Extracción e identificación de micronúcleos de linfocitos de sangre periférica humana

Resumen

Este protocolo describe un método para extraer y purificar micronúcleos de linfocitos humanos mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Proporciona una base experimental para investigar la composición y función de los micronúcleos.

Resumen

Un micronúcleo (MN) es una estructura nuclear anormal que se forma en las células, particularmente en la médula ósea o las células sanguíneas, cuando se expone a daños externos, como la radiación, debido a daños no resueltos en el ADN o errores mitóticos. Una vez formadas, las MN pueden contribuir activamente a varios procesos cancerígenos, incluida la señalización inflamatoria y los reordenamientos genéticos cromosómicos. Las MN contienen ADN nuclear, histonas, fragmentos de nucleoproteínas y otras proteínas activas, que están estrechamente asociadas con sus funciones. El estudio de la formación y los componentes de las MN es crucial para comprender su papel en la conducción de procesos cancerígenos. La extracción y purificación de MNs son esenciales para lograr estos objetivos de investigación. Sin embargo, la inestabilidad de la membrana nuclear MN y su susceptibilidad a la ruptura hacen que estos procesos sean técnicamente desafiantes. Actualmente, solo unos pocos estudios han informado sobre el uso de la centrifugación en gradiente de densidad para la separación de MN. Este estudio resume y simplifica los procesos de separación y purificación de MN. Se aislaron los linfocitos de sangre periférica humana expuestos a la radiación, y los MN se separaron y purificaron utilizando tampones de sacarosa de diferentes concentraciones en un proceso de dos etapas. Se verificó la integridad y pureza de las MN, proporcionando una demostración clara y práctica del procedimiento experimental para los investigadores que investigan las causas y funciones de las MN.

Introducción

El micronúcleo (MN) es una estructura subcelular en el citoplasma que contiene ADN nuclear, histonas y fragmentos de nucleoproteínas, rodeada de estructuras de membrana ^1,2. El MN está completamente separado del núcleo principal y generalmente aparece cerca de él en forma ovalada o circular, con un tamaño que varía de 1/16 a 1/3 del diámetro del núcleo principal. La formación de MNs se asocia principalmente con fragmentos cromosómicos acéntricos, segregación cromosómica errónea, rotura cromosómica discéntrica, inestabilidad cromosómica y la agregación de minutos dobles (DBs)

Protocolo

Todos los experimentos con muestras de sangre periférica humana se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital 416 de la Industria Nuclear, China (Revisión de 2020 [n.º 48]), y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. Los criterios de exclusión incluyeron individuos con enfermedades crónicas importantes, como tumores, gota o trastornos sanguíneos, así como aquellos expuestos a sustancias radiactivas o genotóxicas en su ocupación. Para este estudio, se recolectaron 10 mL de sangre periférica de un hombre sano de 28 años ....

Resultados

Después de la exposición a la radiación, se incubó sangre periférica humana con RPMI-1640 durante 60 h, y luego se agregó citocalasina B para la preparación de micronúcleos (MN). Los linfocitos se aislaron utilizando una solución de separación de linfocitos, seguida de lisis con un lisado celular especialmente configurado y homogeneización suave en un homogeneizador de vidrio. El homogeneizado se mezcló 1:1 con tampón sacarosa 1.8 M. Los micronúcleos no purificados se obtuvieron después de la primera centrifugación en gr.......

Discusión

En este método, se utilizaron linfocitos de sangre periférica humana irradiados para el aislamiento y purificación de micronúcleos (MN). Muchos estudios previos han reportado los pasos detallados para la lisis celular y la separación primaria de MNs 4,32,33,34. La solución de lisis celular generalmente incluye 0.1% de NP-40 para alterar la membrana celular mie.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
15  mL tubo cónico	Thermo	339650
4% solución de paraformaldehído	Beyotime	P0099
50  mL tubo cónico	Thermo	339652
Anticuerpo anti-γ-H2AX	Bioss	bsm-52163R
Albúmina sérica bovina	Beyotime	ST023
Cloruro de calcio	Biosharp	BS249
Citocalasina B	Macklin	14930-96-2
Solución de teñido DAPI	Bioss	S0001
Dithiothreitol ( TDT)	Coolaber	CD4941
EDTA	Biosharp	BS107	Etileno Diamino Ácido tetraacético
Microscopio de fluorescencia	Nikon	Ti2-U
Homogeneizador	Ybscience	YB101103-1 (20 mL)
Centrífuga de temperatura controlada horizontal	Thermo	Sorvall ST1R plus	La velocidad de frenado está configurada en "5"
Solución de separación de linfocitos humanos	Beyotime	C0025
Acetato de magnesio	Macklin	M833330
NP-40	Coolaber	SL9320	solución al 10%
Solución tampón de fosfato (PBS)	HyClone	SH30256.01B
Inhibidores de la proteasa	Coolaber	SL1086	Cocktail (100×)
Anticuerpo secundario	Bioss	Bs-0295G	Cabra Anti-Conejo IgG H& L/FITC
Espermidina	Coolaber	CS10431
Espermina	Coolaber	CS10441
Sacarosa	Coolaber	CS10581
Tris-HCl	Biosharp	BS157
Triton X-100	Beyotime	P0096