Artículo de método

Ensayo emparejado de nanoinyección de cisterna magna y contraste de moteado láser para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral in vivo

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DOI:

10.3791/67544

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8 de julio de 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

En este artículo

Resumen

Para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral in vivo, los métodos farmacológicos tradicionales son invasivos, a menudo dañando el cráneo, la duramadre y las leptomeninges. En este trabajo, desarrollamos una técnica mínimamente invasiva que combina la inyección de magna intracisternal (ICM) guiada por nanoinyectores con imágenes de contraste de moteado láser, preservando la integridad del cráneo y las leptomeninges.

Resumen

La regulación del flujo sanguíneo cerebral (CBF) es crucial para mantener las funciones cognitivas, pero sus mecanismos subyacentes siguen siendo poco conocidos. La investigación de los procesos celulares y moleculares implicados en esta regulación requiere un enfoque farmacológico que permita la administración precisa de fármacos en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y, al mismo tiempo, permita la monitorización en tiempo real de la dinámica del flujo sanguíneo cerebral. En este artículo, presentamos un método para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral in vivo mediante la combinación de la inyección de magna intracisternal (ICM) basada en nanoinyectores con imágenes de contraste de moteado láser.

La técnica de inyección ICM basada en inyectores de nanolitros permite la administración precisa de fármacos en un rango dinámico de nL/min a μL/min. En nuestros experimentos, este enfoque redujo significativamente el volumen de inyección de los tradicionales 5-10 μL a solo 1,5 μL, manteniendo así una presión intracraneal normal. Cuando se combinó con imágenes de contraste con moteado láser, pudimos monitorear la dinámica del flujo sanguíneo cerebral (CBF) en tiempo real antes, durante y después de las inyecciones de ICM.

Usando este método, evaluamos los cambios en el CBF en respuesta a la inyección de ICM de tres vasodilatadores diferentes: (S)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG), acetilcolina y adenosina. Si bien los tres vasodilatadores aumentaron el CBF basal, tuvieron efectos distintos sobre la dinámica del CBF. Por ejemplo, el impacto de la adenosina fue transitorio, mientras que la DHPG y la acetilcolina produjeron efectos duraderos. Con sus ventajas únicas, este método representa una valiosa adición a la caja de herramientas del estudio de la regulación CBF en roedores in vivo.

Introducción

El flujo sanguíneo cerebral (CBF) garantiza el suministro continuo de oxígeno y nutrientes al cerebro, al tiempo que elimina los desechos metabólicos, que son esenciales para mantener las funciones cognitivas normales 1,2. En condiciones homeostáticas, el CBF se mantiene relativamente estable a pesar de las fluctuaciones en la presión de perfusión, un proceso conocido como autorregulación 3,4,5. Además de la autorregulación, el CBF local puede ajustarse dinámicamente en respuesta a la actividad neuronal cercana, un fenómeno conocido como acoplamiento neurovascular 6,7. Tanto la autorregulación como el acoplamiento neurovascular están regulados por un grupo de células (células endoteliales, células murales, astrocitos, fibroblastos y neuronas) conocidas colectivamente como células de la unidad neurovascular 4,7. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares por los cuales estos diferentes tipos de células se coordinan para modular el CBF aún se desconocen en gran medida.

Los métodos para investigar la regulación del CBF se dividen generalmente en modelos in vitro e in vivo. Los estudios in vitro, a menudo utilizando cortes agudos de cerebro, se combinan típicamente con técnicas electrofisiológicas o farmacológicas para examinar cómo las neuronas y las células gliales regulan la dilatación o constricción de los vasos sanguíneos individuales 8,9,10. La principal limitación de los modelos in vitro es que no se replican en condiciones in vivo, en particular la ausencia de presión arterial fisiológica. Los modelos in vivo para estudiar la regulación del CBF van desde enfoques de macroescala a microescala. Las técnicas a macroescala, como la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética funcional (fMRI), son no invasivas pero presentan baja resolución espacial y temporal 11,12,13,14.

El principal método a microescala para estudiar el CBF in vivo es la obtención de imágenes de dos fotones, que proporciona una alta resolución espacio-temporal 9,15,16,17,18. Sin embargo, esta técnica requiere la extirpación del cráneo y de la duramadre, y cuando se combina con la manipulación farmacológica, se vuelve aún más invasiva, causando potencialmente hemorragia, dañando el tejido cerebral y alterando la presión intracraneal19. Por lo tanto, es crucial contar con un método para manipular y monitorear el CBF in vivo que cumpla con criterios específicos: debe ser no invasivo (preservar la integridad del cráneo, las leptomeninges y los vasos), proporcionar una alta resolución espacio-temporal y permitir una manipulación farmacológica precisa del CBF. En este artículo, presentamos un nuevo método que combina la inyección de magna intracisternal (ICM) basada en inyectores de nanolitros y la imagen de contraste de moteado láser, cumpliendo con todos estos requisitos.

Los enfoques farmacológicos tradicionales para estudiar la regulación del CBF a menudo implican la extirpación del cráneo y las meninges para exponer el tejido cerebral para la administración local del fármaco. Por el contrario, la inyección de ICM evita este daño mediante la administración de fármacos directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que les permite seguir el flujo natural del LCR y, por lo tanto, imitar mejor las condiciones fisiológicas. Un desafío con la inyección de ICM es que generalmente requiere grandes volúmenes de líquido, a menudo 5 μL o más en ratones20. Dado que el volumen total de LCR en ratones adultos es de aproximadamente 36 μL, la inyección de 5 μL puede aumentar la presión intracraneal y alterar la dinámica del CBF. Nuestro sistema de nanoinyectores, que utiliza pipetas de vidrio, suministra fluido con un control preciso sobre el volumen y la velocidad sin causar fugas de líquido cefalorraquídeo en el lugar de la inyección.

El uretano y la alfa-clolorosa se utilizan en nuestro estudio porque proporcionan una línea de base fisiológica más estable del flujo sanguíneo cerebral y preservan el acoplamiento neurovascular (CNV) mejor que las alternativas comúnmente utilizadas como el isoflurano o la ketamina/xilacina (KX). Con este sistema, probamos tres vasodilatadores diferentes: (S)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG), acetilcolina y adenosina, y confirmamos que permite una manipulación y monitorización precisas de la dinámica del CBF in vivo.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia. Todos los experimentos se adhirieron a la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Para los experimentos se utilizaron seis ratones machos C57BL/6, de entre 10 y 14 semanas de edad. Los procedimientos quirúrgicos se describen en la Figura 1A.

1. Preparación de la cirugía

  1. Coloque una almohadilla térmica en el marco estereotáxico y precaliéntelo a 37 °C ~ 20 min antes de la cirugía. Prepare uretano fresco (750 mg/kg) y cloralosa (50 mg/kg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para la anestesia.
    NOTA: Para la preparación de la solución de alfa-cloralosa en PBS, calentamos la solución en un baño de agua a 40 °C y la agitamos en vórtice cada 10-15 min hasta que se disolvió por completo. Tanto las soluciones de uretano como las de alfa-cloalasa se filtraron con un filtro de jeringa de 0,22 μm antes de su uso.
  2. Antes de la cirugía, reúna todos los instrumentos quirúrgicos necesarios, incluidas tijeras, fórceps, microagujas, hemostáticos, hisopos de algodón, toallitas y suturas. Esterilizar los instrumentos en autoclave (121 °C a 15 psi durante 60 min).
  3. Prepare tubos capilares de vidrio (diámetro exterior 1,14 mm, diámetro interior 0,53 mm, 88,9 mm de longitud). Utilice un extractor de vidrio para crear pipetas de vidrio para inyección21. La resistencia preferida de la pipeta es de aproximadamente 80 - 100 MΩ. Esterilice y guarde las pipetas de vidrio en un recipiente limpio.
  4. Prepare un nanoinyector con el volumen de inyección adecuado (25 nL - 4,5 μL) y la velocidad (6 nL/s - 644 nL/s).
  5. Prepare las siguientes soluciones vasodilatadoras en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF): (S)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) a 5 mM, acetilcolina a 0,5 mM y adenosina a 10 mM.
  6. Prepare meloxicam (4,0 mg/kg) para aliviar el dolor durante la cirugía. Administrar meloxicam por vía subcutánea a los ratones aproximadamente 30 minutos antes de la cirugía para asegurar una analgesia adecuada.

2. Procedimiento quirúrgico

  1. Pesar seis ratones machos C57BL/6 (10-14 semanas de edad) y anestesiarlos mediante inyección intraperitoneal de uretano (750 mg/kg) y cloralosa (50 mg/kg). Coloque a los ratones en una cámara de anestesia con isoflurano al 1% para mantener la anestesia. Este proceso dura aproximadamente de 40 min a 1 h.
    NOTA: El isoflurano puede acelerar la inducción de la anestesia.
  2. Retire cuidadosamente los ratones de la cámara de anestesia y evalúe la profundidad de la anestesia confirmando la ausencia del reflejo de pellizco de los dedos del pie. Con un hisopo de algodón, aplique crema depilatoria en la parte superior del cráneo y la parte posterior del cuello para eliminar el pelaje.
  3. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad y vuelva a aplicar según sea necesario durante todo el procedimiento. Controle regularmente durante el experimento y administre ungüento adicional cuando sea necesario.
  4. Coloque el ratón en decúbito prono dentro del marco estereotáxico, asegurando una ventilación adecuada con aire medicinal a un caudal de 1 a 2 L/min. Asegure el mouse con barras para las orejas para una fijación adecuada, luego incline suavemente la cabeza hacia abajo para formar un ángulo de 120 ° con el cuerpo, exponiendo así la cisterna magna.
    NOTA: El isoflurano se utiliza exclusivamente para la inducción de la anestesia y no durante la fase de mantenimiento.
  5. Desinfecte el área quirúrgica con al menos tres aplicaciones alternas de alcohol al 70% y un exfoliante quirúrgico (por ejemplo, clorhexidina o povidona yodada) para garantizar una esterilización adecuada de la piel.
  6. Localiza la cresta occipital bajo un microscopio quirúrgico. Levante la piel suprayacente con pinzas y haga una incisión de 1 cm en la línea media. Controle cualquier sangrado con hisopos de algodón.
  7. Exponga los músculos del cuello y haga una incisión y sepárelos cuidadosamente a lo largo de la línea media con pinzas. Emplee dos pinzas curvas, una en cada mano, para retraer suavemente los músculos y exponer la duramadre, que forma el límite exterior de la cisterna magna.
  8. Ajuste la posición de la cabeza inclinándola hacia abajo para formar un ángulo de 150° con el cuerpo para una exposición óptima de la cisterna magna.
  9. Realice una incisión de 5 mm a lo largo de la sutura sagital, cubriendo los puntos lambda y bregma. Con dos pinzas curvas, tire suavemente de la piel hacia un lado y limpie la superficie del cráneo con solución salina. Asegúrese de que no quede pelo en el cráneo expuesto.
  10. Después de la limpieza, aplique una capa de gel de ultrasonido de ~ 1 mm de espesor en el cráneo expuesto con hisopos de algodón para mantener la humedad en el área. Dado que el gel de ultrasonido puede contener burbujas de aire, asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire antes de la toma de imágenes.
  11. Coloque el ratón debajo de la lente del sistema de imágenes de contraste de moteado láser. Encienda el sistema y el software que lo acompaña. Asegúrese de que el cerebro del ratón esté centrado dentro del campo de imagen y, a continuación, utilice la función de enfoque automático para lograr el enfoque correcto para la obtención de imágenes. Si es necesario, elimine suavemente los pelos o burbujas de aire restantes del campo de imagen con unas pinzas.

3. Configuración de nanoinyección

  1. Asegure la bomba al brazo del manipulador estereotáxico y conecte el cable al controlador. Encienda el controlador y seleccione la bomba de destino. En el panel de control, establezca DIRECTION en INFUSE. Ajuste la velocidad a 2 μl por minuto y el volumen a 4,5 μl.
    NOTA: El sistema de nanoinyección consta de dos componentes principales: la bomba de inyección y el controlador. Cada controlador puede operar dos bombas simultáneamente. Para la inyección de ICM, solo utilizamos una bomba.
  2. Una vez finalizada la infusión , saque una pipeta de vidrio del recipiente y llénela con aceite mineral incoloro e inodoro con una aguja flexible MicroFil de 34 G o un tipo de aguja similar. Asegúrese de que toda la pipeta de vidrio esté llena de aceite.
  3. Desenrosque la boquilla de la bomba, inserte la pipeta de vidrio y, a continuación, apriete la boquilla. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el interior de la pipeta de vidrio.
  4. Cambie la DIRECCIÓN en el panel de control para RETIRAR. Ajuste la velocidad a 2 μ L/min y el volumen a 4,5 μ L.
  5. Mueva el brazo estereotáxico para introducir suavemente la pipeta en la solución preparada y extraer el volumen deseado.

4. Inyección de vasodilatadores en la cisterna magna y monitorización del CBF

  1. Asegúrese de que la bomba esté firmemente fijada al brazo del manipulador estereotáxico. Ajuste el ángulo del brazo del manipulador estereotáxico a 45° en el plano antero-posterior.
  2. Usando pinzas curvas bajo el microscopio de disección, exponga cuidadosamente la cisterna magna. Limpie el área con solución salina para eliminar la sangre. Utilice el micromanipulador estereotáxico para colocar la pipeta de vidrio cerca de la duramadre de la cisterna magna.
  3. Una vez que la pipeta de vidrio toque la duramadre, maniobre suavemente para que pase al centro de la cisterna magna, evitando cualquier penetración en el cerebelo o la médula. Asegúrese de que la punta de la pipeta de vidrio esté insertada a una profundidad de 1-2 mm antes de soltar las pinzas.
    NOTA: Un marco estereotáxico digital es esencial para controlar la profundidad de penetración de la pipeta de vidrio en la cisterna magna.
  4. Cambie la DIRECCIÓN en el panel de control a INFUSE. Ajuste la velocidad de inyección a 300 nL/min y el volumen a 1,5 μL.
  5. Inicie el software para la adquisición de imágenes de contraste de manchas láser (LSCI) y ajuste el enfoque para lograr la imagen más clara de los vasos sanguíneos. Asegúrese de que no haya pelo ni burbujas de aire en el campo de visión.
  6. Ajuste el intervalo de imagen a 5 s en el panel de control LSCI. Registre el CBF de referencia durante aproximadamente 10 minutos, asegurándose de que la línea de base permanezca estable. Si hay fluctuaciones en la línea de base, continúe grabando durante más tiempo hasta que se logre la estabilidad.
  7. Después de 10 minutos de registro de línea de base estable, inicie la nanoinyección y anote la hora de inicio de la inyección en el sistema de registro LSCI. Una vez completada la inyección, marque la hora de finalización y continúe grabando durante 20 minutos adicionales o más. Una vez finalizado el experimento, se realizó la perfusión transcardíaca de los ratones con PBS y se recogieron los tejidos cerebrales para su análisis histológico.

Resultados

Después de completar la cirugía, aseguramos el ratón en un marco estereotáxico con una lectura digital (Figura 1A,B). Para la medición del flujo sanguíneo cerebral (CBF, por sus siglas en inglés), separamos cuidadosamente la piel sobre el cráneo después de la incisión y aplicamos un gel de ultrasonido transparente para mantener la humedad en la superficie del cráneo (Figura 1C). Para facilitar la inyección intracisternal magna (ICM), diseccionamos los músculos del cuello alrededor de la cresta occipital para exponer la cisterna magna. Después de eso, retiramos la solución objetivo con una pipeta de vidrio y usamos el micromanipulador para guiar la pipeta de vidrio para penetrar en las membranas de la cisterna magna a una profundidad de 1-2 mm (Figura 1D, E). El brazo estereotáxico se inclinó en un ángulode 45º para ayudar con la inserción.

A continuación, examinamos los cambios dinámicos del CBF en respuesta a tres vasodilatadores diferentes: (S)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG), acetilcolina y adenosina 22,23,24,25. Inicialmente registramos una línea de base de 10 minutos antes de inyectar 1,5 μL de cada vasodilatador a una velocidad de 300 nL/min durante 5 min. Después de la inyección, registramos 20 minutos adicionales de datos. Nuestros resultados mostraron que los tres vasodilatadores aumentaron el CBF, aunque con una dinámica distinta. La DHPG indujo un fuerte aumento de CBF, seguido de una disminución gradual después de la inyección (Figura 2A,B). Por el contrario, la acetilcolina provocó un aumento gradual de CBF a lo largo del período de registro (Figura 2C, D). La adenosina también produjo un aumento transitorio del CBF, que volvió al nivel basal aproximadamente 15-20 minutos después de la inyección (Figura 2E,F).

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Figura 1: Resumen de los procedimientos quirúrgicos. (A) Paso a paso de los principales procedimientos quirúrgicos para la nanoinyección + modelo LSCI. (B) Esquemas que muestren el sistema combinado de nanoinyección + LSCI. El nanoinyector se fija de forma estable en el brazo estereotáxico y el brazo se inclina 45º para facilitar la penetración de la membrana atlanto-occipital en la cisterna magna. (C) Vista cenital del cráneo del ratón bajo el sistema LSCI. El cráneo se cubre con gel de ultrasonido. (D) Vista posterior que muestra la pipeta de vidrio penetrando en la magna cisterna. La pipeta de vidrio se rellenó con azul Evans para facilitar la visualización. Utilice el marco estereotáxico digital para este experimento, de modo que la distancia de penetración se pueda cuantificar con precisión. (E) Esquemas que muestren la ubicación de la punta de la pipeta de vidrio en la magna cisterna. La cabeza del ratón se inclinó 30º para facilitar la inyección de magna cisterna. Abreviatura: LCSI = imágenes de contraste de moteado láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Aumento del flujo sanguíneo cerebral después de la nanoinyección de vasodilatadores. (A) Imágenes representativas que muestran cambios en el flujo sanguíneo cerebral antes y después de la inyección de DHPG. La velocidad de la sangre está codificada por colores. El azul representa la baja velocidad y el rojo la alta velocidad. (B) Flujo sanguíneo en tiempo real en la región marcada con una línea roja, que indica la ventana de tiempo para la inyección de DHPG. (C) Imágenes representativas que muestren cambios en el flujo sanguíneo cerebral antes y después de la inyección de ACh. La velocidad de la sangre está codificada por colores. El azul y el rojo indican velocidades bajas y altas, respectivamente. (D) Flujo sanguíneo en tiempo real en la región marcada por la línea roja, que indica la ventana de tiempo para la inyección de ACh. (E) Imágenes representativas que muestren cambios en el flujo sanguíneo cerebral antes y después de la inyección de adenosina. La velocidad de la sangre está codificada por colores. El azul y el rojo indican velocidades bajas y altas, respectivamente. (F) Flujo sanguíneo en tiempo real en la región marcada por la línea roja, que indica la ventana de tiempo para la inyección de adenosina. Abreviaturas: DHPG = (S)-3,5-dihidroxifenilglicina; ACh = acetilcolina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Presentamos un método novedoso para investigar la regulación del flujo sanguíneo cerebral (CBF) in vivo mediante la combinación de nanoinyección precisa de magna cisternal con imágenes de contraste de moteado láser (LSCI). Este enfoque permite la administración precisa del fármaco en el líquido cefalorraquídeo (LCR) al tiempo que permite la monitorización en tiempo real del CBF, lo que facilita la evaluación de la reactividad vascular cerebral.

La manipulación farmacológica y las técnicas de administración de fármacos son fundamentales para estudiar el CBF y la reactividad vascular cerebral in vivo. Los métodos tradicionales para la aplicación de fármacos, como el uso de vasodilatadores o constrictores, a menudo requieren la extirpación del cráneo, lo que puede dañar las leptomeninges e incluso el parénquima cerebral 9,10,18. Estas técnicas invasivas pueden alterar el microambiente cerebral, particularmente al causar daño vascular y hemorragia, por lo que no logran replicar las condiciones fisiológicas reales. Por el contrario, nuestro método ofrece cuatro ventajas significativas.

En primer lugar, nuestro enfoque para la aplicación de fármacos no es invasivo y preserva las condiciones fisiológicas. En segundo lugar, los métodos clásicos de inyección de ICM suelen basarse en jeringas o cánulas, que pueden provocar fugas de fármacos o trazas y líquido cefalorraquídeo debido al gran tamaño de las puntas. Estos métodos tradicionales a menudo requieren grandes cantidades de fármaco o trazas, generalmente 5 μL o más, lo que puede alterar la presión intracraneal. Por el contrario, nuestra inyección ICM guiada por nanoinyectores requiere solo un pequeño volumen de tan solo 1,5 μL o menos. Además, la velocidad de inyección se puede controlar con precisión en un amplio rango, desde 1 nL/s hasta 100 nL/s. Por lo general, utilizamos una velocidad de 5 nL/s (300 nL/min), ya que esta velocidad no afecta la presión intracraneal. En tercer lugar, a diferencia de las inyecciones de fármacos guiadas por pipeta en el parénquima cerebral o la perfusión de fármacos en la superficie cortical, nuestra administración de fármacos basada en inyecciones cisternales de magna sigue el flujo natural del LCR, imitando de cerca las condiciones fisiológicas. Finalmente, dado que nuestro método preserva la integridad del cráneo y las meninges, podemos realizar mediciones en el mismo grupo de ratones en diferentes puntos de tiempo, lo que permite comparaciones longitudinales, algo que no es factible con otros métodos de aplicación de medicamentos. Para los estudios de supervivencia y las comparaciones longitudinales, se deben seguir técnicas asépticas estrictas, incluida la preparación adecuada de la piel, el uso de instrumentos y materiales estériles y el cumplimiento de las pautas institucionales de cuidado animal. Se debe permitir un período de recuperación de dos semanas para la cicatrización de la herida.

El método de anestesia puede tener un impacto significativo en el CBF. Por ejemplo, la anestesia con ketamina-xilacina puede elevar el CBF en más de un 50% por encima de los niveles basales, mientras que el isoflurano puede duplicar el nivel basal de CBF. En nuestros experimentos, optamos por el uretano y la cloralosa debido a sus efectos mínimos sobre el sistema cardiovascular, lo que ayuda a mantener los niveles fisiológicos de CBF, comúnmente utilizado en el campo26,27. Además, omitimos la canulación intraarterial para que la gasometría repetida no fuera invasiva, aunque estos procedimientos pueden combinarse con nuestro método26.

Nuestro enfoque integra dos sistemas: el sistema de inyección ICM basado en nanoinyección28 y el sistema de imágenes de contraste de moteado láser (LSCI)29. Los experimentadores deben estar entrenados en ambos sistemas para realizar el procedimiento con éxito. Dado que el sistema LSCI ocupa todo el espacio por encima de la cabeza del ratón, inclinar el brazo45º no sólo facilita la inyección de ICM, sino que también garantiza la compatibilidad entre los dos sistemas. Esta configuración es fundamental para el éxito del experimento.

Para los principiantes que utilizan la inyección ICM guiada por nanoinyectores, se requiere una amplia práctica para dominar la coordinación de separar los músculos con pinzas en una mano mientras se maniobra el micromanipulador para guiar la pipeta de vidrio con la otra. Una buena luz láser y un microscopio estereoscópico de brazo articulado son esenciales para una visualización óptima durante el procedimiento.

Utilizando este método, evaluamos cómo los vasodilatadores clásicos como la DHPG, la acetilcolina y la adenosina afectan al CBF. Como se anticipó, los tres vasodilatadores aumentaron el CBF; sin embargo, indujeron dinámicas diferentes. La DHPG provocó un fuerte aumento del CBF, seguido de un lento decaimiento, mientras que la acetilcolina provocó un aumento gradual. Por el contrario, la adenosina solo produjo un aumento transitorio de CBF.

Este método también debería ser aplicable a los modelos de ratas. Sin embargo, dado que el grosor del cráneo de la rata es de aproximadamente 0,5-1 mm, será necesario adelgazarlo para obtener imágenes de contraste con manchas láser. Además, si bien el método actual se puede adaptar para ratones despiertos con la cabeza fija, requiere un entrenamiento extenso para minimizar el movimiento de los animales durante los experimentos. Utilizamos un número limitado de ratones para demostrar nuestro método; Por lo tanto, nuestro estudio está estadísticamente limitado, y se debe tener precaución al sacar conclusiones generales de nuestros hallazgos.

Para obtener mediciones consistentes y confiables de CBF, es importante que los experimentadores reconozcan que otros parámetros fisiológicos, como la temperatura corporal, la presión arterial y los niveles de CO2 , juegan un papel crítico en la evaluación fisiológica integral y deben considerarse cuidadosamente en estudios futuros. En resumen, presentamos un nuevo método in vivo para estudiar la regulación del CBF en ratones. Este enfoque es preciso y mínimamente invasivo, lo que lo hace muy adecuado para investigar la dinámica del CBF inducida por fármacos.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(RS)-3,5-DihidroxifenilglicinaTocris Cat. No. 0342
Cloruro de acetilcolinaSigmaA6625-25G
AdenosinaSigmaA9251-25G
Hisopo con alcohol 70% Alcohol isopropílicoVitrex Medical A / S520213
AmScope SM-8T Series Microscopio estéreo con zoom de brazo articuladoAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Aquasonic Gelde transmisión de ultrasonido transparenteAquasonicGelPLI 03-50
Ratón Digital Instrumentos estereotáxicosStoelting51730D
Alcohol etílicoSigma459836-2L
Fiber-Lite DC950 IluminadorDolan-Jenner industriesDC950H
Vidrio de repuesto 1.14 MMWorld Precision Instruments504949
Toallitas de precisión Kimtech Science Limpiadores de TejidosKimberly Clark Professional5511
Generador de imágenes de contraste de manchasMoorflpi-2 Moorflpi-2
Lasik Eye Spear (100 por caja) AGUJA FLEXIBLE MICROFIL
World Precision InstrumentsMF34G-5
Aceite mineralSigmaM5904
scientific50-195-4000
Nair Loción depilatoria de manteca de cacaoASIN ‏ : ‎
B000GCW5CS INYECTOR NANOLITER 2020 WorldPrecision InstrumentsNANOLITER2020
extractor de micropipetas P-2000Sutter InstrumentP-2000
Puritan® Hisopos, Cabeza de algodón, Eje de madera,Puritan Medical806-WC
Medi-Vet11897
UretanoSigmaU2500
Pegamento tisúrgico VetbondPrecision InstrumentsVETBOND
α-ChloraloseSigma23120
láser BV40815 HOSPEQ Almohadilla térmica para ratón Fisher Amazon Lubricante ocular estéril World

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