Artículo de método

Identificación de sitios de integración de lentivirus funcionalmente relevantes en una biblioteca de células de mutagénesis insercional

DOI:

10.3791/67552

⸱

10 de enero de 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

En este artículo

Resumen

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La mutagénesis insercional es una herramienta esencial en genética avanzada para identificar elementos genómicos funcionales. Aquí, describimos el Cribado basado en la inserción para elementos funcionales y transcripciones (InSET), un método para detectar sitios de integración de lentivirus dentro de una biblioteca de células de mutagénesis de inserción basada en lentivirus.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La extensión de las secuencias funcionales dentro del genoma humano es un tema fundamental pero debatido en biología. Aunque los cribados genéticos inversos de alto rendimiento han hecho grandes avances en la exploración de este tema, a menudo limitan su alcance a elementos genómicos conocidos y pueden introducir efectos no específicos. Esto subraya la necesidad urgente de nuevas herramientas de genómica funcional que permitan una comprensión más profunda e imparcial de la funcionalidad del genoma. Este protocolo introduce el Cribado basado en la inserción de elementos funcionales y transcripciones (InSET), un método para identificar los sitios de integración de lentivirus dentro de una biblioteca de células de mutagénesis de inserción basada en lentivirus. InSET facilita la captura de sitios de integración lentiviral en todo el genoma, con la secuenciación de próxima generación utilizada para detectar y cuantificar secuencias flanqueantes. El diseño de InSET permite el análisis a gran escala de las variaciones en la abundancia de sitios de integración en cribados fenotípicos, lo que lo convierte en una herramienta robusta para la genética avanzada y para la identificación de elementos genómicos funcionales. Un beneficio clave de InSET es su capacidad para revelar elementos genómicos no identificados previamente, incluidos nuevos exones funcionales de ARN codificantes y no codificantes de proteínas, independientemente de la anotación previa. En general, InSET tiene un valor significativo en el estudio de la compleja complejidad del genoma humano y el transcriptoma, donde muchos elementos genómicos esperan una caracterización funcional.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La genómica funcional sigue siendo un campo crucial y desafiante, incluso en la era post-genoma, con una porción significativa de regiones genómicas que aún carecen de caracterización funcional. Una razón clave para estos desafíos radica en la naturaleza intrincada del genoma humano y el transcriptoma, que se caracterizan por la transcripción generalizada y el empalme alternativo universal tanto en regiones codificantes como no codificantes de proteínas1,2,3,4,5. Esta complejidad se ha destacado ampliamente a través de estudios de enriquecimiento dirigidos al ARN6,7,8,9. Cada vez se reconoce más que numerosos elementos genómicos novedosos permanecen sin mapear y funcionalmente sin anotar10,11,12además de los segmentos bien anotados del genoma humano.

En los últimos años, se han visto avances en herramientas de genética inversa, como la interferencia de ARN (RNAi) y los sistemas CRISPR/Cas13,14,15,16,17,18,19,20,21. Sin embargo, estos métodos tienen desventajas notables, incluyendo efectos no específicos y altos costos asociados con la generación de bibliotecas complejas de ARN de horquilla corta (shRNAs) o RNAs de guía única (sgRNAs)22,23,24,25. Además, estos métodos se centran principalmente en elementos genómicos anotados. Por el contrario, la genética directa tiene la ventaja de identificar nuevos elementos genómicos funcionales no anotados. Dada la complejidad del genoma humano y del transcriptoma, así como el gran número de nuevos elementos genómicos, esta capacidad de la genética avanzada es de gran importancia.

Las bibliotecas celulares de genética directa se generan con frecuencia a través de la integración retroviral aleatoria, lo que hace que la detección eficiente de los sitios de integración de todo el genoma sea crucial para un ensayo de genética avanzada. La detección de estos sitios de integración generalmente involucra herramientas de recorrido por el genoma26. Si bien ha habido avances significativos en estas herramientas, pocas están optimizadas para aplicaciones de secuenciación de próxima generación (NGS) y posteriormente se aplican en estudios de mutagénesis insercional. La mutagénesis insercional en líneas celulares a menudo utiliza métodos como la PCR inversa (I-PCR) o la PCR mediada por amplificación lineal (LAM-PCR) para detectar sitios de integración27,28,29. Estos métodos, sin embargo, generalmente requieren digestión enzimática de restricción o pasos de ligadura, lo que puede reducir la eficiencia e introducir sesgos en los resultados.

Para mejorar la detección eficiente de los sitios de integración de todo el genoma en las pantallas de genética directa, se introdujo aquí un método llamado Cribado basado en la inserción para elementos funcionales y transcripciones (InSET). Al integrar el recorrido del genoma con NGS, InSET permite la identificación de alto rendimiento de sitios de integración de lentivirus en bibliotecas de mutagénesis insercional basadas en lentivirus. En comparación con los métodos existentes27,28,29, InSET es relativamente directo y simple, eliminando la digestión de la enzima de restricción o los pasos de ligadura, haciéndolo más conveniente y accesible. Además, aunque el cribado genético avanzado existente en células de mamíferos se limita a muy pocas líneas celulares haploides o casi haploides27,28,29,30,31, se ha demostrado que InSET funciona en líneas celulares aneuploides32.

Este estudio proporciona un protocolo detallado, paso a paso, para implementar el método InSET. Además, demuestra la aplicación de InSET en estudios de mutagénesis insercional. InSET sirve como una poderosa herramienta para identificar nuevos exones dentro de los elementos genómicos, que abarcan tanto los ARN codificantes de proteínas como los no codificantes en líneas celulares humanas.

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Protocolo

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La Figura 1 proporciona una visión general esquemática del método InSET. Para obtener una cobertura óptima, prepare cinco bibliotecas paralelas a partir de 1 μg de ADN genómico y, a continuación, agrupelas para la secuenciación de próxima generación. Este procedimiento se ha completado con éxito de forma continua en pruebas anteriores, aunque los usuarios pueden introducir puntos de pausa según su criterio. La información detallada sobre los reactivos y equipos utilizados en este estudio se puede encontrar en la Tabla de Materiales.

1. Captura de sitios de integración de lentivirus en el genoma

  1. Utilice el ADN genómico aislado de la biblioteca de células de mutagénesis insercional basada en lentivirus (1 μg), como se describe en un estudio anterior32, como plantilla para una PCR lineal en una reacción de 50 μL que contiene 1x tampón Taq, 2,5 U ADN polimerasa Taq, 4 μL de mezcla dNTP (2,5 mM cada uno) y 0,3 μM de cebador biotinilado 3-LTR_prime (Tabla 1) en un tubo de PCR.
    NOTA: El cebador de 3-LTR_prime recocido en la región LTR de la secuencia de lentivirus. Si se recoce hasta el 5' LTR, el fragmento amplificado incluye la secuencia genómica flanqueante. Si se recocen a la LTR 3', el fragmento amplificado contiene una secuencia interna de lentivirus, que no se puede alinear con el genoma del huésped y, por lo tanto, se filtrará durante el análisis de datos de secuenciación posterior. Este cebador también puede modificarse para adaptarse a otros tipos de vectores utilizados para generar una biblioteca de células de mutagénesis insercional.
  2. Realice 50 ciclos de PCR lineal en un termociclador de PCR estándar, agregando 2,5 U de ADN polimerasa Taq al inicio y nuevamente inmediatamente después de 25 ciclos. Las condiciones de PCR son las siguientes: 94 °C durante 5 min; 50 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; 72 °C durante 5 min.
    NOTA: Para mantener la actividad de la ADN polimerasa Taq durante reacciones prolongadas, se recomienda agregar la enzima tanto al principio como al punto medio de la reacción.
  3. Transfiera los productos de PCR a un tubo de centrífuga nuevo y limpio de 1,5 ml.
  4. Mezcle bien los productos de PCR con 10 μL de perlas magnéticas de biotina-estreptavidina.
  5. Incubar la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente, agitando a 400 rpm en un baño de metal.
    NOTA: Saque el tubo para mezclar bien con la pipeta cada 15 min.
  6. Use un soporte magnético para recoger las cuentas, luego retire con cuidado el sobrenadante.
  7. Lave las perlas con 300 μL de tampón de unión/lavado (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 1 M de NaCl, 0,1% Tween-20) 6 veces y deseche el sobrenadante.
  8. Lavar dos veces con 300 μL (65 °C) de agua destilada sin DNasa/RNasa y desechar el sobrenadante.
  9. Para la síntesis de la segunda hebra, vuelva a suspender las perlas en un volumen de reacción de 24 μL que contenga 1x tampón de fragmentos Klenow, 2 μL de mezcla dNTP (2,5 mM cada uno) y 6,25 μM de cebador P5_N6 (Tabla 1) en un tubo de PCR
    NOTA: Prepare una solución madre de 100 μM de imprimación P5_N6. El cebador P5_N6 se compone de una secuencia de adaptador P5 fija en el extremo 5' y una secuencia de hexámero aleatorio en el extremo 3'. El hexámero aleatorio puede unirse a una amplia gama de secuencias objetivo, lo que lo hace adecuado para amplificar varios fragmentos de ADN generados a través de PCR lineal.
  10. Preincubar la mezcla a 15 °C durante 20 min en un termociclador de PCR.
  11. Agregue 2 U de fragmento de Klenow (fragmento grande de ADN polimerasa de E. coli).
  12. Incubar las mezclas en un termociclador de PCR en las siguientes condiciones: rampa lenta a 0,5 °C/min de 15 °C a 25 °C seguida de 30 min de incubación; luego rampa lenta a 0,5 °C/min a 37 °C seguida de 1 h de incubación.
  13. Transfiera los productos de PCR a un tubo de centrífuga nuevo y limpio de 1,5 ml.
  14. Use un soporte magnético para capturar las cuentas, luego deseche el sobrenadante.
  15. Lave las perlas suavemente con 300 μL de agua destilada sin DNasa/RNasa a 4 °C. Recoge las cuentas y desecha el sobrenadante.

2. Construcción de librería NGS con PCR anidada

  1. Vuelva a suspender las perlas del paso 1.15 en un volumen de reacción de PCR de 25 μL que contenga 1x tampón Taq, 1,25 U de ADN polimerasa Taq, 0,5 μM de cebador P5 (Tabla 1), 2 μL de mezcla dNTP (2,5 mM cada uno) y 0,5 μM de cebador 3-LTR_Nest (Tabla 1) en un tubo de PCR.
  2. Realice reacciones de PCR en un termociclador de PCR en las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 min; 20 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; 72 °C durante 7 min.
  3. Utilice 5 μL de los productos de PCR del paso 2.2 como plantilla para la siguiente ronda de PCR en un volumen de 50 μL que contenga 1x tampón Taq, 2,5 U de ADN polimerasa Taq, 4 μL de mezcla dNTP (2,5 mM cada uno), 0,4 μM de Illumina_P5 cebador (Tabla 1) y 0,4 μM de cebador Illumina_P7-3LTR (Tabla 1).
  4. Realice reacciones de PCR en un termociclador de PCR en las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 min; 15 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; 72 °C durante 7 min.
  5. Transfiera los productos de PCR a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL.
    NOTA: El protocolo se puede pausar en este paso y las muestras se pueden almacenar a -20 °C.
  6. Purifique los productos de PCR utilizando volúmenes 1,2x de perlas limpias de ADN, lo que eleva el volumen final a 21 μL.
    NOTA: Tome 10 μL de productos PCR de cada una de las 5 bibliotecas preparadas en paralelo, combínelos y purifique hasta un volumen final de 21 μL. El protocolo de purificación para los productos de PCR está adaptado de las instrucciones del fabricante para las perlas de limpieza de ADN (ver Tabla de Materiales).
    1. Equilibre las cuentas de 2-8 °C a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Mezcle bien las cuentas invirtiendo o en vórtice.
    3. Pipetee volúmenes 1,2 veces mayores de las perlas en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml.
    4. Agregue los productos de PCR a las perlas y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
    5. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que el ADN se una a las perlas.
    6. Coloque las muestras en un soporte magnético y retire el sobrenadante una vez que la solución esté clara (unos 5 minutos).
    7. Añadir 200 μL de etanol al 80% para lavar las perlas, incubar a temperatura ambiente durante 30 s y retirar el sobrenadante.
      NOTA: El etanol al 80% debe prepararse fresco.
    8. Repita el paso 2.6.7 una vez.
    9. Seque las cuentas al aire libre a temperatura ambiente con la tapa abierta durante unos 5 minutos.
    10. Retire el tubo del soporte magnético, agregue 22 μL de agua destilada sin DNasa/RNasa, mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
    11. Coloque el tubo en el soporte magnético hasta que la solución esté clara (aproximadamente 2 minutos), luego transfiera 21 μL de sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este paso y las muestras se pueden almacenar a -20 °C.
  7. Utilice 1 μL de productos de PCR purificados para medir la concentración utilizando el fluorómetro con el kit de detección de fluorescencia dsDNA disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales).
    NOTA: El protocolo de medición de concentración sigue las instrucciones del fabricante para el kit de detección de dsDNA.
    1. Prepare la preparación de la solución de trabajo mezclando el reactivo y el tampón (incluidos en el kit) en una proporción de 1:200.
    2. Prepare los patrones de ensayo mezclando 10 μL de la norma #1 y 10 μL de la norma #2 (incluida en el kit), cada una con 190 μL de solución de trabajo. Agite suavemente la mezcla durante 2-3 s.
    3. Prepare la muestra de ensayo mezclando 1 μL de los productos de PCR purificados con 190 μL de solución de trabajo. Agite suavemente la mezcla durante 2-3 s.
    4. Incube los patrones de ensayo y las muestras de ensayo durante 2 minutos a temperatura ambiente, manteniéndolos protegidos de la luz.
    5. Encienda el fluorímetro.
    6. Seleccione el programa dsDNA High Sensitivity en el menú principal.
    7. Para la calibración, inserte el estándar # 1 en la máquina, presione el botón Leer estándar para medir el primer estándar, luego inserte el estándar # 2 y presione el botón Leer estándar para medir el segundo estándar.
    8. Para la medición de muestras, presione el botón Ejecutar muestras para ir a la página de medición de muestras. Inserte cada tubo que contenga la muestra de ensayo y presione el botón Leer tubo para obtener la concentración.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este paso y las muestras se pueden almacenar a -20 °C.
  8. Realice NGS en plataformas Illumina utilizando una estrategia de 150 bp (PE150) de extremo emparejado en una escala de base de 30 gigas (GB).
    NOTA: Este paso generalmente se subcontrata a las empresas de secuenciación.

3. Análisis de datos

NOTA: El análisis en líneas celulares humanas se utilizó como ejemplo en esta sección.

  1. Mapeo de sitios de integración de lentivirus
    1. Filtre las lecturas de secuenciación con más del 50% de bases de baja calidad (puntuación Phred <20), más de 15 bases 'N' o menos de 150 bases utilizando fastp tool33 (consulte la Tabla de materiales).
    2. Seleccione solo las lecturas de extremo emparejado con la lectura 2 que comience con la etiqueta LTR "GCCTTGTGTGTGTTAGTAGATCCACAG
      ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      NOTA: Esta secuencia depende de la secuencia del vector utilizada para generar la biblioteca de células de mutagénesis insercional.
    3. Recorte la secuencia de etiquetas LTR de las lecturas seleccionadas en el paso 3.1.2.
    4. Alinee las lecturas recortadas con el GRCh37/hg19 usando BWA-MEM 34 (ver Tabla de Materiales) con la configuración predeterminada.
    5. Conserve solo los pares de lectura en los que tanto la lectura 1 como la lectura 2 se asignen de forma única al genoma con la configuración y el espaciado correctos, indicados por FLAG 147 y FLAG 163.
    6. Defina la posición de inserción como la primera base alineada de la lectura recortada 2.
    7. Normalice los recuentos de lecturas en cada sitio de inserción único al número total de lecturas alineadas de forma única en cada muestra.
  2. Identificación de inserciones que afectan la aptitud celular (IACFs)
    NOTA: En el análisis estadístico, es aconsejable realizar comparaciones por pares entre las tres réplicas biológicas de las muestras de control y tratadas para identificar posiciones significativamente enriquecidas o agotadas. El número de réplicas mencionado anteriormente es mínimo. Se recomienda utilizar tantas réplicas como sea posible en la práctica para garantizar la fiabilidad y precisión de los resultados.
    1. Convierta los recuentos de lectura normalizados de cada posición en valores de registro de10
      2. .
    2. Establezca los valores de registro10 de las posiciones con lecturas de cero como −5.
    3. Realice la prueba t de Student emparejada a dos caras en los valores del registro10.
    4. Ajuste los valores p para comparaciones múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg dentro del entorno R.
    5. Seleccione posiciones con un umbral de tasa de falsos descubrimientos (FDR) del 25% como IACF.
  3. Identificación de conglomerados que afectan la aptitud celular (CACFs)
    NOTA: Se recomendaron tres réplicas biológicas de las muestras de control y tratadas para este análisis.
    1. Identifique los grupos de inserción significativamente enriquecidos o agotados entre las muestras de control y tratadas utilizando SICER35 (ver Tabla de Materiales) con un umbral FDR del 1%. El comando para el análisis SICER es "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      NOTA: Los significados de los parámetros en el comando anterior son los siguientes: ["InputDir"] ["archivo de cama de sitios de inserción de muestras tratadas"] ["archivo de cama de sitios de inserción de muestras de control"] ["OutputDir"] ["especies"] ["umbral de redundancia"] ["tamaño de ventana (bp)"] ["tamaño del fragmento"] ["fracción del genoma efectivo"] ["tamaño de la brecha (bp)"] ["valor E"].
    2. Obtenga regiones de clúster compartidas por al menos dos réplicas biológicas con la función "intersect" de la suite BEDTools36 (consulte la Tabla de Materiales) y denote estas regiones de clúster como CACF.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La evaluación del control de calidad de una biblioteca NGS, normalmente realizada por el proveedor de secuenciación, sirve como el control de calidad estándar antes de la secuenciación. Para demostrar el impacto de la calidad de la biblioteca, se compararon dos muestras. La biblioteca de alta calidad, etiquetada como s2-20-15, se preparó utilizando el protocolo estándar de PCR anidado, que consta de dos pasos de amplificación secuenciales: el primero con 20 ciclos, seguido del segundo con 15 ciclos. Por el contrario, la ...

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Discusión

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En el análisis genético directo, la caminata del genoma es esencial para perfilar los sitios de integración en las bibliotecas celulares de mutagénesis de inserción. Los métodos clásicos de caminata del genoma como I-PCR y LAM-PCR a menudo requieren digestión y ligadura de enzimas de restricción, lo que puede reducir la complejidad de la biblioteca e introducir sesgos debido a la dependencia del sitio enzimático 27,28,29. El mét...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen divulgaciones.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32000441), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian, China (2023J01130), los Fondos de Investigación Fundamental de las Universidades Centrales de la Universidad de Huaqiao (ZQN-924) y los Fondos de Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao (18BS205). P.K. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32170619), el Fondo de Investigación para Científicos Internacionales de Alto Nivel de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales Fundación de Ciencias de China (32150710525), y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Fujian, China (2020J02006).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.5 M EDTAInvitrogenAM9260GPara hacer tampón de unión/lavado
1 M Tris-HCl (Ph 8.0)Invitrogen15568025Para hacer tampón de unión/lavado
10 veces; Búfer de fragmentos de Klenow Takara2140A
10 veces; Tampón TaqTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659Para hacer tampón de unión/lavado
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 μ m
BEDToolsSoftware, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMSoftware, v0.7.12
dNTP MezclaTakara40302,5 mM cada uno
Equalbit dsDNA HS Kit de ensayoVazymeEQ111-02
fastpSoftware
HiSeq X TenIlluminaSY-412-1001Plataforma Illumina, subcontratada a Novogene Corporation (Pekín)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850Plataforma Illumina, subcontratada a Novogene Corporation (Pekín)
Fluorímetro Qubit 3.0ThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq ADN PolimerasaTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328Para hacer tampón de unión / lavado
Agua destilada ultrapuraInvitrogen10977015
VAHTS ADN Cuentas limpiasVazymeN411-01

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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