Aquí, presentamos un protocolo optimizado y efectivo para la inyección intravenosa de células o agentes farmacológicos en peces cebra adultos, lo que resulta en un mayor injerto celular y mayores tasas de supervivencia del pez cebra tratado.
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Artículo de método
Inyección intravenosa optimizada en pez cebra adulto
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Resumen
Resumen
La inyección intravenosa (IV) es ampliamente reconocida como el método más eficaz y comúnmente utilizado para lograr la administración sistémica de sustancias en modelos de investigación en mamíferos. Sin embargo, su aplicación en el pez cebra adulto para la administración de fármacos, el trasplante de células madre y los estudios regenerativos y de cáncer ha sido limitada debido a los desafíos que plantean su pequeño tamaño corporal y sus intrincados vasos sanguíneos. Para superar estas limitaciones, en el pasado se han explorado técnicas de inyección alternativas, como la inyección intracardíaca y retroorbitaria (RO) para el trasplante de células madre en peces cebra adultos. Sin embargo, estas técnicas tienen sus inconvenientes, como la necesidad de técnicas de inyección meticulosas o un mayor riesgo de mortalidad.
En este estudio, hemos desarrollado un procedimiento de inyección intravenosa refinado y optimizado específicamente adaptado al pez cebra adulto, abordando los desafíos asociados con su anatomía única. Para demostrar la eficacia de esta técnica, realizamos inyecciones intravenosas exitosas de células de médula renal completa de peces Tg (mpo: EGFP) y colorante FITC-dextrano en peces Casper adultos. La visualización posterior de las células inyectadas y los colorantes utilizando un microscopio de fluorescencia confirmó su administración e injerto exitosos dentro del pez cebra. Además, demostramos que, en comparación con las inyecciones intracardíacas y de ósmosis inversa, la inyección intravenosa mejoró las tasas de supervivencia y la eficiencia del injerto en el pez cebra tratado. Este enfoque permite la administración y localización precisas de sustancias y tiene un gran potencial para el cribado químico y de fármacos a gran escala utilizando peces cebra adultos. Además, la capacidad de rastrear visualmente las células y los tintes inyectados proporciona información invaluable sobre su injerto, migración e interacciones con los tejidos del huésped, lo que permite una evaluación más completa de los efectos terapéuticos y los procesos biológicos en modelos de pez cebra.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un valioso organismo modelo en la investigación biomédica, principalmente debido a su similitud genética con los humanos, ya que más del 70% de los genes humanos tienen contrapartes del pez cebra 1,2. Este parecido genético, combinado con el tamaño compacto del pez cebra, su rápido ciclo de desarrollo y su capacidad para una amplia manipulación genética, lo convierte en una poderosa herramienta para la exploración científica. Estos atributos son particularmente ventajosos para los experimentos que involucran el trasplante de células, la administración de fármacos y el rastreo de células. Además, la claridad óptica de las larvas transparentes y los mutantes de pigmentación específicos, como el pez cebra Casper, permite una visualización precisa de las células o sustancias trasplantadas, ofreciendo una alternativa más eficiente y rentable a los modelos animales tradicionales.
El pez cebra se utiliza ampliamente para desarrollar modelos de trasplante de cáncer y para realizar pruebas de detección de drogas para enfermedades graves como glioma, melanoma, tumores pancreáticos y leucemia 3,4,5,6,7,8,9,10. Por lo general, estos modelos se inician en la etapa larvaria para aprovechar el sistema inmunológico inmaduro de las larvas y la transparencia inherente, lo que simplifica el proceso de inyección y mejora la viabilidad de los estudios a corto plazo. Sin embargo, el uso de larvas limita el tiempo para evaluar el injerto y las intervenciones terapéuticas 7,11. La transición de estos protocolos experimentales al pez cebra adulto presenta desafíos como procedimientos de inyección más complejos, menor eficiencia del injerto, tasas de mortalidad más altas y mayor variabilidad en las respuestas individuales. Estos desafíos ponen de manifiesto la necesidad crítica de mejorar las técnicas de inyección y administración de sustancias, en particular para los estudios con peces cebra adultos que requieren períodos de observación prolongados.
Históricamente, las inyecciones intracardíacas12 y retroorbitarias (RO)13 han sido los principales métodos para la administración de fármacos y el trasplante de células en el pez cebra adulto. La inyección intracardíaca, que consiste en inyectar sustancias directamente en el corazón, garantiza la circulación sistémica inmediata de los fármacos, pero se asocia con riesgos significativos, como posibles lesiones cardíacas y una alta mortalidad. Por otro lado, la inyección de ósmosis inversa, que suministra materiales al seno venoso detrás del ojo, también promueve una distribución sistémica rápida, pero puede ser estresante para los peces y exige una alta precisión en la ejecución14. Las inyecciones intravenosas, bien establecidas para la administración sistémica de sustancias en ratones y ratas, son cruciales para los estudios de farmacocinética, las evaluaciones de la eficacia de los fármacos y las intervenciones terapéuticas en estos modelos 15,16,17,18. Recientemente, las inyecciones intravenosas han ganado protagonismo en la investigación del pez cebra, particularmente en estudios de respuestas inmunes innatas19,20 y lesión renal aguda21 en larvas de pez cebra. Sin embargo, su aplicación en el pez cebra adulto sigue siendo limitada.
En este estudio, desarrollamos y optimizamos un procedimiento de inyección intravenosa diseñado específicamente para el pez cebra adulto, que mejora significativamente las tasas de supervivencia, la precisión y la eficiencia de la administración. Demostramos visualmente este método y proporcionamos un protocolo detallado utilizando esta técnica refinada. Administramos con éxito inyecciones intravenosas de células de médula renal completa (WKM) de peces Tg (mpo: EGFP) y colorante FITC-dextrano en peces Casper adultos, con confirmación de parto e injerto evaluados por microscopía fluorescente. Nuestros hallazgos muestran que la técnica refinada de inyección intravenosa es más eficiente y consistente en comparación con los métodos intracardíacos y de ósmosis inversa tradicionales. A medida que el uso del pez cebra en la investigación científica continúa expandiéndose, es probable que la adopción de esta técnica mejorada de inyección intravenosa mejore nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad y acelere el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Uso de Animales de Laboratorio y de Investigación (CULATR) de la Universidad de Hong Kong (HKU).
1. Preparación del material de inyección
- Preparar el medio de suspensión celular: 0,9x PBS + 5% suero fetal bovino (FBS) + 1% penicilina/estreptomicina (Pen/Strep.
- Esterilice la jeringa Hamilton y la aguja adjunta (34 G, 10 mm de longitud, 10 μL de capacidad, consulte la tabla de materiales) bajo luz ultravioleta con una longitud de onda de 270-280 nm y exponga los artículos durante 2 h.
- Prepare bastoncillos de algodón esterilizados, almohadillas de espuma y papel de seda.
- Prepare la mezcla de anestesia diluyendo tricaína con agua de pescado esterilizada hasta una concentración final de 0,2 mg/mL.
- Para el trasplante de células WKM en peces Casper , 2 días antes del trasplante, administrar una dosis de irradiación subletal de 25 Gy, dividida en dos sesiones de 12,5 Gy cada una, administradas el mismo día con un intervalo de 7-8 h entre dosis. Para el proceso de irradiación, coloque de 5 a 10 peces adultos en una placa de Petri de 100 mm que contenga agua de pescado y expóngalos en un irradiador gamma.
NOTA: Se determinó que la dosis era subletal sobre la base del análisis de supervivencia después de exponer a los peces Casper a varios niveles de irradiación de hasta 35 Gy, monitoreados durante 30 días (Figura 1A). La duración exacta de la exposición debe calibrarse de acuerdo con la configuración del irradiador. No se necesita irradiación para los procedimientos que involucran solo la administración de medicamentos. - Utilice un esterilizador de vapor con autoclave de laboratorio para esterilizar el agua de los peces destinada a albergar los peces tratados (consulte la Tabla de materiales) para prevenir infecciones y garantizar un entorno de recuperación seguro para los peces después de la inyección.
NOTA: El proceso de esterilización se adapta a la unidad de autoclave específica utilizada y nos adherimos a las pautas del fabricante para soluciones líquidas de autoclave para preparar el agua de los peces. - Preparar tampón de lavado de agujas: varios tubos de etanol al 75% y agua ultrapura en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Preparar el tampón de trasplante disolviendo FITC-Dextran (peso molecular: 10.000) en el medio de suspensión celular previamente preparado (0,9x PBS con 5% de FBS y 1% de Pen/Strep). Ajuste la concentración a 100 μg/mL.
NOTA: Este tampón se utilizará para las inyecciones, con un volumen previsto de 2 μL por pez.
2. Preparación de la médula renal completa para el trasplante
- Sacrificar el número necesario de peces Tg(mpo: EGFP) sumergiéndolos en una solución de tricaína de 0,4 mg/mL, asegurándose de que permanezcan en la solución durante al menos 10 minutos después del cese del movimiento opercular.
- Diseccionar los peces Tg (mpo: EGFP) para aislar y transferir la médula renal (KM) al medio de suspensión celular dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL como se describió anteriormente22.
- Desagregar las células KM pipeteando y filtrando la suspensión a través de un filtro de células de nailon de 40 μm.
- Centrifugar la suspensión a 500 × g durante 8 min.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de medio de suspensión celular.
- Cuente las células utilizando un contador automatizado con una alícuota de 10 μL de la suspensión celular.
- Vuelva a centrifugar a 500 × g durante 8 min.
- Ajuste la concentración celular a 150.000 células/μL utilizando el tampón de trasplante.
3. Procedimiento de inyección
- Lave a fondo la jeringa Hamilton 3-4x con etanol al 75% antes de la inyección. Enjuague la jeringa 3-4 veces con agua ultrapura para eliminar cualquier residuo de etanol.
- Administre anestesia al pez cebra sumergiéndolo en la mezcla de anestesia hasta que esté completamente anestesiado, lo que se evidencia por una disminución del movimiento y la pérdida de las respuestas reflejas. Una vez que los peces estén sedados, colóquelos con el lado dorsal hacia arriba y la cabeza orientada hacia la izquierda (Figura 1B). Coloque con cuidado los peces sobre papel de seda limpio y húmedo, lo que ayudará a estabilizarlos para la inyección. Asegúrese de que el pañuelo esté lo suficientemente húmedo para evitar que el pescado se seque, pero no tanto como para causar resbalones.
- Sujete la jeringa Hamilton con firmeza e incline la aguja a ~45° con respecto al vaso primario (la vena caudal) para dirigirse a ella de manera efectiva y minimizar el daño a los tejidos circundantes. En el caso del pez cebra Capser , apunte a una sección de la embarcación que sea visible a través de su cuerpo translúcido para una colocación precisa de la aguja (Figura 1B). En el caso del pez cebra de tipo salvaje (Tubinga, TU) con piel pigmentada, busque vasos primarios que se encuentren a lo largo del eje del cuerpo y posteriores al ano en la región de los vasos primarios (Figura 1B). Inserte suave y suavemente la aguja en el recipiente designado, administre la inyección (2 μL) lentamente para minimizar el estrés, asegure una absorción óptima de la sustancia y aplique una presión suave en el sitio con un bastoncillo de algodón durante 10 segundos para controlar cualquier sangrado después de la inyección.
- Observe bajo un microscopio para confirmar la presencia de señales de GFP, asegurando la efectividad de la inyección. Confirme que las células o tintes aparecen como señales verdes dentro del vaso (Figura 2A).
- Deje que los peces se recuperen en agua de pescado recién esterilizada después de la inyección durante 10 minutos hasta que se transfieran a un tanque estático.
- Limpie la aguja como se ha descrito anteriormente entre inyecciones de diferentes reactivos.
- Para evitar la aglomeración de células, agite la suspensión celular cada 10 minutos para volver a suspender las células.
- Mantener un máximo de 15 peces trasplantados en un tanque de 4 L en condiciones de agua estática durante la duración del tratamiento. Alternativamente, aloje los peces trasplantados individualmente en tanques estáticos de 1 L. Equipe el tanque con una bomba de oxígeno y realice cambios diarios de agua para minimizar el riesgo de infección.
- Monitorizar y evaluar la expresión de GFP mediante citometría de flujo en los peces aproximadamente 14 días después del trasplante para evaluar la tasa de injerto. Registre la mortalidad diaria de los peces para calcular con precisión las tasas de supervivencia. Realice el ANOVA de un factor para el análisis de injerto y la prueba de rango logarítmico para el análisis de supervivencia.
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Resultados
Para evaluar la efectividad y precisión de diferentes métodos de inyección en peces Casper adultos, se realizó un análisis comparativo utilizando técnicas intracardíacas, RO e IV (Figura 2A). Se inyectaron cantidades variables de células WKM de peces Tg(mpo: EGFP), cada una mezclada con colorante FITC-dextrano a concentraciones de 1 × 105 y 3 × 105 células. El éxito de cada método se determinó mediante la evaluación microscópica inmediata de la presenc...
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Discusión
En este estudio, desarrollamos un protocolo de inyección intravenosa adaptado para el pez cebra adulto para mejorar la precisión y la consistencia de la administración de células o fármacos. Un elemento crítico de este método es la capacidad de localizar y visualizar la vena primaria, que es crucial para la administración precisa de sustancias. Si bien se recomienda la cepa translúcida de pez cebra Casper para una visibilidad óptima de la embarcación, nuestro protocolo es adapta...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Instalación de Pez Cebra del Centro de Investigación de Medicina Comparativa (CCMR) de la Universidad de Hong Kong. Agradecemos a la Sra. Jo Yiu Ling Wong por la asistencia a los animales. Los trabajos fueron apoyados por el Esquema de Investigación Temática (T12-702/20-N), los Proyectos del Fondo de Investigación Médica y de Salud No.08192066 y No. 08193106, el Plan de Investigación Conjunta 2021/22 N_HKU745/21 de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC)/Consejo de Subvenciones de Investigación (RGC), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2023YFA1800100) y el Centro de Oncología e Inmunología bajo la Iniciativa Health@InnoHK financiada por la Comisión de Innovación y Tecnología, el Gobierno de la RAE de Hong Kong, China (A.Y.H.L.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| esterilizador de vapor para autoclaves | HIRAYAMA | HRG-140 | |
| Centrífuga 5424 | Eppendorf | ||
| Countess 3 Contador de células automatizado | Thermofisher | ||
| Countess II FL | Invitrogen | ||
| Etilo 3-aminobenzoato sal de metanosulfonato (Tricaína) | Sigma-aldrich | MKCL9483 | |
| Falcon 40 µ m Filtro de celdas | CORNING | Azul, Estéril, Empaquetado Individualmente, 50/Caja | |
| FBS, Calificado | Gibco | 26140079 | |
| FITC-Dextran (MW 10000) | MedChemExpress | 60842-46-8 | |
| Aguja de inyección | Hamilton | HAMI207434 | 34 G, 10 mm |
| de longitud Micro jeringa | Hamilton | 7635-01 | 10 y micro; Capacidad L, Modelo 701 |
| RN Nikon SMZ18 | |||
| PBS pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Penicilina-Estreptomicina (5,000 U/mL) | Gibco™ | 15070063 | 100x |
| Puntas de pipeta | Eppendorf | epTIPS | |
| Pipeta monocanal | Eppendorf | 05-403-151 | |
| Agua destilada ultrapura | Invitrogen | 10977015 |
Referencias
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