El lavado nasal con solución salina se puede utilizar para tomar muestras del microambiente inmunitario nasal canino. Debido a que el abordaje es relativamente no invasivo y no altera los tejidos nasales, se puede realizar en serie. Las células y proteínas recogidas de la técnica de lavado nasal pueden ser procesadas para diversos análisis de laboratorio.
Artículo de método
Lavado salino para la toma de muestras del microambiente inmunitario nasal canino
En este artículo
Resumen
Resumen
La evaluación del microambiente inmunitario local de la cavidad nasal canina puede ser importante para investigar la salud normal de los tejidos y las enfermedades, en particular las asociadas con la inflamación local. Hemos optimizado una técnica para evaluar el microambiente inmune nasal local de perros a través de lavados nasales en serie. Brevemente, con los perros bajo anestesia y colocados en decúbito esternal, se inyecta solución salina estéril precalentada en la fosa nasal afectada mediante un catéter de goma blanda flexible. El reflujo de fluido se recoge en tubos cónicos y este proceso se repite. Los fluidos que contienen células y proteínas desalojadas se agrupan, y las muestras de lavado nasal agrupadas se filtran a través de un filtro de células para eliminar los desechos grandes y la mucosidad. Las muestras se centrifugan y los gránulos de la célula se aíslan para su análisis. Una vez que se han procesado las muestras, los análisis que pueden seguir al lavado nasal incluyen citometría de flujo, análisis transcriptómico de células a través de secuencias de ARN a granel o de una sola célula, y/o cuantificación de citocinas presentes en el líquido de lavado.
Introducción
Los perros desarrollan habitualmente afecciones nasales inflamatorias a lo largo de su vida. La causa subyacente de la rinitis aguda o crónica en los perros puede variar desde infecciosa (viral: p. ej., influenza, parainfluenza, herpesvirus; bacteriana [p. ej., Bordetella, micoplasmas], fúngica [p. ej., aspergilosis, criptococosis]; parasitaria [p. ej., ácaros nasales]) hasta neoplásica (p. ej., neoplasias malignas sinonasales, más comúnmente carcinoma o histotipos de sarcoma) a material extraño (p. ej., cuerpo extraño, migración intranasal de dientes desplazados) a enfermedad periodontal, así como la rinitis inflamatoria idiopática canina 1,2,3,4,5,6,7.
Además de un examen físico, se utilizan varios enfoques para evaluar el estado de la cavidad nasal en perros con inflamación nasal. Los procedimientos de diagnóstico por imágenes pueden incluir radiografías (dentales, de cráneo), tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética nuclear (RMN). Otro enfoque para obtener imágenes de la cavidad nasal es la rinoscopia. El muestreo de tejido puede implicar la adquisición de hisopos nasales, muestras de cepillo o biopsias de tejido, a partir de las cuales se puede realizar una evaluación citológica y/o histopatológica, así como el envío de muestras para cultivo de hongos o bacterias. Estas muestras se pueden obtener en una variedad de enfoques, que van desde el muestreo "ciego" hasta la guía por imágenes con rinoscopia o imágenes avanzadas, y se adquieren a través de las narinas, de la nasofaringe o con un enfoque quirúrgico de trepanación, rinotomía o sinusotomía.
El lavado nasal, que consiste en la administración de solución salina estéril en la cavidad nasal, también se ha utilizado para tomar muestras de la cavidad nasal canina con fines diagnósticos y terapéuticos. Una versión alternativa de la técnica de lavado nasal que se ha utilizado para los tumores nasales se denomina hidropulsión nasal, descrita como un enrojecimiento nasal forzado, que puede desplazar grandes muestras de tumores para su evaluación diagnóstica, así como proporcionar un alivio terapéutico para la mejora de los signos clínicos asociados con el cáncer nasal8.
Presentamos aquí otra versión de la técnica de lavado nasal con el propósito previsto de recolectar y analizar células y proteínas del microambiente inmunológico nasal. A través de un enfoque suave y relativamente no invasivo, hemos optimizado esta técnica de lavado nasal para el muestreo en serie del microambiente inmunitario nasal. En ensayos con perros con cavidades nasales no inflamadas, infección activa por herpesvirus y tumores nasales, hemos demostrado la utilidad del lavado nasal para la recolección y procesamiento de muestras para aplicaciones posteriores 9,10.
En este manuscrito describimos una técnica de lavado nasal salino para la toma de muestras seriadas del microambiente inmune nasal canino. Proporcionamos detalles del protocolo para adquirir la muestra de lavado nasal de manera efectiva con una interrupción mínima de los tejidos y luego, procesar las muestras para una variedad de análisis.
Protocolo
Este procedimiento de lavado nasal ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado y la Junta de Revisión Clínica (IACUC # 2425). En la Figura 1 se presenta un esquema del método de lavado nasal.
1. Preparación para el lavado nasal
- El día antes del procedimiento de lavado nasal, llene cinco jeringas de 20 ml con solución salina fisiológica estéril (solución de cloruro de sodio al 0,9%) y cierre con una tapa. Coloque las jeringas en una incubadora a 37 oC para que puedan calentarse durante la noche.
2. Posicionamiento del perro para el lavado nasal
- Anestesiar al perro para el procedimiento (p. ej., con inyección intravenosa (IV) de dexmedetomidina (1-4 μg/kg) y butorfanol (0,2-0,5 mg/kg) a través de un catéter intravenoso), seguido de la administración de propofol IV (2-5 mg/kg) titulado para la intubación; Mantenga la anestesia con isoflurano inhalante al 1-2% para hacer efecto). Confirme la profundidad adecuada de la anestesia verificando la respuesta palpebral y el tono de la mandíbula.
- Lubrique los ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento.
- Controle los valores de telemetría cardíaca, presión arterial, capnografía y oximetría de pulso durante todo el procedimiento.
- Coloque al perro anestesiado en decúbito esternal. Coloque la cabeza del perro de modo que quede inclinada de forma natural y cómoda en un ángulo hacia abajo desde el borde de la mesa de tratamiento para una recolección óptima de la muestra de lavado nasal.
- Infle el manguito del tubo endotraqueal para asegurar un sellado hermético de las vías respiratorias.
3. Realización del lavado nasal
- Corte un catéter de goma roja estéril de 8 FR en la base para que quede perfectamente ajustado en una de las jeringas precargadas de 20 ml que contienen la solución salina tibia. Mida un catéter de goma roja estéril de modo que la punta distal del catéter se extienda hasta aproximadamente la mitad de la cavidad nasal cuando se introduzca a través de la fosa nasal. Si se toma una muestra de un tumor nasal, use imágenes o guía rinoscópica para estimar la ubicación de la cara rostral del tumor nasal a fin de medir la longitud del catéter de goma roja de modo que la punta se extienda hasta la cara rostral del tumor.
- Luego, corte el catéter en la punta para la longitud definida del catéter intranasal de modo que la punta caiga en el lugar apropiado cuando se inserte en la cavidad nasal. Sin embargo, permita una longitud adicional para la base del catéter que se extienda fuera de la fosa nasal (longitud del catéter desde el punto de fijación de la jeringa hasta la entrada de la fosa nasal, aproximadamente 3-5 cm). Aplique una marca con un marcador permanente en el extremo de la base del catéter para indicar el punto de inicio, correspondiente a la entrada de la fosa nasal; La longitud predeterminada del catéter se extenderá intranasalmente, con la punta del catéter colocada en la ubicación deseada dentro de la cavidad nasal.
- La realización del procedimiento de lavado nasal requerirá la participación de dos personas. Haga que una persona (Persona A) sea responsable de introducir el catéter en la cavidad nasal y administrar el lavado, y que la otra persona (Persona B) recoja la muestra a medida que sale de la nariz.
- Haga que la Persona A se coloque delante y debajo de la cabeza del perro. Con las manos enguantadas, pídale a la persona A que guíe suavemente la punta del catéter de goma roja hacia la cara medial de la cavidad nasal y la haga avanzar hasta que la marca del catéter se alinee con la cara exterior de la fosa nasal. Durante este proceso, asegúrese de que el catéter esté conectado a la jeringa que contiene la solución salina estéril calentada. Pídale a la persona B que sostenga un tubo cónico de 50 ml debajo de la fosa nasal con el catéter colocado.
- La persona A ocluye suavemente la fosa nasal contralateral y comienza a infundir la solución salina en la cavidad nasal con una presión lenta y constante o con una infusión pulsada. Como la cabeza del perro se coloca en un ángulo hacia abajo, la persona B recoge el líquido que drena de la cavidad nasal a través de la gravedad en el tubo cónico de 50 ml.
- Repita esta técnica de lavado nasal hasta un total de cinco lavados con solución salina de 20 ml, cambiando los tubos cónicos, según sea necesario, para recolectar las muestras agrupadas. Registre el volumen total de líquido de lavado nasal recolectado en relación con la cantidad de solución salina infundida después de la finalización del procedimiento.
- Una vez finalizado, si se anestesia con dexmedetomidina, administre por vía intramuscular el mismo volumen de atipamezol que se utiliza para la dexmedetomidina, y permita que el perro se recupere de la anestesia. Para ser precavido, mantenga al perro en decúbito esternal con la cabeza colocada hacia abajo para facilitar el drenaje adicional de cualquier solución salina residual del lavado nasal.
4. Procesamiento de la muestra de lavado nasal
- Agitar suavemente y/o pipetear las muestras de lavado nasal contenidas dentro de los tubos cónicos para romper los grupos de residuos y células. Pase las muestras de lavado nasal agrupadas a través de un filtro de filtrado de células de 70 μm para eliminar los residuos grandes y la mucosidad. Centrifugar las muestras a 300 × g durante 5-10 minutos para formar un pellet de celda.
- Recoger el sobrenadante por aspiración con una pipeta y depositarlo en un tubo limpio para el análisis de las proteínas de interés.
- Vuelva a suspender los gránulos celulares en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o en la solución preferida para los ensayos celulares de interés.
- Para eliminar los glóbulos rojos de las muestras, realice la lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK) para recolectar las células nucleadas del lavado nasal11,12.
Resultados
Con este método de lavado nasal, la muestra recolectada aparecerá ligeramente turbia, posiblemente con pedazos visibles de desechos celulares y moco cuando se gira el tubo. Se consideraría que una muestra está contaminada con sangre periférica si el procedimiento de lavado induce inadvertidamente una hemorragia y la muestra está teñida de rojo. Si bien parte de la solución salina infundida se perderá durante el procedimiento, se consideraría un lavado negativo si la solución salina infundida no fluye de regreso fuera de la fosa nasal hacia el tubo; Las posibles causas podrían ser que la cabeza no esté inclinada hacia abajo lo suficiente como para permitir un reflujo efectivo, que la muestra se haya drenado caudal o lateralmente a través de la fosa nasal contralateral, o que el catéter de goma roja no esté firmemente fijado a la jeringa y que la solución salina se haya filtrado hacia afuera desde el punto de conexión.
Cuando se han recogido con éxito muestras de lavado nasal de perros con cáncer nasal, se prevén recuentos de células nucleadas en el rango de 1 × 10 6-200 × 106, con un 75-96% de células vivas. Por otro lado, cuando se han recogido con éxito muestras de lavado nasal de perros con cavidades nasales sanas y no inflamadas, los recuentos de células han estado en el rango de 7 × 105-2 × 106, con un 6-16% de células vivas. En la Figura 2 se presenta una imagen representativa de los especímenes citológicos obtenidos de muestras de lavado nasal de perros portadores de tumores. Además, en la Figura 3 se presenta la evaluación citométrica de flujo de las poblaciones celulares analizadas a partir de muestras de lavado nasal de perros sanos y portadores de tumores. Se esperaría que los recuentos de células y el porcentaje de viabilidad inferiores a estos rangos indicaran que el procedimiento de lavado nasal y la recolección de muestras no tuvieron éxito. En la Tabla 1 se resumen los resultados de la técnica de lavado nasal realizada por los autores con respecto al número de procedimientos realizados, el número de perros, el estado de la cavidad nasal (sana o portadora de tumor), el rendimiento de los recuentos de células nucleadas, la viabilidad de las células obtenidas para el procedimiento y si la muestra de lavado se consideró un éxito o un fracaso para el análisis posterior. A los efectos de los experimentos realizados con las muestras de lavado nasal incluidas en la Tabla 1, se consideró que una producción mínima de 150.000 células era una recolección exitosa de muestras de lavado nasal.
Con esta técnica de lavado nasal, se utiliza solución salina estéril al 0,9% para recoger las células. Alternativamente, se podría considerar la solución de Hartmann (solución de Ringer lactato); sin embargo, las muestras recolectadas con solución salina o solución de Hartmann tendrían que ser analizadas para garantizar una viabilidad y resultados comparables para las células de interés. Además, una alternativa al uso de un catéter de goma roja en perros no portadores de tumores podría ser realizar el lavado nasal con un catéter Foley. Aunque no se utiliza en la técnica de lavado nasal que se presenta aquí, el uso de un catéter de Foley permitiría inflar el balón en la punta del catéter, ocluyendo la cavidad nasal y evitando la pérdida de líquido caudal. Además, aunque no se ha probado en el enfoque de procesamiento de lavado nasal presentado aquí, se podría considerar la adición de hialuronidasa a la muestra de lavado nasal para romper la mucosidad recolectada en la muestra de lavado nasal y liberar más células para el análisis. Esto también tendría que optimizarse para garantizar que los resultados no se vean alterados por la adición de hialuronidasa al procedimiento de procesamiento de lavado nasal.
En la Figura 310 se presentan los resultados publicados obtenidos de procedimientos exitosos de lavado nasal realizados en perros inscritos en un ensayo clínico de cáncer canino. Los resultados presentados en la Figura 3 provienen de un estudio que investigó el impacto de la irradiación ganglionar electiva en el microambiente inmunitario local de perros con tumores nasales cuyos tumores se irradiaron solos o en combinación con la irradiación de ganglios linfáticos cervicales regionales. A través de muestreos seriados de la cavidad nasal de perros en el ensayo clínico con lavado nasal, el análisis citométrico de flujo de las células recolectadas reveló una disminución significativa en las poblaciones de células T efectoras en el último día de radioterapia cuando los ganglios linfáticos regionales se irradiaron simultáneamente con el tumor nasosinual en comparación con los perros que recibieron radioterapia dirigida al tumor y los ganglios linfáticos regionales se salvaron. Esto demuestra la utilidad de tomar muestras en serie de la cavidad nasal con lavado para investigar los cambios en las poblaciones celulares en diferentes puntos y con diferentes condiciones de tratamiento.
Figura 1: Esquema del método de lavado nasal. La solución salina estéril y calentada se infunde en la cavidad nasal de los perros anestesiados mediante un catéter de goma roja. El líquido de lavado nasal se recoge en un tubo a medida que drena de la nariz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Composición celular de una muestra de lavado nasal recogida de un perro con un tumor nasal. Imagen representativa de muestras citológicas obtenidas de muestras de lavado nasal (aumento de 500x, tinción de Wright-Giemsa modificada). Los neutrófilos (flechas) son las células predominantes, con algunas células epiteliales escamosas (punta de flecha) y pequeños linfocitos maduros (resaltados en el cuadro cuadrado) también presentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis citométrico de flujo de muestras de lavado nasal recolectadas de perros sanos y portadores de tumores. Comparación de la abundancia de células vivas, células inmunitarias y neutrófilos entre perros sanos (azul, n = 3) y perros portadores de tumores con carcinoma nasal (rojo, n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis citométrico de flujo de células recolectadas del lavado nasal de perros inscritos en un ensayo clínico que investiga el impacto de la irradiación ganglionar electiva (ENI) en el microambiente inmunológico local. Cuantificación de linfocitos T CD4 (CD5+CD4+) y CD8 (CD5+CD8+) a partir de muestras de lavado nasal. Los perros tratados con ENI simultáneamente con la irradiación tumoral (n = 3) tuvieron una reducción significativa de las células T efectoras CD4 y CD8 en el último día de radiación (día 3) en comparación con los perros tratados con radiación dirigida al tumor solo (n = 3). Esta figura fue modificada a partir de Darragh et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Saludable (n=3) | Portación tumoral (n= 19) | |
| Número de procedimientos realizados | 3 | 80 |
| Recuento de células | 0,7 x 106 - 2,8 x 106 | 1,6 x 106 - 210 x 106; Mediana: 8.7 x 106 |
| Viabilidad celular | 6.3 - 15.9% | 75% - 96%; Mediana: 87% |
| Tasa de éxito | 100% | 98.80% |
Tabla 1: Resumen de los procedimientos de lavado nasal realizados y características celulares de las muestras obtenidas.
Discusión
Hay varios pasos críticos en el protocolo de lavado nasal. Con respecto al perro que se somete al procedimiento de lavado nasal, el perro debe estar dentro de un plano de anestesia lo suficientemente profundo para que no reaccione a la colocación del catéter o a la administración del lavado. Si son reactivos bajo anestesia, esto puede comprometer la calidad y la cantidad de la recolección de muestras de lavado, así como aumentar potencialmente los riesgos de lesión aguda del tejido nasal debido a un traumatismo local del catéter intranasal o para el perro que aspira el líquido de lavado.
La posición de la cabeza del perro también es fundamental para una recolección óptima de la muestra de lavado nasal. Si el ángulo descendente de la cabeza es insuficiente para el reflujo dependiente de la gravedad de la solución salina instilada, el líquido de lavado nasal puede fluir caudalmente y la muestra podría perderse a través de la nasofaringe. Además, es importante una comunicación clara entre la persona A y la persona B durante el procedimiento de lavado nasal. Es posible que la persona B requiera ajustes rápidos para la colocación del tubo de recolección, ya que el líquido drena de la fosa nasal mientras la persona A se enjuaga; La visibilidad del líquido de lavado que fluye hacia el tubo cónico puede no ser completamente clara tanto para la persona A como para la persona B durante el procedimiento, por lo que la comunicación activa durante todo el proceso es clave para una recolección exitosa de la muestra. Una vez que se ha recogido la muestra de lavado nasal, si se quiere preservar la viabilidad celular para futuros análisis, es fundamental que las células se mantengan en una solución fisiológica de pH, como solución salina al 0,9% o 1x PBS.
Se pueden realizar modificaciones en el protocolo de lavado nasal a lo largo de las fases de recolección y procesamiento. Durante la recolección de la muestra, se puede ajustar la profundidad de la anestesia para garantizar que el perro no reaccione al lavado nasal. Esto se puede lograr ajustando el porcentaje del gas anestésico (por ejemplo, isoflurano) o administrando un bolo de anestésico intravenoso de acción corta (por ejemplo, propofol).
Si después de la instilación de la solución salina en la cavidad nasal, solo se recoge una pequeña cantidad de líquido en el tubo, vuelva a colocar la cabeza del perro en un ángulo hacia abajo, de modo que descanse cómodamente del borde de la mesa, para aumentar el potencial de gravedad y permitir que el líquido se drene de la nariz. Si se observa que drena líquido de la fosa nasal contralateral, ocluya herméticamente la fosa nasal contralateral para los siguientes lavados. Durante la fase de procesamiento, si el recuento inicial de células de la muestra es bajo, vuelva a centrifugar la porción sobrenadante de la muestra para recolectar cualquier celda adicional que pueda estar presente para aumentar el rendimiento total.
Existen limitaciones notables para utilizar el método de lavado nasal para analizar el microambiente inmunológico nasal canino. Con esta técnica, las muestras de lavado nasal son una colección de células y proteínas de la superficie de la cavidad nasal que se desprenden fácilmente. Estas células y proteínas de la superficie pueden no ser totalmente representativas de los tejidos más profundos del microambiente nasal canino. Se están realizando esfuerzos para comparar los perfiles celulares y proteicos del lavado nasal canino con las muestras de biopsia para determinar las similitudes y diferencias en estos factores entre las dos técnicas de muestreo de la cavidad nasal.
A pesar de estas limitaciones, la técnica de lavado nasal para tomar muestras del microambiente inmunitario nasal canino proporciona un enfoque alternativo a los métodos existentes. En comparación con una biopsia de tejido o incluso un procedimiento de rinoscopia, el lavado nasal es relativamente no invasivo para el paciente canino. La recolección de células y proteínas a través del lavado nasal en comparación con la biopsia de tejido disminuye los riesgos de hemorragia aguda clínicamente preocupante, prolongada o significativa; Después del procedimiento de lavado nasal, también es probable que haya menos inflamación y molestias locales en comparación con una biopsia de tejido nasal. Debido a esto, el lavado nasal se puede realizar en serie para recolectar múltiples muestras a lo largo del tiempo para su análisis. Además, existe una mayor facilidad relativa en el procesamiento de las muestras de lavado nasal en comparación con las muestras de biopsia de tejido con respecto a la separación del componente celular de las proteínas dentro del sobrenadante para los métodos y ensayos de laboratorio posteriores.
El método de lavado nasal tiene el potencial de aplicaciones importantes en áreas de investigación asociadas con el microambiente inmunológico. En la investigación del cáncer, se ha utilizado la técnica de lavado nasal10 y se puede utilizar para documentar cambios seriados en el microambiente de la cavidad nasal en perros portadores de tumores en relación con las condiciones de tratamiento; Estas muestras de lavado nasal también pueden resultar valiosas para correlacionar los cambios en el microambiente inmunitario para comprender mejor las respuestas al tratamiento del cáncer. Aspectos similares de la investigación de cambios en serie en el microambiente inmunitario nasal pueden ser explorados e investigados para numerosas áreas de investigación veterinaria, clínica y traslacional, infecciosa e inflamatoria.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
La técnica de lavado nasal canino descrita en este documento se ha optimizado a través de proyectos respaldados por K01 OD03109, CCTSI Colorado Pilot Grant Award, CSU CVMBS College Research Council Shared Resources Program y CO HNC SPORE CA261605: Career Enhancement Program. La Figura 1 se creó con BioRender.com.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml Tubos | Eppendorf | 05-402 | |
| 1000 µ L Pipeta | VWR | 89079-974 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Jeringas de 20 mL | VWR | BD302830 | |
| 50 mL Tubos cónicos | VWR | 89039-656 | |
| 70 µ Filtro de células m | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| 8FR Catéter de goma rojo estéril | Med Vet International | 50-252-2428 | |
| ACK Tampón de lisis | Gibco | A1049201 | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | 366816 | |
| Fisiología Salina (0.9%) | Vetivex | 17033-492-01 | |
| Vortex | VWR | 10153-838 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
