
  8. Soluciones para resultados de pruebas funcionales subóptimos
    1. Optimice la relación blanco-efecto en los ensayos de citotoxicidad. Comience con una proporción de 10:1 y ajústela en función de los resultados.
    2. Asegúrese de que las células NK se activen adecuadamente antes de los ensayos funcionales. Esto puede incluir la preestimulación con citocinas o el cocultivo con aAPC irradiadas.
    3. Verifique la sensibilidad de la línea celular objetivo a la lisis mediada por células NK. Utilice destinos confidenciales conocidos como controles.
    4. Amplíe la duración de los ensayos funcionales para permitir el tiempo suficiente para que se manifieste la actividad de las células NK.
  9. Síntomas de niveles variables de expresión de CAR
    1. Compruebe si hay una expresión inconsistente de CAR entre las células NK.
  10. Soluciones para niveles variables de expresión de CAR
    1. Verificar la eficiencia del método de transfección CAR (por ejemplo, transducción viral, electroporación). Ajuste el MOI (multiplicidad de infecciones) o las condiciones de electroporación si es necesario.
    2. Implemente marcadores de selección apropiados para enriquecer las celdas CAR+ NK. Utilice la selección de antibióticos o la clasificación de marcadores fluorescentes según sea necesario.

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Resultados

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Diagrama esquemático de la diferenciación y expansión de las células NK derivadas de iPSC anti-GPC3-CAR
El diagrama esquemático ilustra la diferenciación in vitro de células NK modificadas anti-GPC3-CAR derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y una representación esquemática del vector piggyBac portador de la construcción GPC3 CAR. Inicialmente, las iPSCs no modificadas se transfectan con un vector piggyBac que codifica el GPC3 CAR (receptor de antígeno quimérico). D...

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Discusión

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Este protocolo describe un enfoque estandarizado y reproducible para generar células NK derivadas de iPSC que expresan CAR a partir de una fuente celular consistente destinada a facilitar la inmunoterapia dirigida contra el cáncer "lista para usar". Múltiples estudios preclínicos y clínicos han demostrado la eficacia de la inmunoterapia adoptiva basada en células NK en el tratamiento de cánceres y minimizando las toxicidades, como las enfermedades de injerto contra huésped (EICH) o el sí...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSK es cofundador y asesor de Shoreline Biosciences y tiene una participación accionaria en la empresa. DSK también es consultor de Therabest y RedC Bio, por las que recibe ingresos y/o capital. Los términos de estos acuerdos han sido revisados y aprobados por la Universidad de California, San Diego de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. El resto de los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Kaufman por su apoyo, sus conocimientos científicos y sus debates. Estos estudios fueron financiados por las subvenciones de los NIH/NCI U01CA217885, P30CA023100 (suplemento administrativo) y el Instituto de Células Madre Sanford de la UCSD. JT: redacción y revisión de manuscritos. DSK: revisó y editó el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
aAPC Laboratorio del decano A. Lee N/A a-MEM
medio de cultivo Fisher Scientific Cat#12634
APC anti-DYKDDDDK (Etiqueta FLAG)BD Biosciences Cat#637308
APC-anti-humano TRA-1-81 ThermoFisher17-8883-42 
APC-CD16BD Biociencias Cat#302015
APC-CD43 BD BiosciencesCat# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesCat# 555485 
APC-GPC3BD Biociencias Cat#DB100B
APC-NKG2D BD Biociencias Gato# 558071 
CellEvent Caspasa-3/7 Reactivo de detección verde Termo pescador Cat#C10423
CellTrace Kit de Proliferación de Células Violetas Termo pescador Cat#C34571Tinte fluorescente de rastreo celular  
Solución CryoStor  Stem Cell Technologieshttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlMedio de criopreservación
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander MediumLife TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco 11965084
DMEM, alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvatoGibco10569010
Kit de enriquecimiento de células NK humanas EasySep  Tecnologías de células madre, Inc. Cat#19055
EtanolaminaSigma AldrichE9508
Suero fetal bovino Fisher Scientific Cat# 10437010
FITC-CD94 BD Biociencias Cat#555888
GlutaMAX SuplementoGibco 35050061
GolgiPlug BD Biociencias Cat#555029
GolgiStop BD Biociencias Cat#554724
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX SupplementGibco31765035
Horse serum Fisher Scientific Cat#16050130
Suero Humano AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
Kit de Nucleofector de Células Madre Humanas Lonza Gato# VPH-5012
Humano: Células HePG2 ATCC Gato#HB-8065
Humano: Células HePG2-td-tomate-luc Dan S. Kaufman labN/A
Humano: células iPS Dan S. Kaufman lab N/A
Humano: Células SNU-449 ATCCCat#CRL-2234
Humano: SNU-449-td-tomato-luc cells Dan S. Kaufman labN/A
IncuCyte Caspasa-3/7 Ensayo de apoptosis verde Essenbioscience Cat#4440
Ácido L-ascórbicoSigma AldrichA5960
MP Biomedicals  Suero humano, tipo ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR plusStemCell Technologies, Inc. 100-0276
Software NovoExpress ACEA Biociencias 
PE/Cy7 anticuerpo SSEA-4 humano Biolegend330420
PE-CD16 BD Biociencias Gato#560995 
PE-CD226BD Biociencias Cat#559789
PE-CD34 BD BiosciencesCat# 555822 
PE-CD45 BD Biociencias Gato# 555483 
PE-CD94 BD Biociencias Gato#555888 
PE-cy7-CD56 BioLegendGato# 318318 
Ligando PE-FAS BD Biociencias Gato#564261 
PE-NKp30BD BiosciencesCat# 558407
PE-NKp44 BD Biociencias Gato#558563 
PE-NKp46BD Biociencias Cat#331908
PE-NKp46 BD Biociencias Gato#557991 
Pelaje leucocitario de sangre periférica Banco de Sangre de San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/) N/A
PE-TRAIL BD Biociencias Gato#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO Branden Moriarity lab N/A
PMAX-GFP plásmidoLonza N/AGFP control positivo 
Prisma 9Graphpad Versión 9
pSpCas9 GenScriptPX165
RBC Lysis Buffer (10x)BiolegendCat#420301
bFGF humano recombinante básico R& D Sistemas Cat#4114-TC
BMP-4 humano recombinante PeproTechCat#120-05
Ligando FLT-3 humano recombinante PeproTechCat# 300-19 IL-15
humano recombinante PeproTechCat# 200-15
IL-2 humano recombinante PeproTechCat# 200-02
IL-3 humano recombinante PeproTechCat#200-03
IL-7 humano recombinante PeproTechCat# 200-07
Proteína nodal humana recombinanteR& D Sistemas Cat#3218-ND-025
SCF humano recombinante;PeproTechCat# 300-07
TGF-&beta humano recombinante; 1PeproTechCat#100-21
VEGF humano recombinante;PeproTechCat# 100-20
RPMI1640Gibco11875093
Selenito de sodioSigma Aldrich 214485
STEMdiff APEL 2 MedioStemCell Technologies, Inc. 5270EB medio de formación
STEMdiff APEL2 Medium Tecnologías de células madre, Inc. Cat#05270
Super piggyBac Vector de expresión de transposasaSBICat#PB210PA-1
SYTOX AADvanced Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificS10274, S10349Kit de solución de tinción de células
muertasβ-mercaptoetanolGibco21985023
https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805

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