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Artículo de método

Un enfoque no viral para generar células T receptoras de antígenos quiméricos transitorios mediante ARNm para la inmunoterapia contra el cáncer

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DOI:

10.3791/67548

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21 de febrero de 2025

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1ProMab Biotechnologies

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento detallado para generar células T con receptor de antígeno quimérico transitorio (CAR) utilizando ARNm no integrador para la inmunoterapia contra el cáncer y proporciona métodos confiables para evaluar las células CAR-T y su función citotóxica.

Resumen

La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) se ha convertido en un tratamiento pionero contra el cáncer, logrando un éxito sin precedentes en el tratamiento de ciertas neoplasias hematológicas como linfomas y leucemias. Sin embargo, a medida que más pacientes con cáncer reciben terapias de células CAR-T, se informan cada vez más neoplasias malignas primarias secundarias asociadas al tratamiento, en parte debido a la inserción inesperada de transgenes CAR, lo que plantea graves problemas de seguridad. Para abordar este problema, describimos aquí un enfoque no viral y no integrador para generar células CAR-T transitorias utilizando ARNm. Electroporamos células T con ARNm modificado que codifica un CAR específico del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) y generamos células CAR-T transitorias dirigidas a HER2. El CAR se expresó de manera eficiente en la superficie de la célula T 1 día después de la electroporación, aumentó en el día 2 y disminuyó drásticamente en el día 5. Las células CAR-T transitorias mostraron una potente citotoxicidad contra las células de cáncer de ovario SKOV-3 HER2 positivas y secretaron altos niveles de IFN-Υ. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para el desarrollo de células CAR-T transitorias a pequeña escala sin integración permanente de transgenes CAR, describiendo procedimientos detallados para la preparación del ARNm de CAR, la activación y transfección de células T, la evaluación de la expresión de CAR y el análisis in vitro de la función de las células CAR-T. Este método es adecuado para la generación transitoria de células CAR-T tanto en estudios preclínicos como clínicos.

Introducción

El cáncer es una amenaza cada vez más importante para la salud humana, con una estimación anual de 23,6 millones de nuevos casos diagnosticados y 10 millones de muertes en todo el mundo1. El tratamiento quirúrgico combinado con radiación y quimioterapia sigue siendo el estándar de oro de atención para varios tipos de cánceres localizados, no invasivos e invasivos 2,3,4. Aunque el tratamiento sistemático tradicional ha logrado un gran éxito en el manejo de los cánceres en etapas tempranas, es muy tóxico y tiene un efecto limitado en los cánceres metastásicos y hematológicos5. Los pacientes con estos cánceres se someten a tratamientos frecuentes y soportan una toxicidad significativa con la esperanza de estabilizar y retrasar la progresión de la enfermedad. La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) ha surgido recientemente como una terapia dirigida revolucionaria que demuestra una potente eficacia para los cánceres hematológicos de células B y ofrece esperanza a estos pacientes desesperados6.

Las células CAR-T son linfocitos T modificados genéticamente que expresan un CAR en la superficie celular que reconoce específicamente los antígenos asociados al tumor (TAA) y activa las células sin requerir la presentación antigénica de las principales proteínas del complejo de histocompatibilidad (MHC)7. Tras la activación, las células CAR-T secretan un panel de citocinas y lisan las células tumorales independientemente de los MHC, lo que aumenta la destrucción de los tumores incluso cuando los MHC están regulados a la baja o se pierden debido al microambiente tumoral inmunosupresor 8,9. Los CAR constan de al menos tres dominios distintos: una variante extracelular de fragmento de cadena única (scFv) que contiene las regiones variables de reconocimiento de antígenos de un anticuerpo específico de TAA, un dominio transmembrana que ancla el CAR a la superficie celular y un dominio intracelular que media el reclutamiento de proteínas adaptadoras y la señalización posterior10. Sobre la base de las variaciones en los dominios intracelulares, las estructuras CAR han evolucionado a lo largo de cinco generaciones hasta ahora, con la primera generación conteniendo solo el dominio de activación CD3ζ y las generaciones posteriores poseyendo uno o más dominios coestimuladores adicionales de moléculas como 4-1BB y CD2811. Estos dominios intracelulares afectan a los mecanismos de señalización, proliferación, supervivencia y toxicidad de las células CAR-T, que en conjunto determinan la eficacia clínica antitumoral. El éxito clínico de la terapia con células CAR-T proviene de las células CAR-T de segunda generación que se dirigen específicamente a CD19, un biomarcador altamente expresado en las células de linaje B, para el tratamiento de leucemias y linfomas de células B12,13. Hasta la fecha, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) ha aprobado seis terapias de células CAR-T de segunda generación dirigidas a CD-19 o al antígeno de maduración de células B (BCMA) para neoplasias hematológicas malignas recidivantes o refractarias, incluido el linfoma de células B grandes, el linfoma de células del manto y el mieloma múltiple 6. Las nuevas generaciones de células CAR-T están siendo sometidas actualmente a intensos estudios preclínicos y clínicos14,15.

La producción clínica de células CAR-T es un proceso complejo, costoso y que requiere mucho tiempo. En la actualidad, los leucocitos utilizados para la preparación de linfocitos CAR-T provienen de los propios pacientes para evitar reacciones alogénicas, aunque las linfocitos CAR-T universales (o listas para usar) derivadas de donantes están en desarrollo activo y evaluación clínica16. Tras el aislamiento de los leucocitos de la sangre periférica del paciente mediante leucoféresis, se introduce en las células T activadas un fragmento de gen extraño que codifica el CAR utilizando abordajes virales o no virales 17,18,19. Los retrovirus y lentivirus son los vectores virales más comunes para la entrega del gen CAR, lo que resulta en la integración aleatoria y permanente del ADN que codifica para CAR en el genoma de las células T20. Los enfoques no virales, como las nanopartículas lipídicas de ARNm, los sistemas de transposones y la edición del genoma CRISPR/Cas9, son menos comunes21. Posteriormente, las células T que expresan CAR se expanden ex vivo a gran escala y luego se recogen y se vuelven a infundir en los pacientes22,23. La fabricación de vectores virales que cumplan con los estrictos estándares de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) es muy difícil, compleja y costosa, lo que supone una carga significativa para los fabricantes, las agencias reguladoras y los pacientes, lo que limita su aplicación clínica generalizada.

A pesar del emocionante éxito de la terapia CAR-T, existe una creciente preocupación por su seguridad. Dada la naturaleza aleatoria de la integración del transgén CAR en el genoma de las células T durante la transducción viral o de transposones, puede producirse una alteración de los genes supresores de tumores o la activación de oncogenes, lo que conduce a una transformación maligna de las células T24,25. Desde la aprobación por parte de la FDA del primer producto de terapia de células CAR-T en 2017, los estudios de seguimiento muestran que hasta el 15% de los pacientes que reciben la terapia desarrollan neoplasias malignas primarias secundarias (SPM) como el linfoma de células T (TCL), el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y el cáncer de piel 26,27,28,29. Sorprendentemente, los transgenes CAR fueron altamente detectados en algunos SPMs30,31, y algunos casos de TCL fueron causados directamente por una expansión anormal de las células CAR-T 24,32,33, lo que indica un papel directo de los productos CAR-T en la inducción de algunos SPMs. Otros estudios identificaron además inserciones de transgenes CAR en genes críticos como TET234, JAK135 y PBX236 en las células tumorales SPM. A la luz de la evidencia acumulada de neoplasias malignas de células T después de la terapia con células CAR-T, la FDA concluyó recientemente que se requiere un recuadro de advertencia que destaque un riesgo grave de malignidad de células T para todas las terapias de células CAR-T dirigidas a CD19 y BCMA actualmente aprobadas37. Sin embargo, los estudios de cohortes grandes que siguen los efectos a largo plazo del tratamiento con CAR-T informan una incidencia de SPM que oscila entre el 3,8% y el 15% entre los pacientes tratados 26,27,28,38,39. La incidencia no es significativamente mayor que la observada en los pacientes con cáncer de sangre que reciben tratamiento sistemático tradicional40,41, lo que sugiere un perfil relativamente seguro para la terapia con células CAR-T. No obstante, existe una necesidad urgente de desarrollar células CAR-T seguras y eficaces que minimicen el riesgo de SPM a través de enfoques más rentables.

Aquí, describimos un protocolo detallado para un enfoque no viral y no integrador para generar células CAR-T. El objetivo es proporcionar una guía sencilla, paso a paso, para generar células CAR-T efectivas a pequeña escala con expresión transitoria de CAR, evitando así la mutagénesis insercional y minimizando el riesgo de SPM. Demostramos que la electroporación de linfocitos T con ARNm modificado que codifica un CAR específico para el TAA HER2 resultó en una expresión robusta y transitoria del CAR anti-HER2 en la superficie de la célula T. Al expresar el CAR, las células T mataron de forma potente a las células tumorales HER2 positivas y secretaron un alto nivel de IFN-Υ. El protocolo se describe en cuatro secciones separadas pero continuas que incluyen la preparación del ARNm de CAR, la activación y electroporación de las células T, la evaluación de la expresión de CAR y el análisis de la función de las células CAR-T. Este enfoque es adecuado para desarrollar y producir células CAR-T transitorias tanto para la investigación académica como para las terapias celulares clínicas.

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Protocolo

Las PBMC utilizadas aquí se aislaron previamente de sangre total del Centro de Sangre del Hospital de Stanford de acuerdo con el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) (13942) utilizando el gradiente de densidad de Ficoll-Paque descrito anteriormente42. El consentimiento informado de los participantes no fue aplicable, ya que la sangre que utilizamos para recolectar los PBMC se obtuvo comercialmente del Centro de Sangre del Hospital de Stanford.

1. Preparación del ARNm de CAR

  1. Preparación de la plantilla
    NOTA: Un plásmido linealizado o un fragmento de PCR pueden servir como molde para sintetizar ARNm de CAR in vitro, siempre que contengan un promotor 5' SP6 o T7 adecuado, una región no traducida (UTR) 5', un transgén CAR y un 3'UTR con una cola de poli(A) adecuada. En este estudio, utilizamos una construcción de ADN plasmídico CAR que contenía un promotor SP6, una betaglobina humana 5'UTR corta, un transgén CAR y una 3'UTR compuesta por dos beta-globina 3'UTR en tándem seguidas de una cola de poli(A) de 112 pb43. Las UTRs, la secuencia codificante y la cola de poli(A) afectan la estabilidad del ARN y la eficiencia traduccional 43,44,45. Se ha demostrado que una cola de poli(A) de 120 pb aumenta el rendimiento de proteínas en cultivo celular en comparación con las colas de poli(A) más cortas43.
    1. Prepare el ADN plásmido de construcción de CAR utilizando un kit de preparación de plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido de alta calidad es esencial para generar un alto rendimiento de ARNm de CAR.
    2. Linealizar el ADN del plásmido CAR con la enzima de restricción BglII. Elija una enzima de restricción que corte después de la cola de poli(A), preferiblemente cerca del final de la cola de poli(A). Digiera 10 μg (o 10.000 ng) del plásmido cuantificado por un espectrofotómetro en una mezcla de reacción de 100 μL que contenga 10 U de la enzima, 10 μL de tampón de digestión y agua libre de nucleasa durante la noche a 37 °C.
      NOTA: Asegúrese de que la enzima de restricción no corte dentro del transgén CAR y sus secuencias de cola promotora flanqueante, UTR y poli(A). La linealización completa del plásmido CAR es necesaria para una transcripción eficiente del ARNm de CAR.
    3. Añadir 200 μg/mL de proteasa K y 0,5% p/v de SDS a la mezcla de digestión e incubar a 50 °C durante 1 h.
    4. Purificar el ADN plasmídico CAR linealizado. Añadir un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1, v/v) a la reacción de digestión. Vórtice vigorosamente durante aproximadamente 15 s. Centrifugar la muestra en una centrífuga de sobremesa a máxima velocidad durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
    5. Transfiera la capa acuosa superior, que contiene el ADN, a un nuevo tubo de microcentrífuga. Evite la transferencia de cualquiera de las capas intermedia e inferior, que contienen impurezas de proteínas y fenoles. Realizar una segunda ronda de extracción con cloroformo para reducir las impurezas.
    6. Añadir 1/10de volumen de acetato de amonio 7,5 M o acetato de sodio 3 M y mezclar suavemente. Agregue 2,5 volúmenes de etanol para precipitar el ADN. Almacene la muestra a -20 °C durante al menos 30 minutos.
    7. Centrifugar la muestra a máxima velocidad durante 15 minutos a 4 °C para granular el ADN. Retire el sobrenadante con cuidado. Agregue 500 μL de etanol al 70% para lavar el pellet de ADN.
    8. Vuelva a centrifugar la muestra durante 2 minutos a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante. Deje una pequeña cantidad de solución en el tubo.
    9. Repita el centrifugado durante 2 minutos a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante restante. Seque al aire el pellet de ADN en RT durante unos 10 minutos en una campana estéril hasta que no se vea ninguna solución de etanol en el fondo del tubo.
      NOTA: Evite secar demasiado la bolita de ADN, ya que podría ser difícil de disolver.
    10. Agregue 20 μL de agua sin nucleasas y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para disolver el ADN. Centrifugar la muestra brevemente a la máxima velocidad. Mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro.
    11. Almacene la muestra en hielo para su uso inmediato o a -20 °C para su uso futuro. Cargue 100 ng del ADN purificado en un gel de agarosa y verifique el tamaño y la integridad. El ADN debe aparecer como una banda única y distinta del tamaño esperado. No se deben observar bandas adicionales o manchadas.
      NOTA: La calidad del ADN molde es fundamental para una transcripción eficiente del ARNm. Evite utilizar ADN impuro, fragmentado y degradado como molde para la transcripción del ARNm.
  2. Transcripción in vitro (IVT)
    1. Sintetizar el ARNm de CAR in vitro. Asegúrese de utilizar reactivos, tubos y puntas de pipeta sin nucleasas durante todo el procedimiento.
    2. Descongele los reactivos enumerados en la Tabla 1 a RT, excepto la mezcla de ARN polimerasa SP6, que debe almacenarse a -20 °C hasta su uso. Prepare la reacción de transcripción en el orden que se muestra en la Tabla 1 en RT. Mezcle suavemente e incube a 37 °C durante al menos 2 h.
      NOTA: La reacción puede ampliarse o reducirse en función de la cantidad de ARNm necesaria. La reacción que se muestra arriba suele producir al menos 100 μg (o 100.000 ng) de ARNm tapado cuando se utiliza ADN molde de alta calidad. Una incubación más larga, es decir, durante la noche, puede aumentar el rendimiento del ARNm.
    3. Añadir 2 μL de DNasa I libre de ARNasa a la reacción, mezclar suavemente e incubar durante 15 min a 37 °C para degradar el ADN molde.
    4. Purifique el ARNm de CAR transcrito utilizando un kit de limpieza de ARN (consulte la tabla de materiales). Siga las instrucciones del fabricante del kit para la purificación. Eluir el ARNm en agua libre de nucleasas.
      NOTA: El ARNm también se puede purificar utilizando el método de extracción de fenol-cloroformo que se muestra arriba (paso 1.1.4).
    5. Mida la concentración de ARNm con un espectrofotómetro. Cargue al menos 200 ng de ARNm en un gel de agarosa y verifique su tamaño e integridad. El ARNm debe aparecer como una banda dominante del tamaño esperado, sin bandas adicionales o frotadas. Almacene el ARNm a -80 °C hasta su uso.

2. Activación y electroporación de la célula T

  1. Suspender 1 x 106 células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) criopreservadas en 1 mL de medio CAR-T (medio AIM-V suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina/estreptomicina y 10 ng/ml de IL-2 recombinante humana). Active las células T con un número igual de perlas de Activador T humano CD3/CD28 prelavadas (consulte la Tabla de materiales). Cultivar y expandir las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 durante varios días.
    NOTA: La cantidad de PBMC se puede aumentar o reducir en función de la cantidad de células T necesarias para los experimentos posteriores.
  2. Descongele el ARNm de CAR preparado en hielo. Agregue 1 mL de medio CAR-T por pocillo a dos pocillos de una placa de 12 pocillos y equilibre el medio colocando la placa en la incubadora a 37 °C.
  3. Transfiera 5 x 106 células T a un tubo estéril y retire las perlas colocando el tubo en un soporte magnético y pipeteando cuidadosamente la suspensión de células a un tubo nuevo.
  4. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de PBS estéril.
  5. Vuelve a centrifugar el tubo. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón Neon T (ver Tabla de Materiales).
  6. Pipetear 100 μL de células a un tubo nuevo y añadir 5 μg (o 5.000 ng) de ARNm de CAR a las células46. Complemente Neon buffer T hasta un total de 125 μL y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: La cantidad de ARNm de CAR que se transfectará por electroporación puede aumentarse hasta 8 μg (o 8.000 ng) por 1 x 106 células T sin afectar negativamente la viabilidad celular, y una mayor cantidad de ARNm puede conducir a un aumento de la expresión de CAR46.
  7. Agregue 25 μL de tampón Neon T a las 100 μL de celdas restantes. Esto sirve como el control negativo.
  8. Electroporar las células T. Utilice la pipeta Neon para aspirar la mezcla de linfocitos T/ARNm CAR o los linfocitos T de control negativo en una punta Neon de 100 μL y electroporar las células con un pulso de 10 ms de 1800 V.
  9. Transfiera inmediatamente las células al medio de cultivo equilibrado en la placa de 12 pocillos (preparada en el paso 2.2) después de la electroporación.
  10. Regrese la placa a la incubadora y expanda las celdas hasta que estén listas para usar. Para garantizar un crecimiento saludable y rápido de las células CAR-T, mantenga la densidad celular entre 1−3 x 106 células/mL con medio fresco hasta que sea necesario.

3. Evaluación de la expresión de CAR

  1. Mezcle las células T con CAR pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces en cada pocillo, y transfiera al menos 1 x 105 células a un tubo FACS de 5 mL.
  2. Agregue 3 mL de tampón de lavado en frío (PBS que contiene 2 mM de EDTA y 0.5% p/v BSA) al tubo. Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 min a RT. Retirar el sobrenadante con cuidado.
  3. Vuelva a suspender el pellet celular en 100 μL de tampón de lavado. Añadir 2 μL del anticuerpo IgG F(ab')2 anti-humano de cabra conjugado con aloficocianina (APC) conjugado con reactivo de detección CAR (ver Tabla de Materiales) y 2 μL de un colorante de viabilidad 7-AAD en las células en suspensión.
    NOTA: El CAR también se puede detectar utilizando un antígeno objetivo debidamente marcado o un anticuerpo anti-marca si el CAR contiene una etiqueta (es decir, FLAG). Si se utiliza un anticuerpo no marcado para la detección de CAR, se requiere la incubación con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia adecuado después del paso 3.4.
  4. Mezclar la muestra agitando suavemente el tubo e incubar en hielo durante 30 min. Evite la luz durante la incubación. Lave las celdas con 3 mL de tampón de lavado en frío y centrifugue el tubo a 500 x g durante 5 min en RT.
  5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón de lavado. Analice las células con un citómetro de flujo inmediatamente. Asegúrese de que la etiqueta fluorescente del reactivo de detección y el colorante de viabilidad se compensen correctamente con los controles positivos y negativos adecuados.
  6. Evalúe la expresión de CAR utilizando la siguiente estrategia de compuerta: Puerta en las celdas usando el gráfico FSC-A vs SSC-A; Puerta en las celdas individuales usando el gráfico FSC-A vs FSC-H; Cierre las células vivas mediante la tinción 7-AAD.
  7. Calcule el porcentaje de células T vivas que fueron teñidas por el anticuerpo IgG F(ab')2 humano. Compare las células CAR-T con las células T de control negativas, que deben tener una tinción mínima.

4. Análisis de la función de las células CAR-T

  1. Análisis de citotoxicidad
    1. Asegúrese de que las células tumorales diana expresen el antígeno en una conformación que pueda ser reconocida por el CAR. Para confirmar la expresión del antígeno, se analizaron las células tumorales mediante citometría de flujo utilizando el anticuerpo original del que se derivó el CAR. Si el CAR no puede reconocer las células tumorales, entonces las células CAR-T no lograrán matar las células tumorales.
    2. Preparar las células tumorales diana que expresan el antígeno del CAR en la superficie celular. Tripsinizar las células tumorales adherentes con una solución de tripsina-EDTA al 0,05% durante 1 min a 37 °C y preparar la suspensión unicelular con un medio de cultivo adecuado a 1-4 x 105 células/mL.
      NOTA: Las células tumorales deben estar bien adheridas para garantizar un análisis preciso en los pasos posteriores. Si las células tumorales se adhieren mal, se desprenden fácilmente o crecen en suspensión, cubra los pocillos de la placa utilizada en el siguiente paso con un anticuerpo adecuado, un polímero policatiónico o material biológico como fibronectina o colágeno para facilitar la adhesión celular.
    3. Prepare una placa electrónica (consulte la tabla de materiales). Diseña la configuración experimental. Agregue 50 μL de medio de cultivo de células tumorales precalentado en cada pocillo y coloque la placa E en el instrumento de análisis celular en tiempo real (RTCA) para medir la impedancia de fondo. Mida la impedancia a 1 minuto por medición (o barrido) durante 3 barridos.
      NOTA: La impedancia de fondo se utiliza para establecer el índice de celda en cero. Sin la medición de la impedancia de fondo, los pozos no se pueden comparar entre sí, lo que hace que los resultados no sean interpretables.
    4. Retire la placa E del instrumento RTCA y agregue 100 μL de la suspensión de células tumorales a cada pocillo. Por lo tanto, cada pocillo contiene 1−4 x 104 celdas en un volumen total de 150 μL.
      NOTA: El número de células tumorales que se sembrarán en cada pocillo debe determinarse antes del experimento. Siembre la placa E con un rango de números de celda, luego monitoree los índices de celdas durante las próximas 24 a 48 horas. El número deseado de células mantiene un aumento constante en el índice celular durante al menos 24 horas sin estabilizarse. La siembra excesiva de células puede acelerar el agotamiento de nutrientes y la acidificación del medio, lo que resulta en un estancamiento temprano del índice celular. Además, se deben incluir pozos replicados para cada grupo a fin de identificar posibles mediciones atípicas.
    5. Equilibre la placa E en RT durante 30 min. Este paso permite que las células tumorales se asienten y se adhieran al fondo de los pocillos.
      NOTA: Este paso es necesario para una medición precisa del índice de celdas. Saltarse este paso suele provocar una variabilidad de pocillo a pocillo en las mediciones del índice celular y una adhesión desigual de las células tumorales dentro de los pocillos, lo que provoca un aumento del ruido en el ensayo.
    6. Vuelva a colocar la placa E en el instrumento RTCA y controle los índices de las células durante unas 24 horas, con barridos cada 5-15 minutos.
    7. Al día siguiente, prepare la suspensión de celdas CAR-T. Suspenda las células CAR-T (las células efectoras) del paso 2.10 en medio RPMI 1640 más 10% de FBS hasta una concentración determinada por la célula tumoral (la célula diana) y la proporción deseada de células efectora:diana (E:T). Por ejemplo, si la suspensión de células tumorales tenía una densidad de 2 x 105 células/ml y se desea una relación E:T de 10:1, entonces las células CAR-T deben suspenderse a 2 x 106 células/ml. Incluya controles adecuados, como células tumorales solas (sin células efectoras) y células T de control (células T electroporadas sin ARNm o con ARNm de control).
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, utilice las células CAR-T 1-2 días después de la electroporación cuando la expresión de CAR en la superficie sea alta. Para explorar la relación E:T óptima, se puede probar un rango de relaciones E:T (por ejemplo, de 3:1 a 20:1). A menos que la frecuencia de CAR-T sea muy baja, es decir, inferior al 10%, una relación E:T de 10:1 o 20:1 suele ser suficiente para lograr la eliminación casi completa de las células tumorales.
    8. Detenga la grabación del índice de celdas y retire la placa E del instrumento RTCA.
    9. Incline ligeramente la placa, retire 50 μL de medio de cultivo de cada pocillo con cuidado sin tocar las células tumorales y agregue 100 μL de las células CAR-T o células T de control en cada pocillo.
    10. Regrese la placa E al instrumento RTCA y reanude el monitoreo del índice celular durante al menos 24 h con barridos tomados cada 5-15 min.
      NOTA: La duración del monitoreo del índice celular depende de la rapidez con la que las células CAR-T se dirigen a las células tumorales. Un período de incubación de 24 horas suele ser suficiente para que las células CAR-T ejerzan el máximo efecto citotóxico.
    11. Detenga el monitoreo del índice celular, retire la placa E del instrumento RTCA y analice el resultado de la citotoxicidad. Calcule la citotoxicidad como el porcentaje de células tumorales que fueron destruidas por las células CAR-T. Calcule la citotoxicidad media de las células CAR-T y controle las células T utilizando el software RTCA. Para calcular la citotoxicidad manualmente, utilice la fórmula
      citotoxicidad = ((índice celular de células tumorales) − (índice celular de células tumorales más células efectoras)) / (índice celular de células tumorales) × 100%.
  2. Análisis de secreción de citocinas
    1. Para analizar las citocinas como el IFN-Υ secretadas por las células CAR-T durante el análisis de citotoxicidad, transfiera el sobrenadante de la placa E a una placa de 96 pocillos de fondo redondo o en forma de V.
      NOTA: Si se desea un análisis de curso temporal de la secreción de citocinas, detenga el monitoreo del índice celular en el paso 4.1.10, recoja una pequeña porción del sobrenadante de cada pocillo, devuelva la placa E al instrumento RTCA y reanude el monitoreo.
    2. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 300 x g durante 5 min en RT. Transfiera con cuidado los sobrenadantes a una nueva placa de 96 pocillos sin alterar los gránulos de la celda.
    3. Mida los niveles de citocinas en los sobrenadantes utilizando kits comerciales de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes generalmente requieren dilución antes de la medición, a veces más de 100 veces, dependiendo de las citocinas que se están analizando.
    4. Analice los datos interpolando los valores de absorbancia de la muestra con una curva estándar generada a partir de patrones diluidos en serie. Prepare gráficos con barras de error que representen la media ± la desviación estándar (DE) utilizando el software adecuado. Para comparar la diferencia entre tratamientos, se puede realizar una prueba t de Student. Un valor p inferior a 0,05 suele considerarse estadísticamente significativo.
      NOTA: Los puntos de datos que son valores atípicos claros, probablemente debido a errores experimentales, deben excluirse del análisis.

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Resultados

Construimos un CAR dirigido a HER2 de segunda generación que contiene un scFv derivado del anticuerpo monoclonal (mAb) de ratón (mAb) humanizado anti-HER24D5 47, una región transmembrana y un dominio coestimulador intracelular 4-1BB seguido del dominio de activación CD3ζ (Figura 1A). La secuencia de ADN que codifica el CAR contenía un promotor 5' SP6 para impulsar la transcripción del ARNm del CAR in vitro (Figura 1B). El ARNm de...

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Discusión

En este estudio, describimos un enfoque detallado no viral y no integrador para generar células CAR-T transitorias y proporcionamos procedimientos técnicos para evaluar la función de las células CAR-T. Este enfoque evita el uso de vectores retrovirales y lentivirales convencionales para la administración permanente y aleatoria de transgenes CAR, y en su lugar aprovecha la electroporación para introducir de manera eficiente ARNm CAR modificado in vitro en las células T. Este méto...

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Divulgaciones

Los autores Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li y Vita Golubovskaya son empleados de ProMab Biotechnologies. Lijun Wu es empleado y accionista de ProMab Biotechnologies.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de ProMab Biotechnologies.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tinte de viabilidad 7-AAD  Biolegend420404
ACEA Citómetro de flujo NovocyteAgilentNovoCyte 3000
AIM-V medioGibco12055083
APC anticuerpo IgG F(ab')2 antihumano de cabraImmunoResearch Laboratories109-136-097
Enzima de restricción BglIINueva Inglaterra BioLabs (NEB)R0144L
3&agudo;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Estructura de la tapa de ARN analógicaNEBS1411S
DMEM, alta glucosaGibco11965092
Dynabeads Activador T humano CD3/CD28 perlasGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EtanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 Kit de síntesis de ARNNew England BioLabs (NEB)E2070S
Proteína recombinante IL-2 humanaGibco15140122
Marcadores de ARN del milenioInvitrogenAM7150
Kit de limpieza de ARN monarca (500 μ g)NEBT2050L
N1-Metilpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Instrumento de transfección de neónInvitrogenMPK5000
Sistema de transfección de neón 100-μ L KitInvitrogenMPK10096
Penicilina-Estreptomicina (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MedioGibco11875135
Tripsina-EDTA (0.05%), rojo fenolGibco25300120
UltraPure Phenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Instrumento de análisis celular en tiempo real (RTCA)AgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plásmido Midiprep KitZymo ResearchD4201
Jackson

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