Artículo de método

Desarrollo de un sistema de protoplasto de repollo para el estudio de la tolerancia a la hipoxia en Brassica

DOI:

10.3791/67444

⸱

20 de septiembre de 2024

 , 
1Department of Horticulture and Landscape Architecture, National Taiwan University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un sistema eficiente de protoplasto mesophyll de repollo. Se probaron varios tratamientos con deficiencia de oxígeno y el sistema mostró una alta activación de genes que responden a la hipoxia, lo que facilitó los estudios de los mecanismos genéticos y moleculares de la tolerancia a la inundación en vegetales Brassicaceae .

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A medida que el cambio climático trae lluvias más intensas, el repollo, una verdura clave de Brassicaceae , enfrenta pérdidas significativas de rendimiento debido al estrés por hipoxia inducido por inundaciones. Para identificar los mecanismos de tolerancia a las inundaciones en las coles, se necesita una plataforma versátil para los estudios genéticos funcionales que superen la naturaleza recalcitrante a la transformación de las coles. En este estudio, se desarrolló un sistema de expresión transitoria de protoplastos de repollo y un protocolo de inducción de hipoxia de protoplasto correspondiente. Este protocolo logró un alto rendimiento e integridad del aislamiento de protoplastos de hojas de repollo, con una eficiencia de transfección superior al 40% utilizando condiciones enzimáticas optimizadas. Para aliviar la posible influencia hipóxica antes de los tratamientos, la solución W5 se burbujeó con gas oxígeno para aumentar los niveles de oxígeno disuelto. Se probaron varios productos químicos para ajustar los niveles de oxígeno y tratamientos fisiológicos de eliminación de oxígeno, incluidos EC-Oxyrasa, OxyFluor, sulfito de sodio y un paquete absorbente de oxígeno. Los ensayos de luciferasa dual mostraron que los promotores de los genes de respuesta respiratoria anaeróbica BoADH1 y BoSUS1L se activaron en los protoplastos de repollo después de los tratamientos con hipoxia, con el nivel de inducción más alto observado después del tratamiento con el paquete absorbente de oxígeno. En resumen, el sistema de expresión transitoria de protoplasto de repollo combinado con el tratamiento de hipoxia demuestra una plataforma eficiente y conveniente. Esta plataforma puede facilitar los estudios de la función génica y los mecanismos moleculares asociados con las respuestas de hipoxia en las coles.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cambio climático global ha exacerbado las inundaciones, que se han convertido en un problema cada vez más crítico en todo el mundo. En las últimas décadas se ha observado una tendencia al alza en la frecuencia de las inundaciones, lo que ha provocado pérdidas sustanciales de cultivos 1,2. La col (Brassica oleracea var. capitata L.), una hortaliza de gran importancia mundial, es susceptible a los efectos adversos de las lluvias torrenciales, lo que requiere el desarrollo de cultivares de repollo tolerantes a las inundaciones para garantizar una producción sostenible frente a eventos climáticos extremos. Por lo tanto, comprender los mecanismos moleculares asociados con el estrés por inundación en el repollo es esencial para enfrentar este desafío.

Para comprender los mecanismos de regulación génica en plantas en condiciones sumergidas, las líneas transgénicas son ampliamente utilizadas para estudios genéticos funcionales. Sin embargo, este enfoque se ve limitado por los altos costos, la transformación que requiere mucho tiempo y los procesos de subcultivo, así como por las bajas eficiencias de transformación en muchas especies de cultivos, lo que requiere el desarrollo de metodologías alternativas. Los sistemas de expresión transitoria basados en protoplastos se han aplicado ampliamente en la investigación molecular de plantas como una alternativa versátil y eficiente. Estos sistemas facilitan las investigaciones sobre la actividad de los promotores, las vías de señalización en respuesta a las señales ambientales, las interacciones proteína-proteína o proteína-ADN, y la localización subcelular3. El establecimiento de sistemas de expresión transitoria de protoplasto se ha reportado no solo en plantas modelo 4,5 sino también en cultivos económicamente importantes como la caña de azúcar6, el clavel7, las orquídeas Phalaenopsis 8 y la berenjena9. Además, estos sistemas se han implementado con éxito en plantas leñosas, como Camellia oleifera10y Populus trichocarpa11. Sin embargo, los protocolos para la aplicación de sistemas de protoplastos para estudiar verduras de hoja bajo estrés por hipoxia inducida por inmersión son limitados. Por lo tanto, se ha desarrollado un protocolo integrado en este trabajo para aquellos interesados en estudiar las respuestas de hipoxia en vegetales de hoja utilizando un sistema de expresión transitoria de protoplastos de repollo.

Para llevar a cabo la respuesta de hipoxia inducida por inmersión a nivel celular, se han empleado varias metodologías de eliminación de oxígeno en estudios anteriores para simular entornos hipóxicos. Estos incluyen el uso de EC-Oxyrasa, OxyFluor, sulfito de sodio y bolsas consumidoras de oxígeno. La EC-oxirasa se utiliza normalmente para el tratamiento anaeróbico en líneas celulares humanas12 y protoplastos de Arabidopsis 13. Se ha descubierto que OxyFluor es eficaz para mitigar el fotoblanqueo causado por especies reactivas de oxígeno durante la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas14,15. El sulfito de sodio se ha empleado en el tratamiento anaeróbico de nematodos16 y, más recientemente, en protoplastos de arroz, junto con técnicas como los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)17. Los paquetes absorbentes de oxígeno, utilizados principalmente para el cultivo bacteriano anaeróbico18, también han demostrado eficacia para inducir la activación de los promotores de ZmPORB1 en los protoplastos de maíz en condiciones anaeróbicas19.

El presente trabajo tiene como objetivo establecer una línea robusta para el aislamiento y la expresión transitoria de protoplastos de repollo. Posteriormente, se evaluó la eficacia de varios tratamientos de ajuste de oxígeno mediante la evaluación de la actividad promotora de los genes de respuesta anaerobia mediante ensayos de luciferasa dual. Se anticipa que el protocolo desarrollado en este estudio será valioso para futuras investigaciones relacionadas con el estrés por inmersión o hipoxia en sistemas Brassica .

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio se utilizaron dos cultivares comerciales de repollo (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' y '228'. En la Figura 1 se muestra una representación gráfica del flujo de trabajo del protocolo. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de plántulas de repollo.

  1. Siembre las semillas de col 'Fuyudori' y '228' con sustrato vegetal comercial en agujeros redondos de forma cuadrada (4,5 cm de profundidad x 4,5 cm de alto) de bandejas de tapón de 48 pocillos (49 cm de largo x 28 cm de ancho x 5 cm de alto). Incrusta las semillas aproximadamente a 1 cm de profundidad en el sustrato.
  2. Cultive las plántulas de repollo en una sala de crecimiento a 22 °C con un ciclo de luz-oscuridad de 16/8 h. Mantener la intensidad de la luz de 100 μmol m-2·s-1 (tubo fluorescente blanco) durante la fase de luz.
  3. Después de 2-3 semanas de crecimiento, use plántulas de repollo en la etapa de 2 hojas para un mayor aislamiento del protoplasto mesófilo.
    NOTA: El tamaño sugerido de las plántulas de repollo es una etapa de 2 hojas, en la que la segunda hoja verdadera está completamente expandida, pero la tercera hoja verdadera no está expandida y su longitud es inferior a 1 cm (Figura 2A). Para sincronizar las etapas de desarrollo de las plántulas de repollo, las semillas de 'Fuyudori' deben sembrarse aproximadamente 2 días antes que las semillas de '228' debido a sus diferentes tasas de crecimiento. Este ajuste asegura un crecimiento y madurez uniformes entre las plantas de repollo en la etapa deseada.

2. Aislamiento de protoplastos de repollo

  1. Prepare 12,5 mL de solución enzimática (Tabla 1) antes de cada aislamiento de protoplasto.
    1. Precalentar una solución con 10 mM MES (pH 5,7) y 0,6 M de manitol a 55 °C. Continúe calentando la solución a 55 °C durante 10 minutos después de agregar 1,5% de celulasa R10 y 0,75% de macerozima R10.
    2. Después de que la solución enzimática se enfríe a temperatura ambiente (25 °C), agregue 10 mM de CaCl2 y 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Filtro: esterilice la solución enzimática preparada en una placa de Petri de 9 cm utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm.
      NOTA: El precalentamiento de la solución aumenta la solubilidad de la enzima e inactiva la proteasa. Los efectos de la digestión varían en función de los diferentes tipos de enzimas celulasas. La combinación de celulasa R10 y macerozima R10 es adecuada para el aislamiento de protoplastos de repollo.
  2. Recoja las segundas hojas verdaderas recién expandidas de cinco a ocho plántulas de repollo y córtelas en tiras de 0,5-1,0 mm con una cuchilla de afeitar afilada. Transfiera inmediatamente las tiras de hojas a la solución enzimática recién preparada.
    NOTA: Es crucial seleccionar hojas sanas y designadas del repollo en la etapa adecuada. Las segundas hojas verdaderas recién expandidas de las plántulas de repollo en la etapa de 2 hojas proporcionan la mayor eficiencia de aislamiento de protoplastos. Las plantas demasiado maduras, los cotiledones o las hojas envejecidas no se recomiendan para el aislamiento de protoplastos. De cinco a doce hojas verdaderas bien expandidas pueden producir con éxito protoplastos de repollo en 12,5 mL de solución enzimática. El número de hojas necesarias para el aislamiento de protoplastos depende de la cantidad deseada de protoplastos necesarios. Por lo general, los protoplastos obtenidos de cinco a ocho hojas son suficientes para procedimientos experimentales posteriores.
  3. Después de la infiltración al vacío en la oscuridad durante 30 minutos (Figura 2B), mantenga las tiras de hojas de repollo sumergidas en la solución enzimática (Figura 2C) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 4-16 h más.
    NOTA: El tiempo de digestión enzimática puede variar entre los cultivares de repollo y debe optimizarse de acuerdo con el genotipo específico. Por ejemplo, 'Fuyudori' requiere un tiempo de digestión más largo (16 h) en comparación con '228' (4 h) debido a las hojas más gruesas de 'Fuyudori'.
  4. Diluir la solución que contiene protoplastos con un volumen igual de solución W5, que consta de 2 mM de MES (pH 5,7), 154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl2, 5 mM de KCl y 5 mM de glucosa (consulte la Tabla 1 para la preparación), para detener la digestión enzimática.
  5. Libere la suspensión de protoplast girándola suavemente o utilizando un agitador orbital. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 mL.
    NOTA: Los protoplastos aislados son capaces de pasar a través de un filtro de células de 70 μm, mientras que los restos vegetales no digeridos son retenidos por el filtro y posteriormente eliminados de la suspensión. Los filtros celulares se pueden reutilizar y mantener en etanol al 75% después del lavado, pero es necesario enjuagar completamente los filtros celulares con solución W5 para eliminar el etanol residual antes de su uso.
  6. Centrifugar la solución de protoplastos con 150 x g durante 2 min a 4 °C y, a continuación, retirar con cuidado el sobrenadante. Lave suavemente los protoplastos peletizados añadiendo 10 mL de solución W5 a lo largo de la pared del tubo cónico a un caudal aproximado de 1 mL·s-1. Centrifugar el tubo a 150 x g durante 2 min a 4 °C y repetir de nuevo este procedimiento de lavado para asegurar la eliminación completa de la solución enzimática.
  7. Vuelva a suspender los protoplastos en la solución W5 y colóquelos en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación del hielo, retire el sobrenadante con una pipeta de 1 ml a la vez hasta que se elimine todo el sobrenadante.
  8. Vuelva a suspender los protoplastos en una solución de MMG preenfriada con hielo compuesta por 4 mM de MES (pH 5,7), 0,4 M de manitol y 15 mM de MgCl2 (ver Tabla 1 para la preparación).
  9. Mida la concentración de protoplastos con un hemocitómetro y ajuste la concentración final a 4 x 105 protoplastos·mL-1 utilizando solución de MMG.

3. Transfección de protoplastos

  1. Mezclar un volumen total de 10 μL de plásmido (5-10 μg) (Ficha Suplementaria 1) con 100 μL de protoplastos (4 x 104 protoplastos) y colocar en hielo durante 10 min.
    NOTA: Para la purificación de plásmidos de grado de transfección, se utiliza un kit de plásmidos disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 4 x 104 protoplastos se emplean típicamente en un ensayo reportero de luciferasa dual. Para experimentos a mayor escala, se dispone de una mayor cantidad de protoplastos para la transfección. Específicamente, alrededor de 2 x 105 protoplastos transfectados con 10 μg de plásmido exhiben una eficiencia de transfección probada que oscila entre el 30% y el 40%.
  2. Añada un volumen igual (110 μL) de solución de PEG recién preparada (consulte la Tabla 1 para la preparación) que contenga un 40% de polietilenglicol 4000 (PEG4000), 0,1 M de CaCl2 y 0,2 M de manitol en la solución de protoplast y mezcle suavemente.
  3. Incubar la mezcla de protoplast a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos, luego agregar 440 μL de solución W5 para terminar la reacción.
  4. Centrifugar los protoplastos transfectados a 150 x g durante 2 min a 4 °C y resuspender el pellet en 750 μL de solución W5 enriquecida con oxígeno. Transfiera los protoplastos resuspendidos a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos prerrecubierta con BSA al 1%.
    NOTA: La solución W5 utilizada para la incubación celular debe burbujearse con oxígeno utilizando un concentrador de oxígeno (~90% de oxígeno) conectado a una piedra difusora durante 5 minutos (Figura 2D). Después de este proceso de oxigenación, la concentración final de oxígeno disuelto en la solución W5 aumentó de 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 a 29.18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1, medido con un medidor de oxígeno disuelto. El volumen de la solución W5 para la resuspensión del protoplasto transfectado depende del tipo de placa de cultivo celular de tejidos utilizada. Para placas de cultivo celular de 12 o 24 pocillos, es aconsejable reducir el volumen de la solución W5 para mitigar el estrés por hipoxia durante la incubación debido a la mayor profundidad dentro de los pocillos. Para el recubrimiento de BSA, cada pocillo de la placa de cultivo recibió 1 mL de solución de BSA al 1%, que se dejó recubrir los pocillos durante 10 s. A continuación, la solución BSA se desechó de cada pozo, y los pozos se rellenaron posteriormente con solución W5. Este procedimiento tuvo como objetivo crear una superficie temporal no adherente utilizando BSA, evitando eficazmente que los protoplastos se adhirieran a la superficie plástica de la placa de cultivo durante las etapas experimentales posteriores.

4. Tratamiento de la hipoxia en los protoplastos de la col

  1. Llevar a cabo tratamientos de hipoxia química o físicamente inducida inmediatamente después de la transfección de protoplasto.
    NOTA: Se recomienda que el tratamiento de la hipoxia se aplique inmediatamente después de la transfección del protoplasto. La incubación prolongada de los protoplastos puede disminuir la respuesta posterior a la hipoxia.
    1. Para la hipoxia inducida químicamente en los protoplastos de la col, agregue OxyFluor, EC-Oxyrasa y sulfito de sodio a la solución de protoplastos W5.
      NOTA: El uso de 0,6 unidades·mL-1 de EC-oxirasa, 0,6 unidades·mL-1 de OxyFluor y 1 g·mL-1 de sulfito de sodio en W5 fueron las condiciones probadas capaces de inducir el promotor de BoADH1 y BoSUS1L (Figura 3A) con bajo daño a la integridad del protoplasto en las dos variedades de repollo examinadas.
    2. Para la hipoxia inducida por la bolsa que consume oxígeno, coloque dos paquetes de absorción de oxígeno en un frasco anaeróbico de 3,5 L para crear un ambiente hipóxico.
  2. Cosechar los protoplastos tratados con hipoxia centrifugando a 150 x g durante 2 min a 4 °C. Congele los protoplastos recogidos con nitrógeno líquido y guárdelos en un congelador a -80 °C para ensayos posteriores.

5. Ensayo de luciferasa dual

  1. Realice el ensayo reportero de luciferasa dual de acuerdo con las instrucciones del fabricante con pequeñas modificaciones.
    1. Vuelva a suspender los protoplastos de repollo en 50 μL de 1x tampón de lisis pasiva y vórtice durante 10 s.
    2. Incubar los protoplastos interrumpidos en hielo durante 10 min y recoger el sobrenadante después de la centrifugación a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    3. Añadir 20 μL de lisado celular a cada pocillo de la microplaca. Dispense 100 μL de reactivo de ensayo de luciferasa II en los pocillos y mida la actividad de la luciferasa de luciferasa de luciérnaga utilizando un lector de microplacas.
    4. Añada 100 μl del reactivo de ensayo disponible en el mercado a cada pocillo y mida la actividad de la Luciferasa Renilla utilizando un lector de microplacas.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo desarrolló con éxito un sistema de expresión transitoria utilizando protoplastos de repollo (consulte la Figura 1 para el flujo de trabajo). Los protoplastos se aislaron de hojas verdaderas de repollo de 2 a 3 semanas de edad de tamaño apropiado (Figura 2A) de los cultivares comerciales de repollo 'Fuyudori' y '228' utilizando digestión con celulasa/macerozima e infiltración al vacío oscuro (Figura 2B, C). Para mitigar las condiciones hipóxicas experimentadas por los protoplastos sumergidos durante la incubación, la solución W5 se oxigenó utilizando un burbujeador de piedra difusora conectado a una máquina de oxígeno (Figura 2D). Este proceso elevó significativamente la concentración de oxígeno disuelto en la solución W5 de 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 a 29.18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1 después de 5 min de burbujeo de oxígeno. Tras el proceso de aislamiento, el rendimiento de protoplastos fue de 1,04 x 107 para 'Fuyudori' y de 4,00 x 106 protoplastos·g-1 de peso fresco para '228' después de un período de digestión durante la noche (Figura 2E). Posteriormente, se utilizó GFP como gen reportero para evaluar la eficiencia de transformación del método de transfección mediado por PEG, demostrando una eficiencia de transfección de protoplasto en repollo superior al 40% en ambos cultivares (Figura 2F), confirmando así la viabilidad de este sistema.

Además, se introdujeron construcciones promotoras de los genes de respuesta a la respiración anaeróbica de la col, los vectores BoADH1p::Luc y BoSUS1Lp::Luc (Figura 3A), en los protoplastos de la col como indicadores para evaluar los efectos de la inducción hipóxica de varios tratamientos. También se aplicaron varios tratamientos de ajuste de oxígeno a este sistema modelo de expresión transitoria. Los resultados mostraron que todos los tratamientos de eliminación de oxígeno, con la excepción del sulfito de sodio, indujeron con éxito una respuesta de hipoxia en los protoplastos de repollo (Figura 3B). En concreto, la actividad promotora de BoADH1 aumentó aproximadamente 2,6 veces y 3,2 veces en comparación con el control tras el tratamiento con EC-Oxyrasa y OxyFluor, respectivamente, y, en particular, más de 7,0 veces con el tratamiento con paquetes absorbentes de oxígeno (Figura 3B). Del mismo modo, la actividad del promotor de BoSUS1L aumentó aproximadamente 1,7 veces y 1,8 veces con el tratamiento con EC-Oxyrasa y OxyFluor, respectivamente, mientras que el tratamiento con paquetes absorbentes de oxígeno indujo un aumento sustancial de más de 5,6 veces (Figura 3B). Estos resultados sugieren que el paquete absorbente de oxígeno demuestra una eficacia superior en la creación de un ambiente hipóxico en este sistema experimental de protoplasto de repollo.

figure-results-1
Figura 1: Representación gráfica del flujo de trabajo de aislamiento de protoplastos. Esta figura ilustra el proceso paso a paso involucrado en el aislamiento de protoplastos del tejido de la hoja de repollo. El flujo de trabajo se representa visualmente para proporcionar una comprensión clara del procedimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Aislamiento de protoplastos a partir de tejido foliar de repollo. (A) Se muestra el aspecto de las variedades comerciales de repollo 'Fuyudori' y '228' en la etapa de crecimiento recomendada. Las segundas hojas verdaderas recién expandidas (indicadas por la punta de flecha) de las coles en la etapa de 2 hojas se seleccionan para el aislamiento de protoplastos. Barra de escala: 2 cm. (B) Se emplea una bomba de vacío y un desecador para el proceso de infiltración al vacío de tiras de hojas de col, con una infiltración de 30 min realizada antes de la digestión enzimática. (C) Se describe la condición de las tiras de hojas de repollo durante la digestión enzimática. La digestión completa del tejido foliar requiere un total de 4-16 h. Barra de escala: 3 cm. (D) Las fotos muestran el uso de un concentrador de oxígeno conectado a una piedra difusora para aumentar la concentración de oxígeno disuelto en la solución W5. Barra de escala: 5 cm. (E) Se obtuvieron más de 4,00 x 106 protoplastos mesófilos por gramo de peso fresco (PV) de las variedades de repollo 'Fuyudori' y '228' y se observaron bajo un microscopio. Barra de escala: 200 μm. (F) Se muestra que la eficiencia de transfección de los protoplastos de ambos genotipos de repollo, utilizando un indicador de GFP expresado constitutivamente, es superior al 40%. Barra de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Respuesta a la hipoxia de los protoplastos de la col en condiciones de deficiencia de oxígeno. (A) Las construcciones génicas de respuesta a la hipoxia, promotores BoADH1 y BoSUS1L , se utilizan como indicadores para evaluar la respuesta a la hipoxia en los protoplastos de la col 'Fuyudori'. (B) Un total de 5 μg de plásmidos reporteros se transfectan en protoplastos de col 'Fuyudori', que se incuban en una solución W5 con burbujas de oxígeno antes de la exposición a tratamientos de hipoxia durante 4 h. Los niveles de oxígeno se reducen durante la incubación mediante la adición de EC-oxirasa (0,6 unidades·mL-1), OxyFluor (0,6 unidades·mL-1) y sulfito de sodio (1 g·mL-1) a la solución W5. El tratamiento del paquete absorbente de oxígeno se realiza colocando dos bolsas absorbentes de oxígeno en un frasco anaeróbico de 3,5 L. El grupo "CK" representa el grupo de control sin ningún tratamiento de hipoxia. Después del tratamiento, los protoplastos se recolectan para un ensayo de luciferasa dual. Cada valor representa la media ± DE, con n = 4. Diferentes letras indican diferencias significativas (P < 0,05) en base a un ANOVA de un factor con prueba post-hoc de LSD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Preparación de la solución enzimática, la solución W5 y la solución MMG. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Ficha complementaria 1: Detalles del plásmido para la transfección de protoplastos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta un método simplificado para el aislamiento de protoplastos de dos cultivares comerciales de repollo. La eficacia de este método se evalúa principalmente a través de dos parámetros críticos de control de calidad: el rendimiento de protoplastos viables y la eficiencia de la transfección de protoplastos. La implementación de este protocolo dio como resultado un rendimiento superior a 4.00 x 106 protoplastos·g−1· FW del tejido mesófilo de ambos cultivares de repollo (Figura 2E,F). Este rendimiento es comparable a los reportados en otras especies, incluyendo berenjena, clavel, caña de azúcar y Camellia oleifera, donde los rendimientos de protoplastos oscilaron entre 2.5 x 106 y 1.4 x 107 protoplastos·g−1· FW 6,7,9,17. Estos resultados sugieren la aplicabilidad potencial del protocolo a través de diversos orígenes genéticos con B. oleracea.

El éxito del protocolo depende de varios factores críticos. Lo más importante es la utilización de hojas especificadas de plántulas de repollo sanas en una etapa de crecimiento adecuada (Figura 2A). El uso de plantas viejas o poco saludables puede dar como resultado protoplastos de mala calidad. También es crucial cortar con cuidado el tejido de la hoja en tiras de 0,5-1,0 mm y evitar aplastarlo con una cuchilla roma. El proceso de digestión enzimática, que dura entre 4 y 16 horas, es otro paso crítico. Los períodos de digestión inferiores a 4 h pueden provocar una digestión incompleta, mientras que los que superan las 16 h de digestión corren el riesgo de estrés celular. En particular, los genotipos con hojas más gruesas, como 'Fuyudori', pueden beneficiarse de tiempos de digestión prolongados para maximizar el rendimiento de protoplastos. Por el contrario, '228' requirió solo 4 h para una digestión completa. Además, una amplia gama de tiempos de digestión puede proporcionar una mayor flexibilidad en la programación experimental. Por ejemplo, una digestión de 4 h permite que el aislamiento del protoplasto y los ensayos transitorios posteriores se completen en un solo día. Por el contrario, una digestión de 16 horas permite el inicio de la digestión enzimática por la noche y permite completar los pasos posteriores al día siguiente, lo que puede mejorar la comodidad al aplicar este protocolo. Además, es crucial manipular los protoplastos con cuidado durante todo el proceso de aislamiento del protoplasto debido a su fragilidad y susceptibilidad al estrés mecánico.

Para simular condiciones anaeróbicas representativas del estrés por inundación, este protocolo utilizó agentes comunes que eliminan oxígeno y bolsas consumidoras de oxígeno para crear ambientes hipóxicos. Para mejorar la eficacia del sistema, se emplea una máquina de oxígeno para oxigenar la solución W5 (Figura 2D), con el objetivo de reducir las señales de respuesta hipóxica de fondo en los protoplastos de repollo durante su período de incubación previo al tratamiento. Un proceso de oxigenación de 5 minutos eleva significativamente el nivel de oxígeno disuelto de 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 a 29.18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1, que indica un efecto pronunciado en el alivio de las condiciones hipóxicas. Entre los métodos de eliminación de oxígeno utilizados en este estudio, los paquetes de absorción de oxígeno mostraron un rendimiento superior, induciendo la mayor actividad promotora en dos genes centrales de respuesta anaeróbica (Figura 3). Además, este método ofrece la ventaja adicional de la escalabilidad, ya que permite el tratamiento simultáneo de múltiples muestras mediante el uso de bolsas consumidoras de oxígeno en un solo frasco anaeróbico, en lugar de la aplicación individual de agentes secuestradores de oxígeno a cada placa de cultivo celular. En resumen, los paquetes de absorción de oxígeno proporcionan una plataforma conveniente y efectiva adecuada para evaluar la respuesta de los protoplastos de repollo en condiciones hipóxicas.

Si bien este protocolo demuestra varias ventajas, es importante reconocer sus limitaciones, en particular la eficiencia de transfección relativamente modesta de los protoplastos de repollo. Aunque esta eficiencia no alcanza el 90% reportado para Arabidopsis5, no obstante, resulta suficiente para estudios posteriores exitosos sobre la actividad del promotor (Figura 3), lo que indica un potencial significativo para el análisis funcional en este sistema.

Dada la importancia mundial de la col como un importante cultivo de hortalizas, la integración de este protocolo con los tratamientos de hipoxia y las técnicas de análisis genético es prometedora para obtener más información sobre los mecanismos reguladores de la col en condiciones de inundación. Estos conocimientos podrían acelerar el desarrollo de variedades de col tolerantes a las inundaciones, abordando una necesidad crítica ante el clima extremo y el aumento de las inundaciones.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener ningún interés contrapuesto.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (MOST 111-2313-B-002-029- y NSTC 112-2313-B-002-050-MY3). Para la Figura 1, los íconos experimentales se obtuvieron de BioRender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES)PhytoTech LabsM825Para la preparación de soluciones enzimáticas
228 semillas de colTakii & Co., Ltd. (Kioto, Japón)
Tubo cónico de 50 mLSPL Life Sciences50050Para la preparación de soluciones enzimáticas
placa de cultivo de tejidos de 6 pocillosAlpha Plus16106Para la incubación de protoplastos
70 μ m filtro de célulasSorfa SCS701Para la filtración de protoplastos
Placa de Petri de 9 cmAlpha Plus16001Para la digestión enzimática
Tarro anaeróbicoHIMEDIATarro anaeróbico 3,5 LPara el tratamiento de la hipoxia 
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA7906Para la preparación de soluciones W5 y el recubrimiento
de placas de cultivo Cloruro de calcioJ.T.Baker131301Para la preparación de soluciones W5 y PEG
Celulasa R10YakultPara la preparación de soluciones enzimáticas
DesecadorTarsons 402030Para infiltración al vacío
D-GlucoseBioshopGLU501Para la preparación de soluciones W5
Medidor de oxígeno disueltoThermo ScientificOrion Star A223Para la medición
de oxígeno D-ManitolSigma-AldrichM1902Para la preparación de soluciones enzimáticas, soluciones de PEG y MMG
Sistema de ensayo Dual-Luciferasa Reporter PromegaE1960para el ensayo reportero de luciferasa dual
EC-OxyrasaOxyrase Inc.EC-0005Para el tratamiento de la hipoxia
Semillas de col FuyudoriKobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japón)
Centrífuga refrigerada de alta velocidadHitachiCR21GIIIPara la cosecha de protoplast
Macerozyme R10 YakultPara la preparación de soluciones enzimáticas
Cloruro de magnesioAlfa Aesar12315Para la preparación de soluciones MMG
MicrocentrífugaHitachiCT15REPara la cosecha de protoplast
MicroplacaGreiner655075para ensayo reportero de luciferasa dual Lector de
microplacas MolecularDevicesSpectraMax Minipara Ensayo reportero de luciferasa dual
Millex 0,22 μ m filtro de jeringaMerckSLGP033RSPara la preparación de soluciones enzimáticas
Bomba de vacío sin aceiteBalancín Balancín 300Para infiltración al vacío
OxyFluorOxyrase Inc.OF-0005Para el tratamiento de la hipoxia
Paquete absorbente de oxígenoMitsubishi Gas Chemical CompanyAnaeroPack, MGCC1Para el tratamiento de la hipoxia
Concentrador de oxígenoMAXIMUM PERFECTAII-XPara el burbujeo de oxígeno en solución W5
Sustrato vegetalKlasmann-DeilmannSustrato Potgrond HPara la preparación de plántulas de col
Kit Midi de plásmidoQIAGEN12145Para la purificación de ADN plásmido de grado de transfección 
Polietilenglicol 4000Fluka81240Para la transfección de protoplastos
Cloruro de potasioJ.T.Baker304001Para la preparación de soluciones W5
Hoja de afeitarGillettePara la preparación de tiras de hojas de col
Cloruro de sodioBioshopSOD002Para la preparación de soluciones W5
Sulfito de sodioSigma-AldrichS0505Para el tratamiento de la hipoxia
Baño de aguaYihderBU-240DPara la preparación de soluciones enzimáticas
,

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. Global-scale river flood in the last 50 years. Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).
  2. Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. Flood adaptive traits and processes: An overview. New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).
  3. Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  4. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  5. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  6. Wang, Q., et al. Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L). Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).
  7. Adedeji, O. S., et al. Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation. Sci Hortic. 299, 111057(2022).
  8. Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids. Front Plant Sci. 9, (2018).
  9. Wang, Y., et al. A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant. Sci Hortic. 304, 111303(2022).
  10. Lin, Z., et al. Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera. Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).
  11. Guo, J., et al. Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays. PLOS One. 7 (9), e44908(2012).
  12. Gottschald, O. R., et al. TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway. J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).
  13. Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).
  14. Boudreau, C., et al. Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity. Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).
  15. Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET. Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).
  16. Jiang, B., et al. Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans. J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).
  17. Lin, C. -C., et al. SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice. PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).
  18. Zhang, X., et al. Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).
  19. Liu, N., et al. The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel. Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Cabbage Protoplast SystemHypoxia ToleranceProtoplast IsolationTransient ExpressionHypoxia InductionOxygen Absorber PackDual Luciferase AssayAnaerobic JarFlooding StressBrassica Hypoxia

Artículos relacionados