Artículo de método

Detección de autoanticuerpos anti-MDA5 mediante células HeLa e inmunocitoquímica con microscopía óptica

DOI:

10.3791/67575

⸱

31 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proporcionamos una metodología de inmunocitoquímica (ICC) paso a paso para detectar anti-MDA5. Este enfoque implica la fijación celular, la permeabilización, la incubación de anticuerpos y las técnicas de imagen, que permiten la detección precisa de autoanticuerpos anti-MDA5, lo que ayuda en el diagnóstico de la enfermedad pulmonar intersticial que progresa rápidamente en pacientes con miositis.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autoanticuerpos anti-MDA5 son biomarcadores críticos para la dermatomiositis (DM), la dermatomiositis amiopática (CADM) y la polimiositis (PM), particularmente en la identificación de pacientes con riesgo de enfermedad pulmonar intersticial rápidamente progresiva (RP-ILD). La detección temprana de estos autoanticuerpos es esencial para mejorar los resultados de los pacientes, ya que el diagnóstico tardío a menudo conduce a un mal pronóstico. Actualmente, el radioinmunoensayo es el estándar de oro para detectar anti-MDA5, pero su uso está limitado por los altos costos, los procedimientos prolongados y la necesidad de experiencia especializada. Además, la prueba de transferencia, una herramienta clínica ampliamente utilizada, exhibe una alta tasa de falsos positivos para los autoanticuerpos MDA5, lo que puede comprometer la precisión del diagnóstico. Para abordar estas limitaciones, proponemos un método de prueba confirmatorio no radiactivo, altamente sensible y estandarizado que utiliza inmunocitoquímica (ICC). Este protocolo implica el tratamiento de las células HeLa con una construcción MDA5, la permeabilización de las células con Triton X-100 para facilitar la unión de los autoanticuerpos primarios anti-MDA5 y la detección de anticuerpos unidos utilizando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante) con el cromógeno DAB para imágenes de microscopía. ICC ofrece un enfoque práctico, rentable y de alta sensibilidad para visualizar autoanticuerpos anti-MDA5 dentro de las estructuras celulares. Al integrar ICC como un procedimiento confirmatorio complementario, este estudio tiene como objetivo mejorar la confiabilidad de la detección anti-MDA5, mejorando así las estrategias diagnósticas y pronósticas para la EP-RP en pacientes con DM, CADM y PM.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las miopatías inflamatorias idiopáticas (MII), comúnmente conocidas como miositis, son un grupo heterogéneo de trastornos autoinmunes caracterizados por inflamación muscular crónica, manifestaciones clínicas variables y diversos resultados terapéuticos. Los síntomas comunes incluyen debilidad muscular, resistencia reducida y mialgia1. Los subtipos primarios de IIM incluyen polimiositis (PM) y dermatomiositis (DM), mientras que clínicamente la dermatomiositis amiopática (CADM) se distingue por erupciones cutáneas características similares a las observadas en la DM pero con una afectación muscular mínima o nula. Una complicación importante en PM, DM y CADM es la enfermedad pulmonar intersticial (EPI), que afecta aproximadamente al 40% de los pacientes y se asocia con una mayor mortalidad2.

El curso clínico y el pronóstico de la EPI en la MII varían ampliamente. La EPI asociada con DM y CADM (DM-/CADM-ILD) tiende a ser más resistente al tratamiento y conlleva un peor pronóstico en comparación con la EPI asociada a PM. Entre estos, la EPI aguda o subaguda, que progresa rápidamente en tres meses3, es particularmente grave, con una tasa de supervivencia a cinco años de solo el 52%, en comparación con el 87% de la EPI crónica, que progresa lentamente o permanece estable. La EPI rápidamente progresiva (RP-EPI), un subtipo de EPI aguda/subaguda, se caracteriza por una aparición rápida de disnea y un daño alveolar extenso visible en las imágenes de tórax. La EP-RP es una afección potencialmente mortal con un mal pronóstico, lo que subraya la necesidad urgente de un diagnóstico temprano y una intervención rápida para mejorar los resultados de los pacientes 4,5,6.

Los autoanticuerpos específicos de miositis (MSA) se han convertido en biomarcadores críticos en la EPI asociada a la miositis, y los autoanticuerpos anti-MDA5 desempeñan un papel particularmente importante. Estos autoanticuerpos se detectan con frecuencia en pacientes con PM-/DM-/CADM-ILD y sirven como indicadores pronósticos importantes para la EP-RP 7,8,9. MDA5 (melanoma differentiation-associated gene 5) es un receptor de reconocimiento de patrones citosólicos codificado por un gen inducible por interferón que detecta ARN bicatenario viral y mitocondrial, iniciando respuestas inmunes mediadas por interferón10. Aunque los mecanismos patogénicos precisos siguen sin estar claros, se cree que los autoanticuerpos anti-MDA5 interrumpen la función de MDA5, contribuyendo así a la patogénesis autoinmune.

La detección oportuna de los autoanticuerpos anti-MDA5 es esencial para la identificación temprana y el tratamiento de la EPI-RP. Tradicionalmente, la inmunoprecipitación (IP) radiomarcada con 35extractos celulares K562 marcados con S-metionina se ha considerado el estándar de oro para detectar autoanticuerpos anti-MDA511. Sin embargo, este método no es práctico para el uso clínico rutinario debido a su alto costo, dependencia de equipos especializados y personal capacitado, estrictas regulaciones de eliminación de desechos radiactivos y la vida útil limitada de los reactivos radiomarcados. En la práctica clínica, los ensayos de transferencia se emplean comúnmente como alternativas; sin embargo, se asocian con una alta tasa de falsos positivos para los autoanticuerpos anti-MDA5 12,13, lo que genera preocupaciones sobre la precisión del diagnóstico. En consecuencia, existe una necesidad urgente de un ensayo confirmatorio confiable y no radiactivo para validar los resultados positivos y mejorar la confianza en el diagnóstico.

Para abordar esta brecha, proponemos el uso de inmunocitoquímica (ICC) como prueba confirmatoria complementaria para los autoanticuerpos anti-MDA5. Este enfoque implica la transfección de células HeLa con una construcción MDA5, la incubación de las células con plasma del paciente y la detección de autoanticuerpos anti-MDA5 unidos utilizando anticuerpos secundarios conjugados con enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante) combinados con un sustrato cromogénico para su visualización bajo microscopía óptica. ICC proporciona una plataforma no radiactiva, altamente sensible y estandarizada para visualizar autoanticuerpos anti-MDA5 dentro de los compartimentos celulares. Al integrar ICC con el ensayo de transferencia, este método tiene como objetivo reducir las tasas de falsos positivos, mejorar la precisión del diagnóstico y, en última instancia, mejorar el manejo clínico y los resultados para los pacientes.

El objetivo de este estudio es establecer un protocolo robusto y no radiactivo para la detección de autoanticuerpos anti-MDA5, abordando las limitaciones de los métodos de detección actuales y ofreciendo a los médicos una herramienta práctica y fiable para el diagnóstico precoz de la EP-RP en pacientes con PM, DM y CADM. En la narración del video que lo acompaña, este curso potencialmente mortal se describe coloquialmente como "muerte rápida"; científicamente, corresponde a una EPI RÁPIDAMENTE PROGRESIVA (RP-ILD). Este trabajo se basa en la evidencia existente y tiene el potencial de mejorar significativamente la evaluación pronóstica y la toma de decisiones terapéuticas en la práctica clínica.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultivo celular y transfección

  1. Mantenga las células HeLa con el medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de antibiótico-antimicótico a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 .
  2. Pasar las células cada 2-3 días o cuando las células alcancen una confluencia del 90% al 100%.
  3. Siembre 7 × 104 células HeLa en cada pocillo de una placa de 24 pocillos (1,9 cm2/pocillo) 24 h antes de la transfección para permitir que las células alcancen aproximadamente el 90% de confluencia.
  4. Diluir 500 ng de plásmido (pENTER-MDA5) y 1,5 μL de reactivo de transfección cada uno en 25 μL de medio sérico reducido.
  5. Agregue ADN diluido al reactivo de transfección diluido (proporción 1:1). Mezclar bien e incubar durante 5 min.
  6. Agregue la mezcla a las células sembradas un día antes y agite para mezclar el complejo ADN-lípido inmediatamente. Confirme que las células son 80%-90% confluentes.
  7. Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 durante 24 h y proceder a realizar ICC.
    NOTA: Utilizamos un vector disponible comercialmente (pEnter-MDA5); se puede encontrar más información en la Tabla de materiales. La eficacia de la transfección es de ~50%.
    El éxito de la transfección y la expresión de la proteína diana se puede determinar transfectando las células con un plásmido fluorescente que expresa proteínas y realizando un Western blot para visualizar la expresión de la proteína diana.

2. Fijación celular

  1. Después de la incubación, lave las células 2 veces con PBS para eliminar cualquier medio restante.
    NOTA: El lavado se puede realizar agitando la placa en un agitador orbital.
  2. Fije las células en paraformaldehído al 4% en PBS. Deje las celdas durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico. Utilice pautas de manejo adecuadas.
  3. Aspire el reactivo fijador y use PBS para lavar las células 2 veces.

3. Permeabilización celular

  1. Agregue el reactivo Triton X-100 (0,3% en PBS) y deje reposar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  2. Después de 10 minutos, deseche el detergente.
  3. Agregue PBS para lavar las células una vez.

4. Bloqueo de celdas

  1. Realizar el bloqueo con suero bovino fetal al 10% en PBS (1x) e incubar las células durante 1 h a temperatura ambiente.
  2. Retire el reactivo de bloqueo, luego agregue PBS para lavar las células una vez.

5. Hibridación del anticuerpo del paciente

  1. Agregue el plasma diluido del paciente a las células. Asegúrese de diluir la muestra del paciente (dilución 1:5,000 en PBS) en PBS antes de usarla.
    NOTA: Ajuste la dilución para mejorar la señal o reducir el fondo según sea necesario. Para garantizar resultados imparciales, el personal que realizaba las pruebas no tenía conocimiento de qué muestras pertenecían a los pacientes y cuáles eran de individuos sanos.
  2. Incubar la muestra a 4 °C durante 12-16 h (durante la noche).
  3. Después del período de incubación, retire la muestra del paciente y lave las células 3 veces con PBS.

6. Hibridación de anticuerpos secundarios

  1. Trate las células con IgG antihumana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante diluida (dilución 1:250 en PBS) y deje las células durante 1 h a temperatura ambiente.
  2. Una hora más tarde, deseche los anticuerpos secundarios.
  3. Enjuague con PBS 3x.

7. Tinción celular

  1. Después de lavar las células, tiña las células con 300 μL de solución de trabajo DAB/pocillo.
    NOTA: Esta solución se preparó mezclando concentrado de cromógeno DAB y diluyente DAB de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Después de teñir las células durante 5 min, retire el tinte, enjuague con agua destilada desionizada y agite durante 5 min.

8. Contratinción celular

  1. Contratiña el núcleo celular con hematoxilina diluida.
    NOTA: Usamos Hematoxylin Gill II en una dilución de 10 veces y esperamos 5 min para el proceso de tinción.
  2. Después de 5 min, deseche la hematoxilina, luego lave con agua destilada desionizada durante 2 x 5 min.

9. Observación

  1. Observe los resultados de la tinción con un microscopio óptico.
    NOTA: Un verdadero positivo muestra una fuerte tinción marrón dentro de las células HeLa que expresan MDA5; esto confirma los autoanticuerpos anti-MDA5 en la muestra del paciente. Un resultado negativo muestra células HeLa sin tinción marrón, lo que indica que no hay autoanticuerpos anti-MDA5. Un resultado falso positivo muestra una extensa tinción marrón en todas las células, independientemente de la expresión de MDA5. Esta tinción inespecífica, observada en otras afecciones autoinmunes, debe distinguirse de un verdadero positivo para evitar un diagnóstico erróneo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El personal que realizó las pruebas no tuvo en cuenta las identidades de las muestras, incluidos los pacientes específicos de los que se obtuvieron, para minimizar el posible sesgo en el proceso de evaluación. Sin embargo, aunque las muestras de control sanas no se sometieron a cegamiento, produjeron resultados claros e inequívocos de manera consistente.

La Figura 1A demuestra la expresión exitosa d...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nuestra técnica basada en ICC para identificar autoanticuerpos anti-MDA5 ofrece ventajas significativas sobre los métodos tradicionales, como el análisis de transferencia de línea y el radioinmunoensayo. Anteriormente, Nombel et al. reportaron valores de sensibilidad y especificidad de 96% y 100%, respectivamente, al comparar la inmunofluorescencia indirecta (IIF) en células transfectadas con MDA5 con ELISA en una cohorte de 23 pacientes con dermatomiositis anti-MDA5 positivo y 22 contro...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Partes de este manuscrito se generaron con la ayuda de GPT-4 de OpenAI. Los autores revisaron y editaron el contenido para garantizar la precisión y la originalidad.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán otorgadas a Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 y NSTC 113-2320-B-039-032). Este estudio también fue apoyado en parte por subvenciones de la Universidad Médica y el Hospital de China otorgadas a Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 y C1110812016-12).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de 24 pozos (1,9 cm²/pozo)Corning354541
Antimicoótico antibióticoGibco15240062
VasosPYREX1000-600
Tubos cónicos (15 mL)Corning430052
Tubos cónicos (50 mL)Corning430290
Agua destilada desionizadaNuestra agua destilada desionizada se produce internamente mediante un sistema Milli-Q (Columna 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; Columna 2: Prepak, SN: F1CB11442)
Suero bovino fetal caracterizadoCytivaSH30396.03
cilindros graduados (50 mL)VITLAB64804
Hematoxilina Gill IILeica3801522
Hyclone Dulbecco' s Eagle Medium modificado con glucosa altaCytivaSH30243.02
Reactivo de transfección lipofectamina 2000Invitrogen11668019Reactivo de transfección
MDA-5 (D74E4) Rabbit mAbTecnología de señalización celular5321
Tubos microcentrífugas (tubos Eppendorf de 1,5 mL)AXYGEN142503
Medio sérico reducido de Opti-MEM IGibco31985070
Agitador orbital (opcional)FIRSTEKS300R
ParaformaldehidoSigma-Aldrich4% en 1x PBS
PBSPRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
Peroxidasa AffiniPure Goat Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch109-035-003
Controlador de pipetaTermo Científica130165
Pipettes GILSON
Pipetas y puntas de pipeta (10 y micro; L)QSP104-Q
Pipetas y puntas de pipeta (200 y micro; L)QSPT090-Q
Pipetas y puntas de pipeta (1000 y micro; L)QSP111-Q
Pipetas serológicas (5 mL)SPL91005
Pipetas serológicas (10 mL)SPL91010
Pipetas serológicas (25 mL)SPL91025
Kit de sustrato DAB SignalStainSeñalización celular80590,3% en PBS

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry. Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).
  2. Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R. Adult and juvenile dermatomyositis: are the distinct clinical features explained by our current understanding of serological subgroups and pathogenic mechanisms. Arthritis Res Ther. 15 (2), 211(2013).
  3. Fujisawa, T. Management of myositis-associated interstitial lung disease. Medicina. 57 (4), 347(2021).
  4. Sasaki, N., et al. Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease. Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).
  5. Go, D. J., et al. Survival benefit associated with early cyclosporine treatment for dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Rheumatol Int. 36 (2), 125-132 (2015).
  6. Tsuji, H., et al. Multicenter prospective study of the efficacy and safety of combined immunosuppressive therapy with high-dose glucocorticoid, tacrolimus, and cyclophosphamide in interstitial lung diseases accompanied by anti-melanoma differentiation-associated gene 5-positive dermatomyositis. Arthritis Rheumatol. 72 (3), 488-498 (2020).
  7. Hozumi, H., et al. Comprehensive assessment of myositis-specific autoantibodies in polymyositis/dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Respir Med. 122, 1-8 (2016).
  8. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  9. Koga, T., et al. The diagnostic utility of anti-melanoma differentiation-associated gene 5 antibody testing for predicting the prognosis of Japanese patients with DM. Rheumatology. 51 (7), 1278-1284 (2012).
  10. Fuzzi, E., et al. Anti-MDA5 dermatomyositis: an update from bench to bedside. Curr Opin Rheumatol. 34 (6), 365-373 (2022).
  11. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  12. Tansley, S. L., Diederichsen, L. P., Zampeli, V. A., McHugh, N. J. The reliability of immunoassays to detect autoantibodies in patients with myositis is dependent on autoantibody specificity. Rheumatology. 59 (5), 1029-1034 (2020).
  13. Chen, Y. L., Li, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (3), 345-350 (2024).
  14. Nombel, A., Pin, J. J., Fabien, N., Miossec, P., Coutant, F. Evaluation of the performance of an indirect immunofluorescence assay for the detection of anti-MDA5 antibodies. Biomedicines. 10 (12), 3125(2022).
  15. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  16. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  17. Chang, Y. C., Yang, L., Budhram, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (5), 626-630 (2024).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Ensayo de inmunocitoqu micaenfermedad pulmonar intersticialbiomarcadores de dermatomiositispermeabilizaci n con Triton X 100detecci n con peroxidasa de r banotinci n con crom geno DABmarcaje con anticuerpos secundarios

Artículos relacionados