El aislamiento delas MSCsBAMBI altasen MFGE8, uno de los tres subgrupos principales que constituyen las UC-MSCs humanas heterogéneas, es útil para comprender completamente las características y funciones de este subtipo para su futura aplicación para mejorar la eficacia clínica en enfermedades específicas. Aquí, presentamos un método para clasificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.
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Artículo de método
Aislamiento de células estromales mesenquimales derivadas del cordón umbilical BAMBIhumano con altocontenido de MFGE8
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Resumen
Resumen
Las células madre estromales mesenquimales derivadas del cordón umbilical (UC-MSC) presentan una baja inmunogenicidad y potentes efectos inmunomoduladores para el tratamiento de diversas enfermedades. Las UC-MSC humanas son una población heterogénea que consta de tres subpoblaciones principales con diferentes formas celulares, tasas de proliferación, capacidades de diferenciación y funciones inmunorreguladoras. Anteriormente, se descubrió que las BAMBIaltasMFGE8 UC-MSCs, el primer subgrupo aislado con éxito de las UC-MSC, no lograron aliviar la nefritis lúpica. Por lo tanto, la función y el mecanismo subyacente de este subgrupo en la terapia de MSC para enfermedades sigue siendo desconocida. Es necesario aislar e investigar más a fondo las BAMBIaltasMFGE8UC-MSC en términos de su fenotipo, metabolismo y función para comprender completamente la naturaleza de este subgrupo de MSC. En este protocolo, describimos un método detallado para aislarla subpoblación BAMBIaltaMFGE8 de las UC-MSC humanas. La subpoblación de UC-MSCs se marca con dos marcadores de superficie, BAMBI y MFGE8, mediante clasificación por citometría de flujo. Las células aisladas se cultivan y verifican mediante análisis de citometría de flujo. Los genes específicos expresados en las BAMBIaltasMFGE8 y UC-MSCse identifican mediante RT-qPCR. Este protocolo da como resultado una clasificación celular pura y altamente eficiente y describe los perfiles de marcadores de las BAMBIaltas, MFGE8 y UC-MSCaltas.
Introducción
Las células madre o estromales mesenquimales humanas (MSC) son progenitores somáticos capaces de diferenciarse en osteocitos, adipocitos, condrocitos y otros tipos de células1. Las MSC se aislaron por primera vez de la médula ósea y se derivan ampliamente del cordón umbilical, el tejido adiposo y otros tejidos2. Debido a que las UC-MSC se obtienen fácilmente y exhiben baja inmunogenicidad y efectos inmunosupresores, se aplican ampliamente en ensayos clínicos para tratar diversas enfermedades 3,4,5. Aunque la terapia con MSC muestra un potencial prometedor para el tratamiento de enfermedades, los efectos terapéuticos son inconsistentes entre individuos6. Sin embargo, la razón de la inestabilidad de la terapia MSC aún no está clara.
Las fluctuaciones moleculares, la morfología, la capacidad de diferenciación y la función terapéutica comprenden la heterogeneidad de las MSC. Algunos estudios también han postulado que las MSCs constituyen subpoblaciones con diferentes funciones 7,8 y han explorado la heterogeneidad de las MSC a través de la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq)9,10. Los resultados revelaron que las UC-MSC humanas tienen distintas subpoblaciones con características transcriptómicas específicas, mientras que pocos estudios han aislado con éxito las llamadas subpoblaciones de MSC. Previamente diseccionamos las UC-MSC humanas en tres subgrupos según sus firmas a través de scRNA-seq y análisis bioinformático, en los que la subpoblación BAMBIaltaMFGE8alta UC-MSC se purificó aún más y se probó funcionalmente11. Sin embargo, este subgrupo no logró aliviar la nefritis lúpica. Por lo tanto, es necesario probar los efectos terapéuticos de BAMBIaltoMFGE8alto MSC en otros trastornos para comprender sus funciones auténticas.
Este protocolo describe los métodos para aislarel subgrupo BAMBIaltoMFGE8 alto de UC-MSC humanas mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) mediante citometría de flujo y las características del subgrupo BAMBIaltoMFGE8alto.
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Protocolo
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki de 1989 y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Afiliado Drum Tower de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing (número de aprobación: 202019701). Los cordones umbilicales humanos se obtuvieron de madres sanas en el Hospital Afiliado Drum Tower de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing después del parto natural, quienes dieron su consentimiento informado para su uso en este trabajo. Las UC-MSCs primarias se aislaron de cordones umbilicales humanos, como se informó previamente11.
1. Cultivo e identificación de UC-MSC antes del aislamiento
- Una vez que las MSC alcancen el 70-80% de confluencia (P0), lavar las células una vez con PBS y añadir 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25% durante 2 min a 37 °C. Luego, agregue 9 mL de medio completo para neutralizar la tripsina, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugue a 300 × g durante 5 min para recolectar las células. Deseche el sobrenadante y agregue el medio completo adecuado para resuspender las células. Transfiera las células de cada placa a tres matraces T75 (P1) y cultive en una incubadora celular a 37 °C y 5% de CO2.
- Después de pasar las UC-MSCs 2x a través de la tripsinización, en P3, recoja las células siguiendo los mismos pasos descritos en el paso 1.1. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en el tampón de tinción FACS (1x PBS que contenga 2% de FBS) y cuéntelas. Añadir tampón de tinción FACS hasta una concentración final de 5-10 × 106 células/mL y mantener la suspensión celular en hielo.
- Distribuya 100 μL por tubo de esta suspensión celular en diferentes tubos de 1,5 mL. Añadir controles de isotipo y anticuerpos FACS contra CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 y HLA-DR (todos a 1:200) a las células a 4 °C durante 30 min.
- Lavar las células 2 veces con el tampón de tinción FACS y centrifugar a 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los precipitados en 200 μL de tampón de tinción FACS para el análisis de citometría de flujo para identificar marcadores MSC.
2. Aislamiento de BAMBIalto MFGE8alto UC-MSC por citometría de flujo
- Cultive UC-MSC a una densidad de aproximadamente 5-10 × 106 células al aislar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs. Disociar las células con EDTA 0,5 mM durante 5 min hasta que empiecen a tener una morfología redonda, añadir el medio completo para transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces para preparar una suspensión unicelular. Utilice 10 μL de la suspensión celular para contar las células y calcular el número total de células recolectadas. Centrifugar el tubo cónico con la suspensión celular a 300 × g durante 5 min para recoger las células.
- Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio completo hasta una concentración final de 5-10 × 106 células/mL y mantenga la suspensión celular en hielo.
- Divida las celdas en cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (solo celdas en blanco; Células marcadas con BAMBI; Células marcadas con MFGE8; y células marcadas con BAMBI y MFGE8).
- Agregue anticuerpos primarios a concentraciones apropiadas (MFGE8 y BAMBI, ambos a 1:100) a los tubos, mezcle e incube las células a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Lave las celdas marcadas una vez con 1x PBS y centrifugue a 300×g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio completo, agregue anticuerpos secundarios fluorescentes conjugados (IgG H&L anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647, todos a 1: 1,000) a las células, mezcle e incube las células a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad.
- Lave las celdas marcadas una vez con 1x PBS, como se describe en el paso 2.5. Vuelva a suspender las células en 500 μL de medio completo, filtre a través de un filtro de células de 70 μm para eliminar grumos y residuos, y transfiera el filtrado a un tubo de 15 mL para la clasificación por citometría de flujo.
- Ejecute el tubo de células en blanco sin agregar un anticuerpo (control negativo) y ajuste la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para controlar la escala de la población negativa con tinción de anticuerpos.
- Ejecute los tubos de células marcadas con anticuerpos individuales (es decir, MFGE8 + IgG H&L anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488, o BAMBI + IgG DE CABRA ANTI-CONEJO h&L Alexa Fluor 647) como control de compuerta para determinar dónde comienza la positividad en la parcela.
- Ejecute los tubos de muestra experimentales para clasificar y recolectar la alta población decélulas BAMBIMFGE8.
- Coloque las MSCBAMBI altasMFGE8clasificadas en una placa de 24 pocillos y cultive las células en una incubadora de células a 37 °C y 5% de CO2.
- Cuando las MSC clasificadas conalto contenidode MFGE8 conalto contenido de MFGE8 hayan crecido durante dos pasos para obtener suficientes células, disocie las células y realice un análisis posterior a la clasificación para garantizar la pureza de las poblaciones de células clasificadas mediante citometría de flujo, como se describe en los pasos 2.1-2.9. Alternativamente, examine la pureza de las células clasificadas con inmunofluorescencia convencional frente a la expresión humana de BAMBI y MFGE8 si el número de células recolectadas es demasiado pequeño.
3. Caracterización delas MSCs BAMBI de alto MFGE8
- Cultive las MSC clasificadasBAMBI altasMFGE8en una placa de 12 pocillos, examine su morfología celular bajo un microscopio y compárelas con la de las MSC sin clasificar.
NOTA: En general, las celdas BAMBIcon altocontenido de MFGE8 crecen más rápido que las UC-MSC sin clasificar. - Cuando las células tengan aproximadamente un 90% de confluentez en la placa de 12 pocillos, aspire el medio de cultivo celular, lave las células una vez con 1x PBS y agregue 500 μL de reactivo de extracción de ARN a las células. Agite el plato lentamente a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
- Pipetear la mezcla y transferirla a un tubo libre de RNasa y DNasa. Añadir 100 μL de cloroformo, tapar el tubo y agitar la mezcla vigorosamente mediante vórtice durante 15 s. Luego, deje que el tubo permanezca en RT durante 3 minutos.
- Centrifugar el tubo durante 15 min a 11.000 × g y 4 °C.
- Transfiera aproximadamente 200 μL de la capa acuosa superior a un tubo nuevo. Agregue el mismo volumen de isopropanol y pipetee bien hacia arriba y hacia abajo varias veces. Luego, deje reposar la mezcla a RT durante 10 minutos.
- Centrifugar durante 15 min a 11.000 × g y 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Agregue 500 μL de etanol al 75% al pellet en el tubo e invierta el tubo suavemente varias veces.
- Centrifugar el tubo durante 5 min a 6.000 × g y 4 °C. Deseche el sobrenadante. Repita la centrifugación una vez durante 10 s a 6.000 × g, aspire cuidadosamente el líquido restante con una pipeta y seque el tubo a RT.
- Agregue 10 μL de agua libre de ARNasa para disolver la pastilla de ARN y mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro.
- Siga las instrucciones del fabricante para sintetizar ADNc de primera cadena a partir de hasta 1 μg de ARN total.
- Utilice un kit de qPCR para detectar y cuantificar la expresión génica, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Las secuencias de los cebadores de ADN utilizados se enumeran en la Tabla 1.
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Resultados
La Figura 1 muestra los perfiles de expresión de marcadores de superficie celular de UC-MSC humanas. Las MSC cultivadas fueron fuertemente positivas para la expresión de CD44, CD73, CD90 y CD105 y negativas para la expresión de CD14, CD34, CD45, CD79 y HLA-DR. LasBAMBI con altocontenido de MFGE8 se clasificaron a partir de las UC-MSC humanas cultivadas, y su expresión de BAMBI y MFGE8 se volvió a analizar mediante citometría de flujo después de la expansión durante 3-4 ...
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Discusión
Este protocolo describe cómo aislar y enriquecer la subpoblaciónBAMBI altaMFGE8 alta de UC-MSCs humanas. El método es importante para el estudio posterior de la morfología, el crecimiento y la función de este subgrupo de MSC. Algunos pasos son vitales para el aislamiento exitoso y el alto rendimiento de las celdas BAMBIde altoMFGE8.
En primer lugar, el aspecto técnico más crítico a tener en cuenta es el uso de una so...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención n.º 82271843).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tubo de microcentrífuga de 0,6 mL | Corning | Axygen MCT-060-A | |
| de 1,5 mL Beijing | Labgic Technology | MCT-001-150 | |
| plato de cultivo celular de 100 mm | Beijing Labgic Technology | 12311 | |
| Placa de 12 pocillos | Beijing Labgic Technology | 11210 | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00115 | |
| placa de 24 pocillos | Beijing Labgic Technology | 11310 | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00150 | |
| 5 mL Tubos de fondo redondo | Corning | FALCON 352003 | |
| 70 μ filtro de células m | Falcon | 352350 | Dilución: 1:1000 |
| APC anti-humano CD79a (Igα) Anticuerpo | BioLegend | 333505 | 581 Dilución: 1:200 |
| APC/Cyanine7 anti-humano CD73 (Ecto-5'-nucleotidasa) Anticuerpo | BioLegend | 344022 | G46-6 Dilución: 1:200 |
| APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Control de isotipo | BD Bioscience | 557873 | MOPC-31C (Control de isotipo) Dilución: 1:200 |
| BAMBI anticuerpo | Bioss | bs-12418R | |
| Brilliant Violet 510 anti-ratón/humano CD44 Anticuerpo BioLegend | 103044 | 5E10 Dilución: 1:200 | |
| Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Anticuerpo Isotipo Ctrl | BioLegend | 400646 | MOPC-21 (control de isotipo) Dilución: 1:200 |
| Anticuerpo monoclonal CD105 (endoglin) APC | eBioscience | 17-1057-42 | HM47 Dilución: 1:200 |
| Portaobjetos de la cámara de recuento de células | Shanghái Centrífuga QIUJING | XB-K-25 | |
| Beijing BAIYANG | BY-320C | ||
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| Cloroformo | XILONG Scientific 13700908 | ||
| DMEM/F-12 (1:1) básico (1x) | Gibco | C11330500BT | |
| EDTA (0,5 M), pH 8,0, libre de rnasa | Invitrogen | AM9260G | Dilución: 1:1000 |
| Etanol | XILONG Scientific 12803405 | ||
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| FITC Ratón Anti-Humano CD34 | BD Bioscience | 555821 | IM7 Dilución: 1:200 |
| FITC Ratón Anti-Humano CD45 | BD Bioscience | 555482 | AD2 Dilución: 1:200 |
| FITC Ratón Anti-Humano HLA-DR | BD Bioscience | 555811 | SN6 Dilución: 1:200 |
| Citómetro de flujo | BD Bioscience | FACSAria™ III Clasificador de CélulasAria | |
| Flowjo | BD Bioscience | V10 | |
| Reactivo de Disociación Celular Suave | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| Cabra Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150113 | HI30 Dilución: 1:200 |
| Cabra Anti-Conejo IgG H& L (AlexaFluor 594) | abcam | ab150080 | Dilución: 1:1000 |
| HiScript II Q RT SuperMix para qPCR (+limpiador de ADNg) | Vazyme | R223-01 | |
| Microscopios invertidos | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Alcohol isopropílico | XILONG Scientific | 12802505 | |
| anticuerpo MFGE8 | Biorbyt | orb388429 | Dilución: 1:100 |
| Microcentrífuga | Thermo Fisher Scientific | FRESCO 21 | |
| Ratón IgG1 kappa Control de isotipo APC | eBioscience | 17-4714-42 | P3.6.2.8.1 (Control de isotipo) Dilución: 1:200 |
| Ratón IgG1 kappa Control de isotipo FITC | eBioscience | 11-4714-42 | eBMG2b (Control de isotipo) Dilución: 1:200 |
| Ratón IgG2b kappa Control de Isotipo FITC | eBioscience | 11-4732-42 | RTK4530 (control de isotipo) Dilución: 1:200 |
| PBS (10x) | Sangon Biotech (Shanghai) | E607016-0500 | |
| PE-Cy5 Ratón Anti-humano CD90 | BD Bioscience | 555597 | P3.6.2.8.1 (control de isotipos) Dilución: 1:200 |
| PE-Cy5 IgG1 de ratón y kappa; Control de isotipo | BD Bioscience | 550618 | |
| Penicilina-estreptomicina 100x | Cytiva | SV30010 Dilución: 1:100 | |
| Sistema de PCR en tiempo real | Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific | Q6 | |
| Agua libre de ARNasa | QIAGEN | 129112 | |
| Espectrofotómetro | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop One(840-317400) | |
| Puntas de micropipeta estériles | Beijing Labgic Technology | Dilución: matraz de cultivo celular 1:100 | |
| T75 | Beijing Labgic Technology | 13212A | |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific | Veriti | |
| Tri reactivo | Sigma Aldrich | T9424 | |
| Typsin-EDTA Solution | Bio-Channel Biotechnology | BC-CE-005 | |
| CO2 con camisa al agua; Incubadora | Thermo Fisher Scientific | 3111 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
