Extracción de órganos terminales vestibulares en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía

Nicholas  S. Andresen; Hakim Hiel; Catherine J. Graham; Yassine Balhi; John P. Carey; Amanda M. Lauer; Bryan K. Ward

doi:10.3791/67523

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Artículo de método

Extracción de órganos terminales vestibulares en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía

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DOI:

10.3791/67523

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29 de noviembre de 2024

Nicholas S. Andresen¹ , Hakim Hiel¹ , Catherine J. Graham¹ , Yassine Balhi¹ , John P. Carey¹ , Amanda M. Lauer¹^,²^,³ , Bryan K. Ward¹

¹Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, ³Department of Functional Anatomy and Evolution, Johns Hopkins University School of Medicine

En este artículo

Resumen

En este trabajo describimos una técnica para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía y su análisis mediante inmunotinción.

Resumen

El oído interno humano vivo es difícil de estudiar porque está encerrado dentro de una densa cápsula ósea ótica que limita el acceso al tejido biológico. Los métodos tradicionales de histopatología del hueso temporal se basan en protocolos de descalcificación largos y costosos que duran entre 9 y 10 meses y reducen los tipos de análisis de tejidos posibles debido a la degradación del ARN. Existe una necesidad crítica de desarrollar métodos para acceder a tejido fresco del oído interno humano para comprender mejor las enfermedades otológicas, como la enfermedad de Ménière, a nivel celular y molecular. En este artículo se describe una técnica para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos de un donante vivo en condiciones fisiológicas. Un individuo con enfermedad de Ménière y "ataques de gotas" refractarios a la inyección intratimpánica de gentamicina se sometió a laberintectomía. Primero se realizó una mastoidectomía tradicional y se identificaron los canales semicirculares (CCE) horizontal y superior. La cavidad mastoidea se llenó con una solución salina equilibrada para que el laberinto pudiera abrirse en condiciones más fisiológicas para preservar la integridad celular. Se utilizó un endoscopio de cero grados con un sistema de irrigación de la vaina que limpia la lente para visualizar la cavidad mastoidea sumergida, y se utilizó una fresa de diamante de 2 mm para esqueletizar y abrir los CCE horizontales y superiores, seguidos del vestíbulo. Se recolectaron las ampollas y porción de los conductos del canal para los CCE superior y lateral. El utrículo fue cosechado de manera similar. El tejido recolectado se colocó inmediatamente en un tampón helado y luego se fijó durante una hora en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El tejido se enjuagó varias veces en 1x PBS y se almacenó durante 48 h a 4 °C. Las muestras de tejido se sometieron a inmunotinción con una combinación de anticuerpos primarios contra tenascina-C (Calyx), oncomodulina (células ciliadas streolares), calretinina (Calyx y células ciliadas tipo II), proteína 2 de la vesícula sináptica (fibras eferentes y botones), β-tubulina 1 (cáliz y botones aferentes), seguida de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. A continuación, las muestras de tejido se enjuagaron y se montaron para su examen de microscopía confocal. Las imágenes revelaron la presencia de células ciliadas ampulares y maculares y estructuras neuronales. Este protocolo demuestra que es posible recolectar tejido del oído interno humano intacto y de alta calidad de donantes vivos y puede proporcionar una herramienta importante para el estudio de enfermedades otológicas.

Introducción

El oído interno humano vivo es difícil de estudiar debido a su ubicación dentro de la densa cápsula ósea ótica del hueso temporal. En consecuencia, el acceso al tejido interno humano ha sido limitado, y los investigadores se han basado principalmente en la recolección de tejido post-mortem. La histopatología del hueso temporal (HQT) post-mortem ha sido una herramienta fundamental para la comprensión de la enfermedad otológica humana durante más de 100 años ^1,2,3. El tejido para la TBH se prepara mediante la recolección post-mortem del hueso t....