Detección de autoanticuerpos anti-MDA5 mediante células HeLa e inmunocitoquímica con microscopía óptica

Las miopatías inflamatorias idiopáticas (MII), comúnmente conocidas como miositis, son un grupo heterogéneo de trastornos autoinmunes caracterizados por inflamación muscular crónica, manifestaciones clínicas variables y diversos resultados terapéuticos. Los síntomas comunes incluyen debilidad muscular, resistencia reducida y mialgia¹. Los subtipos primarios de IIM incluyen polimiositis (PM) y dermatomiositis (DM), mientras que clínicamente la dermatomiositis amiopática (CADM) se distingue por erupciones cutáneas características similares a las observadas en la DM pero con una afectación muscular mínima o nula. Una complicación importante en PM, DM y CADM es la enfermedad pulmonar intersticial (EPI), que afecta aproximadamente al 40% de los pacientes y se asocia con una mayor mortalidad².

El curso clínico y el pronóstico de la EPI en la MII varían ampliamente. La EPI asociada con DM y CADM (DM-/CADM-ILD) tiende a ser más resistente al tratamiento y conlleva un peor pronóstico en comparación con la EPI asociada a PM. Entre estos, la EPI aguda o subaguda, que progresa rápidamente en tres meses³, es particularmente grave, con una tasa de supervivencia a cinco años de solo el 52%, en comparación con el 87% de la EPI crónica, que progresa lentamente o permanece estable. La EPI rápidamente progresiva (RP-EPI), un subtipo de EPI aguda/subaguda, se caracteriza por una aparición rápida de disnea y un daño alveolar extenso visible en las imágenes de tórax. La EP-RP es una afección potencialmente mortal con un mal pronóstico, lo que subraya la necesidad urgente de un diagnóstico temprano y una intervención rápida para mejorar los resultados de los pacientes ^4,5,6.

Los autoanticuerpos específicos de miositis (MSA) se han convertido en biomarcadores críticos en la EPI asociada a la miositis, y los autoanticuerpos anti-MDA5 desempeñan un papel particularmente importante. Estos autoanticuerpos se detectan con frecuencia en pacientes con PM-/DM-/CADM-ILD y sirven como indicadores pronósticos importantes para la EP-RP ^7,8,9. MDA5 (melanoma differentiation-associated gene 5) es un receptor de reconocimiento de patrones citosólicos codificado por un gen inducible por interferón que detecta ARN bicatenario viral y mitocondrial, iniciando respuestas inmunes mediadas por interferón¹⁰. Aunque los mecanismos patogénicos precisos siguen sin estar claros, se cree que los autoanticuerpos anti-MDA5 interrumpen la función de MDA5, contribuyendo así a la patogénesis autoinmune.

La detección oportuna de los autoanticuerpos anti-MDA5 es esencial para la identificación temprana y el tratamiento de la EPI-RP. Tradicionalmente, la inmunoprecipitación (IP) radiomarcada con ³⁵extractos celulares K562 marcados con S-metionina se ha considerado el estándar de oro para detectar autoanticuerpos anti-MDA5¹¹. Sin embargo, este método no es práctico para el uso clínico rutinario debido a su alto costo, dependencia de equipos especializados y personal capacitado, estrictas regulaciones de eliminación de desechos radiactivos y la vida útil limitada de los reactivos radiomarcados. En la práctica clínica, los ensayos de transferencia se emplean comúnmente como alternativas; sin embargo, se asocian con una alta tasa de falsos positivos para los autoanticuerpos anti-MDA5 ^12,13, lo que genera preocupaciones sobre la precisión del diagnóstico. En consecuencia, existe una necesidad urgente de un ensayo confirmatorio confiable y no radiactivo para validar los resultados positivos y mejorar la confianza en el diagnóstico.

Para abordar esta brecha, proponemos el uso de inmunocitoquímica (ICC) como prueba confirmatoria complementaria para los autoanticuerpos anti-MDA5. Este enfoque implica la transfección de células HeLa con una construcción MDA5, la incubación de las células con plasma del paciente y la detección de autoanticuerpos anti-MDA5 unidos utilizando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante) combinados con un sustrato cromogénico para su visualización bajo microscopía óptica. ICC proporciona una plataforma no radiactiva, altamente sensible y estandarizada para visualizar autoanticuerpos anti-MDA5 dentro de los compartimentos celulares. Al integrar ICC con el ensayo de transferencia, este método tiene como objetivo reducir las tasas de falsos positivos, mejorar la precisión del diagnóstico y, en última instancia, mejorar el manejo clínico y los resultados para los pacientes.

El objetivo de este estudio es establecer un protocolo robusto y no radiactivo para la detección de autoanticuerpos anti-MDA5, abordando las limitaciones de los métodos de detección actuales y ofreciendo a los médicos una herramienta práctica y fiable para el diagnóstico precoz de la EP-RP en pacientes con PM, DM y CADM. En la narración del video que lo acompaña, este curso potencialmente mortal se describe coloquialmente como "muerte rápida"; científicamente, corresponde a una EPI RÁPIDAMENTE PROGRESIVA (RP-ILD). Este trabajo se basa en la evidencia existente y tiene el potencial de mejorar significativamente la evaluación pronóstica y la toma de decisiones terapéuticas en la práctica clínica.

1. Cultivo celular y transfección

1. Mantenga las células HeLa con el medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de antibiótico-antimicótico a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO₂ .
2. Pasar las células cada 2-3 días o cuando las células alcancen una confluencia del 90% al 100%.
3. Siembre 7 × 10⁴ células HeLa en cada pocillo de una placa de 24 pocillos (1,9 cm²/pocillo) 24 h antes de la transfección para permitir que las células alcancen aproximadamente el 90% de confluencia.
4. Diluir 500 ng de plásmido (pENTER-MDA5) y 1,5 μL de reactivo de transfección cada uno en 25 μL de medio sérico reducido.
5. Agregue ADN diluido al reactivo de transfección diluido (proporción 1:1). Mezclar bien e incubar durante 5 min.
6. Agregue la mezcla a las células sembradas un día antes y agite para mezclar el complejo ADN-lípido inmediatamente. Confirme que las células son 80%-90% confluentes.
7. Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO₂ durante 24 h y proceder a realizar ICC.
   NOTA: Utilizamos un vector disponible comercialmente (pEnter-MDA5); se puede encontrar más información en la Tabla de materiales. La eficacia de la transfección es de ~50%.
   El éxito de la transfección y la expresión de la proteína diana se puede determinar transfectando las células con un plásmido fluorescente que expresa proteínas y realizando un Western blot para visualizar la expresión de la proteína diana.

2. Fijación celular

1. Después de la incubación, lave las células 2 veces con PBS para eliminar cualquier medio restante.
   NOTA: El lavado se puede realizar agitando la placa en un agitador orbital.
2. Fije las células en paraformaldehído al 4% en PBS. Deje las celdas durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico. Utilice pautas de manejo adecuadas.
3. Aspire el reactivo fijador y use PBS para lavar las células 2 veces.

3. Permeabilización celular

1. Agregue el reactivo Triton X-100 (0,3% en PBS) y deje reposar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2. Después de 10 minutos, deseche el detergente.
3. Agregue PBS para lavar las células una vez.

4. Bloqueo de celdas

1. Realizar el bloqueo con suero bovino fetal al 10% en PBS (1x) e incubar las células durante 1 h a temperatura ambiente.
2. Retire el reactivo de bloqueo, luego agregue PBS para lavar las células una vez.

5. Hibridación del anticuerpo del paciente

1. Agregue el plasma diluido del paciente a las células. Asegúrese de diluir la muestra del paciente (dilución 1:5,000 en PBS) en PBS antes de usarla.
   NOTA: Ajuste la dilución para mejorar la señal o reducir el fondo según sea necesario. Para garantizar resultados imparciales, el personal que realizaba las pruebas no tenía conocimiento de qué muestras pertenecían a los pacientes y cuáles eran de individuos sanos.
2. Incubar la muestra a 4 °C durante 12-16 h (durante la noche).
3. Después del período de incubación, retire la muestra del paciente y lave las células 3 veces con PBS.

6. Hibridación de anticuerpos secundarios

1. Trate las células con IgG antihumana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante diluida (dilución 1:250 en PBS) y deje las células durante 1 h a temperatura ambiente.
2. Una hora más tarde, deseche los anticuerpos secundarios.
3. Enjuague con PBS 3x.

7. Tinción celular

1. Después de lavar las células, tiña las células con 300 μL de solución de trabajo DAB/pocillo.
   NOTA: Esta solución se preparó mezclando concentrado de cromógeno DAB y diluyente DAB de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Después de teñir las células durante 5 min, retire el tinte, enjuague con agua destilada desionizada y agite durante 5 min.

8. Contratinción celular

1. Contratiña el núcleo celular con hematoxilina diluida.
   NOTA: Usamos Hematoxylin Gill II en una dilución de 10 veces y esperamos 5 min para el proceso de tinción.
2. Después de 5 min, deseche la hematoxilina, luego lave con agua destilada desionizada durante 2 x 5 min.

9. Observación

1. Observe los resultados de la tinción con un microscopio óptico.
   NOTA: Un verdadero positivo muestra una fuerte tinción marrón dentro de las células HeLa que expresan MDA5; esto confirma los autoanticuerpos anti-MDA5 en la muestra del paciente. Un resultado negativo muestra células HeLa sin tinción marrón, lo que indica que no hay autoanticuerpos anti-MDA5. Un resultado falso positivo muestra una extensa tinción marrón en todas las células, independientemente de la expresión de MDA5. Esta tinción inespecífica, observada en otras afecciones autoinmunes, debe distinguirse de un verdadero positivo para evitar un diagnóstico erróneo.

El personal que realizó las pruebas no tuvo en cuenta las identidades de las muestras, incluidos los pacientes específicos de los que se obtuvieron, para minimizar el posible sesgo en el proceso de evaluación. Sin embargo, aunque las muestras de control sanas no se sometieron a cegamiento, produjeron resultados claros e inequívocos de manera consistente.

La Figura 1A demuestra la expresión exitosa de MDA5 en células HeLa transfectadas con la construcción pENTER-MDA5. Para validar la eficiencia de la transfección, se realizó ICC utilizando un anticuerpo comercial anti-MDA5. Se observó una fuerte tinción citoplasmática marrón en aproximadamente el 50% de las células transfectadas, lo que indica una expresión robusta de la proteína MDA5. Por el contrario, las células no transfectadas procesadas en condiciones idénticas no mostraron tinción citoplasmática, lo que confirma la especificidad del anticuerpo y la ausencia de expresión endógena de MDA5.

Siguiendo el protocolo ICC, muestras representativas de pacientes anti-MDA5 positivos, confirmadas por inmunoprecipitación radiomarcada, demostraron una tinción citoplasmática marrón clara en células HeLa que expresan MDA5, mientras que las células no transfectadas permanecieron sin teñir (Figura 1B). Este patrón de tinción indica la presencia de autoanticuerpos anti-MDA5 en el plasma del paciente y se alinea con la detección estándar de oro establecida utilizando 35extractos de células K562 marcados con S-metionina.

Las características de los pacientes se resumen en la Tabla complementariaS1, que describe los diagnósticos clínicos, el estado de los anticuerpos anti-MDA5 y la clasificación en tres grupos: anti-MDA5 positivo, falso positivo y control sano. Además del estado de los anticuerpos, la Tabla complementaria S1 ahora también resume los datos demográficos de los pacientes, incluida la edad, el sexo y el diagnóstico subyacente para cada cohorte. La reactividad de los anticuerpos se calificó semicuantitativamente como débil (1+), moderada (2+) o fuerte (3+) según la intensidad de la banda, lo que refleja el aumento de los niveles de anticuerpos. Esto proporciona un contexto clínico para interpretar los resultados de la CCI, manteniendo el enfoque metodológico principal del presente estudio. La cohorte del estudio incluyó 10 pacientes con autoanticuerpos anti-MDA5 confirmados (grupo positivo), cinco pacientes con enfermedades autoinmunes que arrojaron resultados falsos positivos mediante pruebas de transferencia comerciales (grupo de transferencia falsa) y 10 individuos sanos (grupo de control sano). Cada muestra se analizó junto con controles positivos y negativos y se verificó de forma independiente mediante inmunoprecipitación radiomarcada. Para muestras con resultados de tinción claros y concluyentes, se consideró suficiente una sola ejecución de ICC. En los casos en que la tinción era ambigua o límite, se realizaron pruebas adicionales, incluidas diluciones en serie y ensayos ICC replicados, para garantizar una interpretación precisa. Este enfoque garantizó tanto el rigor metodológico como la eficiencia de los recursos en la validación del rendimiento del método de detección basado en ICC.

Los resultados falsos positivos se ilustran en la Figura 2. En estas muestras se utilizó plasma de pacientes con enfermedades autoinmunes distintas de las miopatías inflamatorias idiopáticas (MII). A diferencia de la Figura 1, la tinción citoplasmática marrón se observó ampliamente en todas las células, independientemente del estado de expresión de MDA5. Este patrón de tinción indica una unión no específica y destaca el potencial de falsos positivos en muestras de pacientes con otras afecciones autoinmunes. Los resultados negativos se presentan en la Figura 3, donde se analizó el plasma de individuos sanos. Prácticamente no se observó tinción citoplasmática marrón en células HeLa transfectadas o no transfectadas, lo que indica la ausencia de autoanticuerpos anti-MDA5 en estas muestras.

Figura 1: Validación de la expresión de MDA5 y detección de autoanticuerpos anti-MDA5 mediante ICC. (A) Las células HeLa transfectadas con un plásmido que expresa MDA5 se tiñeron con un anticuerpo comercial anti-MDA5. Se observó una fuerte tinción citoplasmática marrón, lo que indica una fuerte expresión de la proteína MDA5. Por el contrario, las células no transfectadas procesadas en condiciones idénticas no mostraron tinción, lo que confirma tanto la especificidad de anticuerpos como la ausencia de expresión endógena de MDA5. (B) Las células HeLa transfectadas con MDA5 se incubaron con plasma de pacientes confirmados como anti-MDA5 positivos mediante inmunoprecipitación radiomarcada. Se observó una clara tinción marrón citoplasmática, lo que demuestra la presencia de autoanticuerpos anti-MDA5 en la muestra del paciente. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: ICC = inmunocitoquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Detección de señales falsas positivas utilizando plasma de pacientes con enfermedades autoinmunes distintas de IIM. Se observó una tinción citoplasmática marrón generalizada tanto en células transfectadas como no transfectadas, lo que sugiere una unión de anticuerpos no específica. Estos resultados ilustran el potencial de detección de falsos positivos en ensayos de transferencia lineal cuando se usa plasma de pacientes con enfermedades autoinmunes no relacionadas con pacientes IIM positivos para anti-MDA5. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: IIM = miopatías inflamatorias idiopáticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados negativos de tinción con plasma de individuos de control sanos. Las células HeLa transfectadas con MDA5 e incubadas con plasma de individuos sanos mostraron poca o ninguna tinción citoplasmática marrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria S1: Características de los pacientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Partes de este manuscrito se generaron con la ayuda de GPT-4 de OpenAI. Los autores revisaron y editaron el contenido para garantizar la precisión y la originalidad.