Este protocolo describe un procedimiento detallado para generar células T con receptor de antígeno quimérico transitorio (CAR) utilizando ARNm no integrador para la inmunoterapia contra el cáncer y proporciona métodos confiables para evaluar las células CAR-T y su función citotóxica.
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Artículo de método
Un enfoque no viral para generar células T receptoras de antígenos quiméricos transitorios mediante ARNm para la inmunoterapia contra el cáncer
En este artículo
Resumen
Resumen
La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) se ha convertido en un tratamiento pionero contra el cáncer, logrando un éxito sin precedentes en el tratamiento de ciertas neoplasias hematológicas como linfomas y leucemias. Sin embargo, a medida que más pacientes con cáncer reciben terapias de células CAR-T, se informan cada vez más neoplasias malignas primarias secundarias asociadas al tratamiento, en parte debido a la inserción inesperada de transgenes CAR, lo que plantea graves problemas de seguridad. Para abordar este problema, describimos aquí un enfoque no viral y no integrador para generar células CAR-T transitorias utilizando ARNm. Electroporamos células T con ARNm modificado que codifica un CAR específico del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) y generamos células CAR-T transitorias dirigidas a HER2. El CAR se expresó de manera eficiente en la superficie de la célula T 1 día después de la electroporación, aumentó en el día 2 y disminuyó drásticamente en el día 5. Las células CAR-T transitorias mostraron una potente citotoxicidad contra las células de cáncer de ovario SKOV-3 HER2 positivas y secretaron altos niveles de IFN-Υ. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para el desarrollo de células CAR-T transitorias a pequeña escala sin integración permanente de transgenes CAR, describiendo procedimientos detallados para la preparación del ARNm de CAR, la activación y transfección de células T, la evaluación de la expresión de CAR y el análisis in vitro de la función de las células CAR-T. Este método es adecuado para la generación transitoria de células CAR-T tanto en estudios preclínicos como clínicos.
Introducción
El cáncer es una amenaza cada vez más importante para la salud humana, con una estimación anual de 23,6 millones de nuevos casos diagnosticados y 10 millones de muertes en todo el mundo1. El tratamiento quirúrgico combinado con radiación y quimioterapia sigue siendo el estándar de oro de atención para varios tipos de cánceres localizados, no invasivos e invasivos 2,3,4. Aunque el tratamiento sistemático tradicional ha logrado un gran éxito en el manejo de los cánceres en etapas tempranas, es muy tóxico y tiene un efect....
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Protocolo
Las PBMC utilizadas aquí se aislaron previamente de sangre total del Centro de Sangre del Hospital de Stanford de acuerdo con el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) (13942) utilizando el gradiente de densidad de Ficoll-Paque descrito anteriormente42. El consentimiento informado de los participantes no fue aplicable, ya que la sangre que utilizamos para recolectar los PBMC se obtuvo comercialmente del Centro de Sangre del Hospital de Stanford.
1. Preparación del ARNm de CAR
- Preparación de la plantilla
NOTA: Un plásmido lineal....
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Resultados
Construimos un CAR dirigido a HER2 de segunda generación que contiene un scFv derivado del anticuerpo monoclonal (mAb) de ratón (mAb) humanizado anti-HER24D5 47, una región transmembrana y un dominio coestimulador intracelular 4-1BB seguido del dominio de activación CD3ζ (Figura 1A). La secuencia de ADN que codifica el CAR contenía un promotor 5' SP6 para impulsar la transcripción del ARNm del CAR in vitro (Figura 1B). El ARNm de.......
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Discusión
En este estudio, describimos un enfoque detallado no viral y no integrador para generar células CAR-T transitorias y proporcionamos procedimientos técnicos para evaluar la función de las células CAR-T. Este enfoque evita el uso de vectores retrovirales y lentivirales convencionales para la administración permanente y aleatoria de transgenes CAR, y en su lugar aprovecha la electroporación para introducir de manera eficiente ARNm CAR modificado in vitro en las células T. Este méto.......
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Divulgaciones
Los autores Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li y Vita Golubovskaya son empleados de ProMab Biotechnologies. Lijun Wu es empleado y accionista de ProMab Biotechnologies.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de ProMab Biotechnologies.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tinte de viabilidad 7-AAD | Biolegend | 420404 | |
| ACEA Citómetro de flujo Novocyte | Agilent | NovoCyte 3000 | |
| AIM-V medio | Gibco | 12055083 | |
| APC anticuerpo IgG F(ab')2 antihumano de cabra | ImmunoResearch Laboratories | 109-136-097 | |
| Enzima de restricción BglII | Nueva Inglaterra BioLabs (NEB) | R0144L | |
| 3&agudo;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Estructura de la tapa de ARN analógica | NEB | S1411S | |
| DMEM, alta glucosa | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Activador T humano CD3/CD28 perlas | Gibco | 11131D | |
| E-Plate 96 | Agilent | 5232376001 | |
| Etanol | Sigma | 459844-4L | |
| FBS | Lonza.com | 14-503F | |
| HiScribe SP6 Kit de síntesis de ARN | New England BioLabs (NEB) | E2070S | |
| Proteína recombinante IL-2 humana | Gibco | 15140122 | |
| Marcadores de ARN del milenio | Invitrogen | AM7150 | |
| Kit de limpieza de ARN monarca (500 μ g) | NEB | T2050L | |
| N1-Metilpseudo-UTP | Trilink | N-1081-10 | |
| Instrumento de transfección de neón | Invitrogen | MPK5000 | |
| Sistema de transfección de neón 100-μ L Kit | Invitrogen | MPK10096 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10000 U/mL) | Gibco | 14-503F | |
| RPMI 1640 Medio | Gibco | 11875135 | |
| Tripsina-EDTA (0.05%), rojo fenol | Gibco | 25300120 | |
| UltraPure Phenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593049 | |
| xCELLigence Instrumento de análisis celular en tiempo real (RTCA) | Agilent | RTCA MP | |
| ZymoPURE II Plásmido Midiprep Kit | Zymo Research | D4201 |
Referencias
- Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376(2021).
- Jordan, R. M., Oxenberg, J.
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Reimpresiones y permisos
