Cuantificación de micro y nanoplásticos a base de tereftalato de adipato de polibutileno del suelo mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protones

Resumen

Aquí se describe un método para cuantificar micro y nanoplásticos originados por tereftalato de adipato de polibutileno en el suelo utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Esta técnica mejora la metodología existente porque se extiende a la cuantificación de nanoplásticos y se puede adaptar fácilmente para el procesamiento de muestras ambientales a granel.

Resumen

Se necesita un método para recuperar y cuantificar los micro y nanoplásticos (MP y NP) formados en el suelo durante la biodegradación para evaluar con precisión la degradación y el impacto ambiental de los productos plásticos biodegradables. La presencia de MP y NP en el suelo puede alterar las propiedades del suelo, como el comportamiento de agregación, o tener efectos tóxicos en la biota del suelo. Los métodos de recuperación de MP existentes no siempre son adecuados para medir polímeros biodegradables como el tereftalato de adipato de polibutileno (PBAT); algunos procedimientos comunes de digestión con ácidos u oxidantes pueden destruir los MP biodegradables basados en PBAT. Los métodos de identificación, como la espectroscopia micro-FTIR y la micro-Raman, también están limitados por el tamaño mínimo de las partículas que se pueden recuperar y analizar. Por lo tanto, este método se desarrolló para extraer y cuantificar PBAT del suelo para evaluar la fracción de masa de MPs y NP en el suelo sin transformar químicamente el PBAT. En el protocolo, se utiliza una solución de cloroformo-metanol para extraer selectivamente PBAT del suelo. El solvente se evapora del extracto y luego el extracto se vuelve a disolver en cloroformo deuterado. El extracto se analiza mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protones (¹H-QNMR) bajo parámetros cuantitativos para cuantificar la cantidad de PBAT en cada muestra. Las eficiencias de extracción con solventes para PBAT oscilan entre el 76% en un suelo franco sombreado y el 45% en un suelo franco arenoso Elkhorn. La recuperación de PBAT puede reducirse para los materiales fotooxidados en comparación con los prístinos y puede reducirse en suelos con alto contenido de arcilla. Las eficiencias de extracción no dependen de la concentración de PBAT dentro del rango de prueba, pero se observaron eficiencias de extracción más bajas para las NP que para las MP. Los resultados de la cuantificación de PBAT fueron comparables a la cuantificación de la degradación del plástico mediante la medición de la respiración acumulativa del suelo en un estudio de incubación de laboratorio.

Introducción

Los métodos para medir la contaminación por MP en el suelo son necesarios para comprender el alcance de la contaminación plástica en los suelos globales¹, las fuentes de contaminación plástica² y las posibles soluciones³. Los suelos agrícolas están expuestos de manera única a la contaminación plástica: más de 15 millones de toneladas métricas de plástico se utilizan en la agricultura cada año a partir de 2021⁴, incluidas 2,5 millones de toneladas de mantillo plástico⁵. El mantillo plástico se utiliza en estrecho contacto con el suelo, se reaplica una o más veces al año⁶ y puede ser difícil de eliminar completamente del suelo después de su vida útil⁷. Un área clave en la que se necesitan métodos de medición de MP es en la evaluación de productos de plástico biodegradables, como los mantillos de plástico biodegradables, para su uso en sistemas vegetales⁸.

Los productos plásticos biodegradables en el suelo son alternativas prometedoras a los plásticos agrícolas convencionales porque podrían eliminar la contaminación plástica del suelo por el acolchado plástico si funcionan según lo previsto. En 2022, se produjeron menos de 1 millón de toneladas métricas de plástico biodegradable en todo el mundo, y se espera un rápido crecimiento para la industria⁹. Los cuatro polímeros biodegradables más comunes, el ácido poliláctico (PLA), el almidón polimerizado, los polihidroxialcanoatos (PHA) y el tereftalato de adipato de polibutileno (PBAT), se utilizan comercial o experimentalmente en acolchados de plástico biodegradables agrícolas¹⁰. A pesar de su promesa, la degradación de estos productos plásticos biodegradables en condiciones de campo es de variable¹¹. Si bien algunos estudios sobre la degradación del mantillo plástico biodegradable en el campo se han centrado en fragmentos macroplásticos¹¹, la evaluación de la degradación completa de los materiales plásticos requiere la capacidad de recuperar MP y NP del suelo. La cuantificación de microplásticos del suelo también es importante para evaluar el potencial de impactos negativos en los ecosistemas del suelo de la contaminación por MP¹².

Algunas técnicas comúnmente utilizadas para la identificación y cuantificación de MP incluyen el análisis visual, la espectroscopia infrarroja microtransformada de Fourier (μFTIR), la espectroscopia micro-Raman (μRaman), la cromatografía de gases-espectroscopia de masas (GCMS, incluida la pirólisis, GCMS y la desorción por extracción térmica, GCMS) y el análisis termogravimétrico¹³. Otras técnicas en desarrollo incluyen la espectroscopia de infrarrojo cercano para la medición in situ de MP en suelos¹⁴, la extracción de esterificación de metilo de ácidos grasos para el análisis GCMS¹⁵ y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear¹⁶. Hasta el 90% de los estudios que cuantificaron los MP en el suelo utilizaron el análisis visual (solo o en combinación con otras técnicas) para identificar partículas de plástico, mientras que el 77% utilizó técnicas de espectroscopia FTIR, Raman o GCMS¹⁷. El desarrollo y la armonización de una gran variedad de técnicas de cuantificación de MP pueden ayudar a ampliar la capacidad de la comunidad científica para responder a diversas preguntas de investigación sobre microplásticos¹⁸. Existen tres enfoques genéricos para preparar muestras de suelo para cuantificar microplásticos: 1) separar las partículas de microplástico individuales inalteradas del suelo (por ejemplo, mediante separación por densidad), 2) extraer material plástico o polimérico transformado (por ejemplo, por disolución), o 3) analizar el suelo a granel. Tanto la espectroscopia μFTIR como la μRaman requieren que los MP individuales se separen del suelo antes de que puedan identificarse químicamente¹⁹, mientras que el piro-GCMS puede realizarse en partículas de plástico aisladas, separadas del suelo o suelo a granel²⁰. Separar los MP biodegradables del suelo puede ser difícil porque algunas digestiones utilizadas para eliminar la materia orgánica del suelo pueden degradar o alterar químicamente los polímeros biodegradables, incluido el PBAT²¹. Tanto la espectroscopia micro-Raman como la μFTIR también tienen un límite de resolución espacial: las partículas deben ser mayores de 10-20 μm para μFTIR y 1 μm para μRaman (si se pueden preparar partículas individuales tan pequeñas para el análisis)^19,22. Estas técnicas pueden proporcionar la identificación química de los polímeros MP, y las imágenes espectroscópicas se pueden emplear para medir el tamaño²² de MP. Todos los tipos de piro-GCMS están limitados en el sentido de que las muestras se destruyen durante el análisis.

La RMN se ha utilizado con éxito para caracterizar los constituyentes y contaminantes del suelo²³, para cuantificar los MP 16,24,25,26 y para evaluar la degradación del PBAT y de otro polímero, el poliestireno ^27,28. Cuando se ejecuta bajo parámetros cuantitativos, la espectroscopia ^{de RMN-1}H produce espectros en los que el área de cada pico espectral es directamente proporcional al número de hidrógenos contribuyentes en la muestra; Esto permite cuantificar los componentes constituyentes en una muestra²⁹. La RMN es una técnica analítica valiosa para cuantificar algunos MPs, incluyendo el PBAT, dentro del suelo porque permite la cuantificación e identificación simultánea, es adecuada para mezclas complejas e impuras, y no requiere patrones de referencia químicamente idénticos^30,31. La espectroscopia de RMN de un extracto solvente podría cuantificar MPs o NPs más pequeños que los que se pueden procesar para la cuantificación de μFTIR, μRaman o GCMS. A pesar de estas ventajas, los enfoques cuantitativos de RMN siguen proporcionando sensibilidades más bajas que los enfoques basados en espectroscopia de masas destructiva³².

El método propuesto, diagramado en la Figura 1, describe un flujo de trabajo para procesar y analizar muestras de suelo que contienen PBAT, incluidos los plásticos PBAT de tamaño nanométrico. En el método, el polímero PBAT se extrae de muestras de suelo agitando el suelo con una mezcla de cloroformo y metanol. Los extractos solventes que contienen PBAT se secan y luego se vuelven a disolver en cloroformo deuterado con un calibrante interno añadido. La espectroscopia de RMN se realiza en los extractos utilizando parámetros cuantitativos. Los espectros resultantes se analizan para cuantificar el PBAT comparando el área de los picos ajustados correspondientes a los átomos de hidrógeno del PBAT y las moléculas calibrantes. Este método aplica el enfoque de extracción con solventes y espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones (¹H-RMN) demostrado por Nelson et ^al.33. El objetivo era emplear un método adecuado para procesar muestras a escala ambiental (~100 g de suelo) y procesar un número de muestras en paralelo sin equipo de extracción especializado.

Protocolo

1. Recolección y preparación del suelo

NOTA: El equipo de muestreo y procesamiento no debe contener el polímero PBAT ni sus componentes para evitar la contaminación de la muestra. Otros materiales poliméricos no interfieren necesariamente con la cuantificación de PBAT del suelo. Por ejemplo, el polietileno y el polipropileno no producen picos espectrales en la RMN-H del cloroformo ¹que interfieran con la cuantificación de PBAT³⁴, pero el tereftalato de polietileno, con su grupo tereftalato, probablemente interferiría con^{el 35}, al igual que otros poliésteres. Textos de referencia como Brandolini y Hills³⁴ se pueden utilizar para determinar los espectros de ^RMN-1H de varios polímeros y detectar picos superpuestos con los picos PBAT utilizados para la cuantificación (descritos a continuación).

1. Recoja al menos 100 g de peso seco equivalente de suelo para cada muestra. Determine el tamaño de la muestra de suelo en función de la concentración esperada de plásticos con el fin de recolectar una muestra representativa y homogeneizar el suelo para recolectar una submuestra si es necesario³⁶.
   NOTA: Los sistemas de suelos son inherentemente heterogéneos³⁷, al igual que las distribuciones de contaminantes (por ejemplo, MP) dentro de ellos³⁸. También existe variabilidad asociada a los métodos utilizados para medir las concentraciones de contaminantes³⁹. Por lo tanto, se recomienda crear un diseño de muestreo o diseño experimental que incluya muestras replicadas como herramienta para estimar la incertidumbre y recolectar volúmenes de muestra representativos en función de la concentración de plástico⁴⁰. Se ha documentado que las concentraciones de MP en el suelo oscilan entre casi cero y 1 x 10⁷ elementos por kg de suelo, y la mayoría de los sitios contienen menos de 10.000 elementos por kg de suelo⁴¹. Un volumen elemental teórico representativo podría oscilar entre 23^m2 a una concentración de MP de 10 ítems por metro cuadrado y 0,02^m2 cuando las concentraciones de MP son de 10.000 ítems por metro cuadrado³⁶.
   1. Para aumentar el área efectiva de muestreo de un sitio de campo y minimizar la cantidad de tierra que debe procesarse, recoja tierra de un área grande (por ejemplo, 1 m²), luego use el método de despiece para homogeneizar y consolidar la muestra (por ejemplo, a 500 g de suelo)³⁶.
   2. En el método de descuartizamiento, apile la tierra de un área grande sobre una lona u otra superficie, mezcle bien con una pala y luego divídala en cuartos. Conserve una cuarta parte de la muestra y deseche las otras tres cuartas partes. Repita este proceso hasta que la muestra tenga el tamaño deseado.
2. Tamizar la tierra a través de un tamiz de malla de 2 mm. Limpie completamente el tamiz y la bandeja de recogida entre las muestras de suelo.
3. Seque la tierra al aire, luego guárdela en bolsas de muestra selladas. El suelo seco puede almacenarse en este estado antes de la extracción de PBAT.

2. Extracción de PBAT de los suelos

PRECAUCIÓN: El cloroformo es volátil y tóxico. Guárdelo en la oscuridad en vidrio ámbar, lejos de oxidantes. Mientras trabaja con él, use guantes, protección ocular y ropa protectora adecuados. Manéjelo solo en una campana extractora. El metanol es inflamable, volátil y tóxico. Almacene el metanol en un armario ignífugo. Mientras trabaja con metanol, use guantes adecuados, protección para los ojos y ropa protectora. Manipule el metanol solo en una campana extractora. La cristalería puede romperse y causar lesiones. Use protección para los ojos cuando manipule cristalería. Evite tocar vidrios rotos con las manos desnudas. En su lugar, limpie los vidrios rotos con guantes, pinzas, escobas u otra herramienta resistentes a los cortes.

NOTA: El cloroformo no es compatible con la mayoría de los plásticos o metales. Asegúrese de que todos los materiales sean compatibles (por ejemplo, vidrio o politetrafluoroetileno, plástico PTFE).

1. En una campana extractora, prepare 100 mL de mezcla 90:10 v/v de cloroformo (triclorometano; CHCl₃) y metanol (CH₃OH) por muestra a extraer. Por ejemplo, para extraer de 5 muestras, mezcle 450 mL de cloroformo con 50 mL de metanol.
2. Agregue 100 g de tierra seca, 100 ml de solución de cloroformo y metanol y 20 perlas de vidrio en un frasco de extracción de vidrio. Selle herméticamente los frascos de extracción con tapas revestidas de PTFE para que el vapor de solvente no pueda salir de los frascos.
   NOTA: El PBAT es altamente soluble en cloroformo; se utilizó una mezcla de cloroformo y metanol porque el metanol puede formar enlaces de hidrógeno con solutos, compitiendo con los constituyentes minerales y orgánicos del suelo y aumentando la recuperación de PBAT del suelo³³.
3. Utilice una mesa agitadora para agitar los frascos de extracción durante 8 h a 200 rpm. Después de agitar, deje que la tierra de los frascos de extracción se asiente durante al menos 4 h.
4. Separe el extracto del suelo. En la campana extractora, destape un frasco de extracción y transfiera el líquido por pipeta a través de un filtro de papel cualitativo con un tamaño de poro de 11 μm a un frasco de vidrio limpio etiquetado. Registre el volumen de disolvente recuperado del frasco de extracción. Evite transferir sólidos del suelo con el extracto; deje unos mL de solvente si es necesario.
   NOTA: El papel de filtro está diseñado para eliminar trozos grandes de materia orgánica de la solución solvente.
5. Seque los extractos dejándolos en la campana extractora hasta que el disolvente se evapore por completo. Esto puede tardar hasta 24 horas. Seque también la tierra en la campana extractora. Una vez que la tierra esté completamente seca, deséchala.
6. Una vez que los extractos estén secos, tape cada frasco de muestra y guárdelos en un lugar fresco, oscuro y seco hasta que los necesite.

3. Colección de espectros de RMN

PRECAUCIÓN: El cloroformo deuterado presenta los mismos riesgos y requiere las mismas precauciones que el cloroformo protonado descrito anteriormente.

1. Añada un calibrador interno⁴² a la muestra. Use una balanza para pesar 1.00 mg de 1,4-dimetoxibenceno (DMB; C₆H₁₄O) en cada frasco de muestra que contenga un extracto seco.
2. Vuelva a suspender la muestra en cloroformo deuterado (CDCl₃; tricloro(deutero)metano). En la campana extractora, utilice una micropipeta para añadir 500 μL de cloroformo deuterado al frasco con extracto de muestra seco.
3. Tape el frasco y agite para disolver el extracto seco golpeando suavemente el frasco contra una mano o una mesa de trabajo, aproximadamente 10 veces en cada lado. A continuación, utilice una punta de pipeta limpia para transferir el líquido a un tubo de RMN.
4. Repita los pasos 3.2 y 3.3 con 500 μL adicionales de cloroformo deuterado, añadiendo la segunda porción de la muestra al mismo tubo de RMN que la primera. El segundo enjuague está destinado a garantizar la disolución completa y la recuperación del extracto seco del recipiente.
5. Tape el tubo de RMN y guárdelo durante 3 días antes de recolectar los espectros de RMN. El tiempo de almacenamiento adecuado dependerá de la tasa de evaporación del solvente del tubo de RMN. Analice las muestras poco después de prepararlas con cloroformo deuterado.
6. Para transportar los tubos de RMN al espectrómetro, utilice un soporte diseñado para soportar los tubos largos y delicados. Por lo general, tienen soporte cerca de la base y la parte superior del tubo. Mantenga los tubos en posición vertical durante el transporte.
7. Usando un espectrómetro de RMN de 500 MHz, recoja un espectro de protones de ¹H con un ángulo de pulso de 90°²⁹, un ancho de pulso de 8 μs³³, un tiempo de retardo de 25 s (determinado por el experimento de recuperación de inversión^29,43), 262K puntos por escaneo y 32 escaneos compuestos^29,44 de 12 a -2 ppm para un tiempo de ejecución total de 25 minutos.
   NOTA: Utilizamos un espectrómetro Bruker Neo de 500 MHz con una sonda optimizada para banda ancha y un muestreador automático a una temperatura controlada de 300 K. Se pueden utilizar otros espectrómetros similares. Si se utiliza un instrumento con una intensidad de campo magnético diferente, el tiempo de retardo apropiado puede calcularse sobre la base del tiempo de relajación T1 para PBAT y 1,4-dimetoxibenceno utilizando un experimento de recuperación de inversión^29,43.
8. Una vez que se haya ejecutado la muestra, guarde, transfiera o acceda a los datos espectrales según sea necesario.
   Inspeccionar los datos espectrales. Compruebe que todos los picos de PBAT utilizados en la cuantificación se resuelvan claramente si están presentes. Utilice los picos PBAT 5 (8.10 ppm), 6 (4.44 ppm), 6' (4.38 ppm), 3' (4.15 ppm) y 3 (4.09 ppm) para la cuantificación (detalles en la Tabla 1). Utilice los picos DMB A (6,84 ppm) y B (3,77 ppm) también para la cuantificación (detalles en la Tabla 2). Tome nota en particular de los picos 6, 6', 3' y 3 de PBAT, que parecen estar muy cerca unos de otros y pueden superponerse.
9. Si algunos picos no se resuelven claramente, diluya la muestra. Combine 100 μL de muestra y 500 μL de cloroformo deuterado en un tubo de RMN limpio y vuelva a ejecutar la muestra con los mismos parámetros definidos en el paso 3.7.

4. Análisis de espectros de RMN para cuantificar PBAT

NOTA: El análisis espectral se puede realizar en cualquier momento después de la recolección. Es preferible analizar los datos el mismo día en que se producen los espectros para garantizar que las muestras aún estén disponibles para volver a ejecutarlas en caso de que surja algún problema.

1. Abra el archivo FID creado por el espectrómetro en el software de procesamiento FID de RMN (usamos MestreNova de MestreLab, otras opciones pero otras opciones están disponibles).
2. Aplicar ensanchamiento de línea a los espectros: En el software de procesamiento FID, seleccione Plantilla de procesamiento en el menú Procesamiento, luego navegue hasta la sección Apodización. Seleccione un modelo exponencial con una magnitud de 0,5 Hz y un primer punto de 0,5 Hz.
3. Aplique la corrección de fase automática haciendo clic en el botón Corrección de fase automática en el menú Procesamiento. Aplique la corrección automática de la línea de base haciendo clic en el botón Corrección automática de la línea de base en el menú Procesamiento.
4. Utilice la deconvolución de picos para ajustar los picos espectrales medidos: en la pestaña Análisis del software de procesamiento de espectros, en la sección Ajuste, haga clic en el botón Nuevo ajuste . Utilice el cursor para hacer clic en los espectros con un desplazamiento de 8,5 ppm, luego arrastre el cursor a un desplazamiento de 3,0 y suéltelo.
5. Haga clic en Tabla de ajuste de línea en la sección Ajuste para ver todos los picos instalados.
6. Conserve los picos utilizados para la cuantificación como se describe en la Tabla 1 y la Tabla 2 y etiquetados en la Figura 2. Utilice los picos PBAT 5 (8.10 ppm), 6 (4.44 ppm), 6' (4.38 ppm), 3' (4.15 ppm) y 3 (4.09 ppm) en la cuantificación (detalles en la Tabla 1), así como los picos DMB A (6.84 ppm) y B (3.77 ppm). Los átomos de hidrógeno que corresponden a cada pico enumerado en la Tabla 1 y la Tabla 2 están etiquetados en los diagramas estructurales de la Figura 3, con la Figura 3A que muestra la estructura de los dos dímeros PBAT, la Figura 3B que muestra cómo la posición de los dímeros en el polímero interactúa para alterar el cambio de pico en los hidrógenos del monómero de 1,4-butanodiol, y la Figura 3C que muestra la estructura de DMB.
7. Elimine todos los demás picos del ajuste seleccionando los picos no deseados y haciendo clic en Eliminar pico.
8. Utilice la tabla de ajuste para copiar el área de cada pico en una aplicación de hoja de cálculo para los cálculos (elegimos usar una hoja de cálculo).
9. Para copiar áreas de picos en una hoja de cálculo, primero seleccione toda la información de picos en la Tabla de ajuste de líneas. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione Copiar en el menú emergente. Pega los datos en la hoja de cálculo.
10. Calcule el número de moles de DMB agregados a la muestra, n_DMB, usando la ecuación
    
    donde m_DMB es la masa de DMB añadida a la muestra en gramos (sugerido 1,00 mg) y MM_DMB es la masa molar de DMB (138,17 g/mol).
11. Calcule el número de moles del dímero de tereftalato de butileno de PBAT en la muestra, n_BT, utilizando la ecuación
    
    donde A₅ es el área medida del pico 5 de PBAT, A_A es el área medida del pico A de DMB y A_B es el área medida del pico B de DMB. Las unidades de área producidas por el software de análisis espectral son arbitrarias.
12. Calcule el número de moles del dímero de adipato de butileno de PBAT en la muestra, n_BA, utilizando la ecuación
    
    donde A₃ es el área medida del pico PBAT 3, A_3' es el área medida del pico PBAT 3', A₆ es el área medida del pico PBAT 6 y A_6' es el área medida del pico PBAT 6'. Las unidades de área producidas por el software de análisis espectral son arbitrarias.
13. Calcule la masa de PBAT en la muestra, m_{PBAT, recuperada}, usando la ecuación
    
    donde MM_BA es la masa molar de un dímero BA de PBAT (200 g/mol), y MM_BT es la masa molar de un dímero BT de PBAT (220 g/mol).
14. Si una cantidad conocida de PBAT estaba presente en la muestra, entonces el porcentaje de recuperación, η, se puede calcular para la muestra como una medida de la eficiencia de extracción de acuerdo con la ecuación
    
15. Calcule la concentración de PBAT en una muestra, C_PBAT, utilizando la ecuación
    
    donde m_{suelo seco} es la masa de suelo seco utilizada para producir el extracto (0,1 kg), V_{disolvente recuperado} es el volumen de disolvente recuperado del suelo en el paso 2.4, y V_{segundo añadido} es la cantidad inicial de disolvente añadido a la muestra de suelo (100 mL).

5. Preparación de la curva de calibración para la cuantificación de PBAT de un suelo en particular

NOTA: Una curva de calibración creada en base a muestras de suelo con cantidades conocidas de PBAT agregadas proporcionará información útil sobre cómo se extrae y recupera el PBAT de un suelo en particular. La extracción no es igual para todos los suelos ni para todas las formas de PBAT. Sospechamos que la eficiencia de la extracción depende del contenido de arcilla y materia orgánica^{del suelo 33}, y recomendamos crear una curva de calibración para cada serie de suelo y horizonte de interés. La curva de calibración se puede crear antes o después de que se procesen muestras desconocidas con este método.

1. Recoja y prepare el equivalente a 2,5 kg de tierra seca, como se describe en los pasos 1.1 a 1.3.
2. Determine el rango que debe cubrir la curva de calibración; la concentración máxima de PBAT utilizada en la curva de calibración debe ser superior a la concentración más alta de PBAT entre muestras desconocidas.
3. Prepare u obtenga suficiente plástico PBAT para crear 5 muestras enriquecidas de 100 g de suelo con 0%, 25%, 50%, 75% y 100% de la concentración máxima (25 muestras en total). Por ejemplo, si 40 mg/kg es la concentración máxima deseada, se necesitará un total de 50 mg de PBAT para crear las muestras enriquecidas.
4. Prepara 25 muestras de 100 g de tierra cada una. Aumente las muestras pesando el plástico a base de PBAT y agregándolo a las muestras de suelo a las dosis prescritas. Por ejemplo, si 40 mg/kg de PBAT es la concentración máxima deseada, cree 5 muestras sin PBAT, 5 muestras con 1 mg de PBAT, 5 muestras con 2 mg de PBAT, 5 muestras con 3 mg de PBAT y 5 muestras con 4 mg de PBAT. Después de agregar PBAT al suelo, mezcle bien.
5. Extraiga PBAT de las 25 muestras enriquecidas, luego recoja los espectros de RMN de los extractos y analice los espectros resultantes como se describe en los pasos 2.1 a 4.16.
6. Identifique la ecuación de una curva de calibración para PBAT en este suelo realizando una regresión lineal entre la cantidad medida de PBAT en cada muestra enriquecida y la cantidad real de PBAT agregada en una herramienta de análisis estadístico. Usamos una hoja de cálculo. Si no se detecta ningún PBAT en las muestras con picos sin PBAT agregado, entonces la fuerza b = 0 en la regresión.
   NOTA: Una prueba de regresión lineal evalúa la fuerza de la relación lineal entre dos variables numéricas continuas x e y, de acuerdo con la relación y = mx + b. La prueba calcula los valores de m y b que mejor se ajustan a los datos. El coeficiente r² de la prueba de regresión describe el grado de correlación entre ambas variables.
7. Pruebe una relación significativa entre la eficiencia de extracción y la concentración de PBAT utilizando la herramienta de análisis estadístico. Calcule la eficiencia de extracción de PBAT de las muestras enriquecidas como
   
8. Utilice la herramienta de análisis estadístico para calcular la probabilidad de que los datos observados puedan ocurrir aleatoriamente sin una correlación entre la eficiencia de extracción y la concentración de PBAT. Si este valor p es mayor que el umbral de significación predeterminado, α, entonces no puede rechazar la hipótesis nula de que no hay relación entre las dos variables. Si este es el caso, se puede suponer que la eficiencia de extracción es constante para todas las concentraciones de PBAT dentro del rango probado. Si se rechaza la hipótesis nula, es posible que el modelo lineal descrito aquí no sea la mejor manera de modelar los datos.
9. Utilice la ecuación de regresión lineal de la curva de calibración para estimar la cantidad de PBAT en muestras desconocidas procesadas con este método. Si la variable x de la regresión era la cantidad real de PBAT en las muestras con picos de la curva de calibración, la variable y era la cantidad medida de PBAT, y b se establecía en 0, entonces
   
   NOTA: El contenido de PBAT de las muestras replicadas estimado utilizando una ecuación de curva de calibración se puede utilizar para generar un intervalo de confianza para la cantidad de PBAT en un suelo en particular, o si se puede calcular una media y un intervalo de confianza para las concentraciones de PBAT en extractos replicados, entonces se podría aplicar la curva de calibración para estimar la concentración de PBAT en el suelo. Cualquiera de los dos órdenes de operaciones produce el mismo intervalo de confianza para el contenido de PBAT en el suelo. Por ejemplo, considere extractos de 10 muestras replicadas que tienen concentraciones de PBAT de 10, 5, 2, 4, 10, 11, 2, 6, 8 y 5 mg/kg y la ecuación de la curva de calibración y _{(PBAT medido en extracto)} = 0,75 x _{(PBAT verdadero en el suelo).} Las concentraciones de PBAT en el suelo en cada réplica podrían estimarse en 13, 7, 3, 5, 13, 15, 3, 8, 11 y 7 mg/kg. Entonces la concentración media de PBAT en el suelo se estimaría en 8,4 mg/kg con una desviación estándar de 4,4 mg/kg. Si primero se calcula una media y una desviación estándar para las concentraciones de PBAT del extracto (10, 5, 2, 4, 10, 11, 2, 6, 8 y 5), se calcularía una media de 6,3 mg/kg y una desviación estándar de 3,3 mg/kg. A continuación, se pudo aplicar la curva de calibración tanto a la media como a la desviación estándar para estimar la concentración de PBAT en el suelo: media de 8,4 mg/kg, desviación estándar de 4,4 mg/kg.

Resultados

Para evaluar la eficacia de este método en la cuantificación del polímero PBAT del suelo, se construyeron curvas de calibración extrayendo PBAT de muestras enriquecidas creadas en tres suelos diferentes. Para cada uno de los tres suelos (detalles en la Tabla 3), el suelo se pasó a través de un tamiz de 2 mm y luego se secó al aire. Las muestras enriquecidas se crearon añadiendo 0, 9, 18, 27 o 36 mg de MP a base de PBAT a 100 g de suelo seco (5 réplicas de cada uno). Esto equivale a 0, 63, 126, 189 o 252 ...

Discusión

Proponemos un método para la extracción con solventes de PBAT del suelo junto con ¹H-RMN para cuantificar PBAT en el extracto. Los elementos clave del proceso de extracción incluyen la técnica y el equipo de extracción, el solvente utilizado para extraer y los requisitos de tiempo. Se optó por utilizar una técnica de extracción que requiere un equipo relativamente sencillo y económico (tarros de vidrio, perlas de vidrio y una mesa agitadora) en comparación con la extracción So...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,4-dimetoxibenceno	Arcos Organics 99%+	AC115411000	1 mg por muestra
Botella de vidrio ámbar con tapa forrada de PTFE (1 L)	Kimble	5223253C-26
reutilizable Cloroformo; triclorometano	Fisher Chemical	AA43685M6	90 mL por muestra; Fisher Optima
Cloruro deuterado; tricloro(deuterio)metano	Sigma Aldrich	1034200025	1 mL por muestra; mínimo 99,8% deuterado; estabilizado con plata
Perlas de vidrio (3 mm de diámetro)	Propper Manufacturing	3000600	20 por muestra
Frascos de extracción de vidrio con tapa revestida de PTFE (~250 mL de volumen)	Kimble	5510858B	2 por muestra, reutilizables
Cilindro graduado, 1 L, polipropileno	Nalgene	3662-1000	reutilizable
Cilindro graduado, 500 mL, polipropileno	Nalgene	3662-0500
reutilizable Metanol	Fisher Chemical	A412-4	20 mL por muestra; certificado ACS
Micropipeta con rango de 0,5 - 1 mL		Espectrómetro de	reutilizable
	3123000063 Bruker	n/a	instrumentos de 500 MHz
(7 pulgadas de altura, alto rendimiento)	Wilmad	WG-1000-7	1 por muestra
Agitador de plataforma	Eppendorf, Excella E5	M1355-0000	reutilizable
Punta de pipeta de polietileno (volumen de 10 ml)	Eppendorf	22492098	1 por muestra, de un solo uso
Puntas de micropipeta de polipropileno (volumen de 1 ml)	Fisher Scientific	02-707-510	3 por muestra, de un solo uso
Semimicrobalanza	Mettler Toledo	30532226	reutilizable