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Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

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DOI:

10.3791/67598

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29 de noviembre de 2024

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1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos la manipulación genética aguda de organoides corticales humanos cortados en rodajas por electroporación. Estos modelos de organoides corticales son particularmente susceptibles a la inyección, ya que las estructuras similares a los ventrículos se pueden identificar fácilmente después del corte, lo que permite la investigación funcional del desarrollo cortical humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución cortical.

Resumen

Los organoides corticales humanos se han convertido en herramientas importantes para estudiar el desarrollo del cerebro humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución del cerebro humano. Los estudios que analizan la función génica por sobreexpresión o knockout han sido fundamentales en modelos animales para proporcionar información mecanicista sobre la regulación del desarrollo del neocórtex. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la eliminación aguda de genes mediada por CRISPR/Cas9 por electroporación de organoides corticales humanos cortados. El corte de organoides corticales ayuda a la identificación de estructuras similares a ventrículos para la inyección y la posterior electroporación, lo que lo convierte en un modelo particularmente adecuado para la manipulación genética aguda durante el desarrollo cortical humano. Describimos el diseño de RNAs guía y la validación de la eficiencia de focalización in vitro y en organoides corticales. La electroporación de los organoides corticales se realiza en las etapas neurogénicas medias, lo que permite dirigirse a la mayoría de las principales clases de células en el neocórtex en desarrollo, incluida la glía radial apical, las células progenitoras basales y las neuronas. En conjunto, la electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas representa una técnica poderosa para investigar la función de los genes, la regulación de los genes y la morfología celular durante el desarrollo cortical.

Introducción

El neocórtex se refiere a la cubierta externa de los hemisferios cerebrales y es una estructura exclusiva de los mamíferos. El neocórtex representa la sede de las funciones cognitivas superiores 1,2,3,4,5. Durante el desarrollo, las células madre neurales y progenitoras dan lugar a neuronas en un proceso denominado neurogénesis. Los estudios funcionales que investigan el desarrollo del neocórtex humano proporcionan la base para dilucidar los mecanismos que subyacen a la regulación de las células madre neurales humanas, las patologías neuronales y la evolución del cerebro humano 2,6,7.

Históricamente, los estudios del desarrollo del cerebro humano se basaban en enfoques histológicos descriptivos que utilizaban tejido post-mortem, con sistemas de cultivo de tejidos más recientes que flotaban libremente y que permitían investigaciones funcionales con tejido fetal humano 8,9. Además, se demostró que el tejido cerebral fetal humano tiene la capacidad de autoorganizarse en organoides en expansión a largo plazo10. La investigación de tejidos fetales ha proporcionado importantes conocimientos sobre el desarrollo humano11,12, sin embargo, la disponibilidad restringida de tejidos y las consideraciones éticas limitan su aplicación generalizada para estudios mecanicistas del desarrollo del cerebro humano. En la última década, se han desarrollado protocolos que permiten la generación de organoides neurales tridimensionales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC), incluyendo la PSC inducida humana (hiPSC)13,14.

Los organoides cerebrales muestran características importantes del cerebro en desarrollo, como la formación de estructuras similares a ventrículos, la polaridad apicobasal, la citoarquitectura cortical, la migración nuclear intercinética durante la división de la glía radial y la migración neuronal. Es importante destacar que estos nuevos modelos de organoides humanos recapitulan características del cerebro humano en desarrollo que no se modelan bien en el ratón, incluidos los tipos de progenitores neuronales clave evolutivamente relevantes, en particular la glía radial basal (o glía radial externa)7,14,15. Varias limitaciones de los protocolos tempranos de organoides cerebrales, como los problemas con la heterogeneidad de los organoides, el suministro limitado de nutrientes al núcleo interno y la identidad regional variada, se han abordado en los avances recientes del protocolo y se pueden esperar nuevas mejoras en los próximos años 15,16,17,18,19. Los organoides cerebrales y corticales humanos se han convertido rápidamente en modelos clave para estudiar el desarrollo cortical humano20, los trastornos neurológicos 21,22,23,24 y la evolución cerebral 25,26,27,28,29, y para realizar abordajes de cribado a gran escala 30,31,32.

Para la manipulación genética aguda, se han utilizado principalmente dos métodos en modelos animales de desarrollo de neocórtex: la administración viral por infección de células diana33 y la electroporación in utero o in vitro 34,35. La inyección de ADN -y, más recientemente, de los complejos de ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 (RNP)- en los ventrículos laterales, seguida de electroporación, ofrece la ventaja de que se pueden seleccionar regiones específicas del cerebro en función de la orientación de los electrodos de electroporación. La electroporación implica breves impulsos eléctricos que aumentan temporalmente la permeabilidad de la membrana celular, lo que permite la introducción de ADN y otras moléculas cargadas en las células. La electroporación en el útero se realizó por primera vez en el ratón37, donde rápidamente se convirtió en una metodología ampliamente aplicada para la neurobiología del desarrollo. Posteriormente, el método también se aplicó a otras especies, como la rata38,39 y el hurón 40,41,42, una especie giroencefálica utilizada para estudiar la expansión del neocórtex y el plegamiento cortical 3,43,44,45.

La electroporación también se ha convertido en un método importante en la investigación de organoides cerebraleshumanos 46. En organoides cerebrales, la electroporación se ha aplicado para visualizar la morfología celular y los axones neuronales14,47, para administrar reactivos de knockdown de genes 22,48,49 y para la investigación de la función génica por sobreexpresión50. El método no se restringe a modelos humanos, sino que también se ha aplicado para la modificación genética de organoides cerebrales de primates50,51. Además, se ha descrito la electroporación de organoides corticales generados en un biorreactor de espín Ω hilatura52.

En este protocolo, describimos la electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas15 para estudios de la función de los genes en el desarrollo cortical. Los organoides específicos de la región del cerebro aumentan la reproducibilidad y la consistencia, que son fundamentales para el éxito del análisis cuantitativo, por ejemplo, en el modelado de enfermedades. En el protocolo de organoides corticales humanos cortados15, se aplican potentes señales de patrones durante la diferenciación de iPSC para obtener una población homogénea de progenitores del prosencéfalo dorsal, a lo que sigue la aplicación de medios de cultivo que promueven el crecimiento de tejidos con menos señales instructivas 53,54. Se ha demostrado que el corte de organoides corticales reduce la muerte celular resultante de la menor disponibilidad de nutrientes y oxígeno en el núcleo del organoide15. Además, el corte apoya el desarrollo de estructuras similares a ventrículos que contienen abundante glía radial basal, con una neurogénesis sostenida que conduce a la formación de una región expandida en forma de placa cortical15. El corte repetido en este protocolo también hace que estos organoides corticales sean particularmente adecuados para la electroporación, ya que los lúmenes del ventrículo pueden identificarse y dirigirse fácilmente mediante inyección. La electroporación de organoides corticales cortados se ha aplicado para estudiar las regiones reguladoras de genes y la evolución cortical26,55.

Durante el procedimiento de electroporación, la mezcla de inyección se administra a la luz de las estructuras similares a los ventrículos. Tras la aplicación de un campo eléctrico pulsado, la mezcla es absorbida por la glía radial apical que recubre el ventrículo. A medida que la glía radial apical se divide y da lugar a tipos de células más comprometidas4, los agentes electroporados se transmiten a las células progenitoras basales y a las neuronas. La progenie electroporada se distribuye en la zona ventricular (VZ) y en la zona subventricular (SVZ) después de 3 días y abarca la mayor parte de la pared cortical, incluida la región similar a la placa cortical (CP), a los 7 días después de la electroporación durante las etapas neurogénicas medias26,55.

Aquí, describimos la disrupción génica mediada por CRISPR/Cas956 por electroporación en organoides corticales humanos cortados en rodajas26. Además, el método de electroporación también se puede aplicar para la sobreexpresión de genes, la visualización de la morfología celular y los procesos celulares por expresión de proteínas fluorescentes, la entrega de bibliotecas de plásmidos para ensayos de reporteros paralelos masivos (MPRA), la entrega de herramientas de edición de epigenomas y el etiquetado de células para imágenes en vivo.

Protocolo

Todos los experimentos con células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) se realizaron de acuerdo con las normas éticas descritas en la Declaración de Helsinki de 1964 y aprobadas por el Comité de Revisión Ética del Hospital Universitario de Dresde (IRB00001473; IORG0001076; número de aprobación ética SR-EK-456092021).

1. Diseño de ARN guía para la eliminación aguda de genes mediada por CRISPR/Cas9

  1. Diseñar un par de ARN guía (ARNg) dirigidos al mismo exón con una distancia idealmente de 7-11 pb (evitando múltiplos de 3 pb) entre los motivos adyacentes del protoespaciador (MAP) para aumentar la probabilidad de disrupción de proteínas utilizando software o herramientas en línea.
    NOTA: Idealmente, los exones que codifican dominios funcionales deben ser destinos. Alternativamente, se pueden elegir los primeros exones de la transcripción (Figura 1A). Seleccione los ARN guía en función de la puntuación de actividad (cercana a 1)57 y la puntuación de especificidad (cercana al 100 %)58.

2. Cultivo de células madre pluripotentes inducidas humanas

  1. Para generar organoides corticales humanos y validar la función del ARNg, utilice la línea hiPSC CRTDi004-A59 que se deriva de un donante sano.
  2. Cultive las iPSCs como se describió anteriormente60 en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz de membrana basal en medio de células madre en condiciones estándar (37 °C, 5% CO2). Las PSC inducidas deben pasarse al 80% de confluencia utilizando una enzima para la disociación unicelular con suplementación con inhibidor de la vía ROCK (1:1.000) durante las primeras 24 h.
    NOTA: Se pueden utilizar otras líneas de iPSC para la generación de organoides y la validación de ARNg.

3. Extracción de ADN genómico a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas

  1. Utilice 2 pocillos de hiPSC confluente al 80%-90% de una placa de 6 pocillos para la extracción de ADN genómico. Disocia las células de la placa con una enzima para hacer una suspensión de una sola célula. Tome las células en 1 mL de medio de células madre (volumen total), luego centrifugue durante 10 min a 600 x g y retire el sobrenadante.
  2. Vuelva a suspender el pellet celular en 250 μL de tampón de lisis (50 mM de TrisHCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 0,5 % de SDS, 5 mM de EDTA enH2O) y 12,5 μL de proteinasa K (10 mg/mL de stock). Incubar durante 2 h a 55 °C y 250 rpm.
  3. Mezclar 100 μL de 5 mM de NaCl. Centrifugar durante 10 min a 18.000 x g a 4 °C y transferir el sobrenadante a nuevos tubos de reacción de 1,5 mL.
  4. Añadir 250 μL de isopropanol, invertir los tubos varias veces y centrifugar durante 15 min a 18.000 x g a 4 °C.
  5. Retirar el sobrenadante, lavar con 500 μL de EtOH al 70 % (grado de biología molecular), invertir los tubos y centrifugar durante 10 min a 18.000 x g a 4 °C.
  6. Finalmente, retire completamente el sobrenadante pipeteándolo con cuidado y presionando los tubos de reacción abiertos sobre toallas de papel.
  7. Deje que el pellet se seque al aire durante 10 min a RT, luego disuelva el pellet en 100 μL de agua sin nucleasa durante 30 min a 37 °C.
  8. Mide la concentración del ADN con un espectrómetro. El ADN genómico aislado es estable a -20 °C durante varios meses.

4. Verificación del reconocimiento de plantillas por ARNg (in vitro)

NOTA: Como primer enfoque para validar el reconocimiento exitoso de plantillas por parte de los ARNg, realice una reacción Cas9 in vitro en la que el ADN bicatenario se divide en dos fragmentos que se pueden distinguir mediante electroforesis en gel de agarosa 40,61,62.

  1. Para generar la plantilla, se realiza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con una mezcla maestra de PCR de alta fidelidad y cebadores de 10 μM en ADN genómico aislado de hiPSC (sección 3) utilizando las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s, 40 ciclos [98 °C, 10 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 1 min] y elongación final a 72 °C durante 5 min.
    1. Ajuste la temperatura de recocido de acuerdo con los cebadores de PCR. Asegúrese de que el amplicón tenga un tamaño de 800 pb a 1,5 kb con localización asimétrica de los sitios de unión al ARNg.
    2. Resuelva el producto de PCR mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1,5%, corte la banda correspondiente del gel y extraiga el ADN26.
    3. Mida la concentración de ADN del producto de PCR extraído con un espectrómetro.
  2. Ensamble el ARNg funcional combinando 10 μM de ARN CRISPR (ARNcr, secuencia personalizada, stock de 100 μM) y 10 μM de ARNg tracrARN (stock de 100 μM) en un tampón dúplex sin nucleasas (volumen total de 5 μL). Incubar la mezcla durante 5 minutos a 95 °C, luego dejar que se enfríe a temperatura ambiente (RT).
  3. Cree el complejo de ribonucleoproteína (RNP) combinando 10 μM del ARNg del paso 4.2 y 1 μM de la enzima Cas9 (de Streptococcus pyogenes, stock de 62 μM) en PBS durante 15 min a RT (25 μL de volumen total).
  4. Para realizar la reacción de digestión in vitro , mezcle 1 μM del complejo RNP (del paso 4.3) con 0,1 μM de molde de ADN (producto de PCR del paso 4.1) y 1x tampón de reacción de nucleasa Cas9 (que contiene 200 mM de HEPES, 1 M de NaCl, 50 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA; pH 6,5; se puede almacenar en alícuotas a -20 °C).
    1. Llene hasta un volumen final de 10 μL con agua sin nucleasas.
    2. Incubar la reacción a 37 °C durante 1 h.
    3. Añadir 2 mg/mL de proteinasa K e incubar durante otros 10 min a 56 °C para liberar el sustrato de ADN de la enzima Cas9. Almacene la mezcla de reacción digerida a 4 °C o -20 °C hasta el análisis final.
      NOTA: Se recomienda utilizar una relación molar de 10:1 de sustrato Cas9-RNP:DNA para obtener la mejor eficiencia de escisión. Diluir el producto de PCR en agua sin nucleasas hasta la concentración requerida, si es necesario. Como control negativo, se puede llevar consigo una mezcla de reacción que carezca del ARNg o de la enzima Cas9.
  5. Visualice los productos escindidos mediante electroforesis en gel de agarosa en un gel de agarosa al 2%.
    NOTA: Idealmente, dos bandas de diferentes tamaños deberían ser visibles y la banda plantilla debería haber desaparecido o estar muy reducida para que los ARNg sean eficientes (Figura 1B).

5. Verificación de la función del ARNg en células madre pluripotentes inducidas humanas

NOTA: Se recomienda probar la eficiencia de los ARNg dirigidos a la misma línea celular a partir de la cual se generarán organoides corticales26. Para ello, los complejos RNP que contienen los ARNg relevantes se cotransfectan con un plásmido de expresión de GFP en hiPSCs, las células se cultivan durante 3 días y posteriormente se aísla el ADN genómico para su análisis de secuenciación. Para cada prueba de ARNg, se requieren aproximadamente 200.000 células. Las células no deben tener más de un 70%-80% de confluentes y deben haber sido pasadas al menos dos veces después de la descongelación. Es importante llevar un control negativo (gLACZ)36,63 y una condición simulada (solución de nucleofección sin RNP).

  1. Cambie el medio de la hiPSC para incluir un inhibidor de ROCK (1:1.000) 2 h antes del experimento para aumentar la viabilidad de las células en una campana de cultivo celular.
  2. Cubra el número adecuado de pocillos de una placa de 6 pocillos con una matriz de membrana basal.
  3. Ponga en marcha la unidad nucleofectora ("unidad X" para tiras de 16 pocillos) y seleccione el programa "Celdas ES, H9" como preprogramado (pulso CB150). Seleccione el número adecuado de pozos de la tira.
  4. Prepare los complejos RNP combinando 24 μM de crRNA y 24 μM de tracrRNA en Duplex Buffer.
    1. Incubar a 95 °C durante 5 min, luego dejar enfriar hasta RT, como se describe en el paso 4.2.
    2. Mientras tanto, diluya la enzima Cas9 a 8 μM en PBS.
    3. Combine 3 μL de ARNg y 3 μL de Cas9, e incube 15 min en RT para ensamblar el RNP.
      NOTA: Una relación molar de 3:1 gRNA:Cas9 proporciona una eficiencia de escisión óptima. Para probar los ARNg como un par, prepare cada RNP por separado y combine 1,5 μL de cada RNP al final.
  5. Durante los 15 min de incubación de RNP, prepare el hiPSC para la nucleofección bajo una campana de cultivo celular.
    1. Reemplace el recubrimiento de la membrana basal con 1,5 mL de medio de células madre suplementado con inhibidor de ROCK (1:1.000) y 1x penicilina/estreptomicina por pocillo.
    2. Prepare la solución de nucleofección como una mezcla maestra en hielo siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Separe las hiPSC de la placa para hacer una suspensión de una sola célula (como se describe en la sección 2) y cuente las células con tinción de azul de tripán en una cámara de recuento de Neubauer.
    4. Granule 200.000 células vivas por par de ARNg a 600 x g durante 5 min.
  6. En la campana de cultivo celular, en hielo, añadir 3 μL de RNP a 20 μL de solución de nucleofección más 0,2 μg/μL de plásmido pCAG-GFP.
  7. Vuelva a suspender las células peletizadas en los 23 μL de la mezcla final de nucleofección y transfiéralas a 1 pocillo de una tira de nucleofección de 16 pocillos en hielo.
  8. Una vez que todas las condiciones estén en la tira, colóquela en la unidad X de la máquina nucleofectora fuera de la campana y presione el botón Inicio para iniciar la nucleofection.
  9. Posteriormente, transporte la tira de nucleofección de nuevo bajo la cubierta de cultivo celular y transfiera las células nucleofectadas a la placa preparada de 6 pocillos enjuagando los pocillos de tira con algún medio de la placa.
  10. Cultive la hiPSC durante 3 días, cambiando el medio que contenga 1x Penicilina/Estreptomicina al día. Después de 24 horas, el inhibidor de ROCK ya no es necesario.
  11. Compruebe la señal de GFP bajo un microscopio fluorescente convencional (Figura 1C).
    1. En el día 3, clasifique y recoja las células positivas para GFP mediante clasificación de células activadas fluorescentes (FACS).
    2. Prepare el tampón de clasificación con 2% de FBS en PBS y manténgalo a 4 °C.
    3. Enfríe una centrífuga de sobremesa a 4 °C. Prepare tubos de reacción de 1,5 mL con tampón de clasificación de 50 μL que contenga inhibidor de ROCK (1:1.000) para la recolección de células después de FACS en hielo y tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 mL con tapas de filtro de células en hielo.
    4. Hacer suspensiones unicelulares de las células nucleofectadas.
    5. Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio de células madre que contenga inhibidor de ROCK (1:1.000) por muestra y centrifugue a 600 x g durante 5 min.
    6. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de clasificación con inhibidor de ROCK (1:1.000), luego agregue 0,4 μL de DAPI (2 ng/μL) para identificar las células vivas por FACS.
    7. Pipete la solución celular a través de la tapa del filtro de celdas de los tubos de fondo redondo enfriados para eliminar cualquier aglomeración de células residuales.
      NOTA: DAPI puede comprometer la viabilidad de la célula con el tiempo y, por lo tanto, es mejor agregar fresco a cada muestra antes de clasificarla.
    8. Clasificar 10.000 células vivas positivas para GFP (DAPI negativas) en los tubos de reacción de 1,5 ml previamente preparados con 50 μL de tampón de clasificación que contiene inhibidor de ROCK (en hielo).
  12. Después de FACS, extraiga directamente el ADN genómico de las células clasificadas.
    1. Gire las celdas recolectadas y ordenadas en el tampón de clasificación a 600 x g durante 10 minutos.
    2. Retire el sobrenadante y tome el pellet celular en 250 μL de tampón de lisis más 12,5 μL de proteinasa K por muestra.
    3. Continúe como se describe en la sección 3.
    4. Finalmente, disuelva el pellet de ADN en 50 μL de agua libre de nucleasas.
  13. Realice una PCR para generar una plantilla para la secuenciación de Sanger, como se describe en el paso 4.1. Como control, utilice el ADN de la condición gLACZ y los cebadores dirigidos al gen de interés (los mismos cebadores que se utilizan en la sección 4). Extraiga las bandas apropiadas de la electroforesis en gel de agarosa, purifíquela sobre una columna y envíela para la secuenciación de Sanger.
  14. Alinee los resultados de la secuenciación de Sanger mediante una alineación global por pares.
    NOTA: La focalización exitosa se puede identificar mediante señales superpuestas o secuencias incompletas resultantes de inserciones/deleciones aleatorias alrededor del sitio de unión del ARNg (Figura 1D).

6. Generación de organoides corticales humanos cortados en rodajas

NOTA: Los organoides corticales humanos (hCO) se generan según el método de organoides neocorticales cortados (SNO), como se describió anteriormente en detalle15,60.

  1. Separe las pequeñas colonias de hiPSC de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 mg/mL de colagenasa incubando durante 30-40 min a 37 °C en una incubadora. Mientras tanto, cubra una nueva placa de 6 pocillos con la matriz de membrana basal.
    1. Detenga la enzima con 1 mL de medio de células madre y recoja las colonias con una punta de diámetro ancho en 5 mL de medio de células madre en un tubo cónico de 15 mL.
      NOTA: Cualquier paso que mencione "puntas de pipeta de diámetro ancho" también se puede realizar con puntas cortadas a una abertura de al menos 2 mm de diámetro.
    2. Una vez que las colonias se hayan asentado en el fondo, retire el medio viejo y reemplácelo con medio fresco de células madre.
    3. Con una punta de diámetro ancho, distribuya las colonias de manera uniforme en la placa recubierta de 6 pocillos con 1,5 mL de medio de células madre por pocillo.
    4. Cultive el hiPSC durante 2-3 días en condiciones estándar.
  2. Una vez que las colonias de hiPSC hayan alcanzado aproximadamente 1,5 mm de diámetro, vuelva a separar todas las colonias con 1 mg/mL de colagenasa incubando durante un máximo de 1 h a 37 °C.
    1. Detenga la enzima con 6 mL de medio prosencéfalo 115 y recoja las colonias desprendidas en un tubo cónico de 15 mL utilizando puntas de diámetro ancho.
    2. Una vez que las colonias se hayan asentado, retire el medio viejo y lave con 5 mL de medio prosencéfalo 1.
    3. Finalmente, transfiera las colonias a una placa de 6 pocillos de fijación ultra baja que contenga 3 mL de medio prosencéfalo 1 por pocillo con puntas de diámetro ancho y deje que formen cuerpos embrioides (EB). Este paso indica el día 0 del protocolo de organoides corticales humanos. A partir de aquí, siga el protocolo publicado15.
  3. El día 7, incrustar las EB en una matriz de membrana basal, con alrededor de 20 EB por "galleta" y cultivar durante 1 semana en medio prosencéfalo 2 15. En el día 14, libere mecánicamente los organoides de la matriz y continúe el cultivo en placas de fijación ultra bajas de 6 pocillos en el medio prosencéfalo 315 en un agitador orbital a 120 rpm.
  4. A partir del día 35, se suplementa al medio una matriz de membrana basal al 1% v/v.
  5. En la semana 6, incruste los organoides en agarosa al 3% de bajo punto de fusión y córtelos en un vibratomo en rodajas de 500 μm de grosor (Figura 2A, B), que apoya el suministro de oxígeno y nutrientes a través de los organoides. Si es necesario, repita el corte de organoides cada 4 semanas.
  6. A partir del día 70, se cultivan organoides en medio prosencéfalo 415.

7. Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas

NOTA: Los organoides corticales humanos pueden inyectarse y electroporarse tan pronto como las estructuras similares a los ventrículos sean visibles, aproximadamente a partir de la semana 2. Para los organoides en etapas posteriores (semana 5 y mayores), la electroporación es más eficiente y la viabilidad de las células es mejor cuando el procedimiento se realiza 2 días después del corte de los organoides26,55. Después del corte, las estructuras similares a los ventrículos son fáciles de identificar, lo que ayuda al procedimiento de inyección (Figura 2C, D). Además, las estructuras similares a los ventrículos permanecen parcialmente abiertas durante algún tiempo después del corte, lo que permite que escape el exceso de solución inyectable, lo que protege la integridad del cinturón de unión adherente que recubre los ventrículos. La programación de segmentación se puede cambiar para que coincida con la línea de tiempo experimental. El corte debe repetirse cada 3-4 semanas para cultivos a largo plazo.

  1. Tire de los capilares de vidrio de borosilicato para inyecciones en un extractor de microcapilares con los siguientes ajustes: P 500, calor 600, tracción 30, velocidad 40, tiempo 1. Guarde los capilares en una placa de Petri grande con cinta adhesiva para la fijación.
  2. El día de la electroporación, prepare el complejo CRISPRR/Cas9 RNP como se describe en el paso 5.4 con una concentración final de 24 μM RNP. La coelectroporación de 0,1 μg/μL de plásmido pCAG-GFP (o de cualquier otro indicador fluorescente) apoya la identificación de células electroporadas. Además, agregue una solución Fast Green al 0,1% en agua a la mezcla de inyección final, lo que permite confirmar la entrega exitosa de la mezcla.
    NOTA: Realice mezclas separadas para cada gen de interés y el control gLACZ .
  3. Precalentar la solución de Tyrode (un paquete de sal de Tyrode, 1 g de NaHCO3, 13 mL de 1 M HEPES pH 7,25 en 1 L de dH2O) a 37 °C. Almacene el resto de la solución de Tyrode a 4 °C durante varios meses.
  4. Seleccione hCO con estructuras ventricles bien desarrolladas (Figura 2E) y descarte cualquier organoide que no muestre estructuras similares a ventrículos (Figura 2F). Transfiera hasta 10 organoides a una placa de Petri de 6 cm que contenga la solución de Tyrode y mantenga los hCOs restantes en la incubadora.
  5. Llene un microcapilar de vidrio con 10 μL de la solución inyectable con la ayuda de una punta de pipeta de microcargador y abra el capilar pellizcando el extremo delgado con pinzas. Compruebe si el capilar está abierto liberando un poco de mezcla de inyección en la solución del Tyrode. Realice las inyecciones con un microinyector en un ajuste continuo con compuerta controlada a través de un interruptor de pie.
  6. Inserte el capilar en el centro de las estructuras similares a los ventrículos (Figura 2C) e inyecte 0,2-0,5 μL de la mezcla presionando el interruptor de pie.
    NOTA: Se pueden inyectar hasta 5 ventrículos por hCO con un total de 7-8 hCOs procesados por réplica. Idealmente, los ventrículos que miran hacia el exterior del hCO deben ser atacados, ya que estos son generalmente los mejor desarrollados (Figura 2G, H).
  7. Use pinzas finas para empujar el organoide y restringir el movimiento. En realidad, no agarre los organoides (Figura 2C).
  8. Después de la inyección, utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para transferir 1-2 organoides a una cámara de electroporación que contenga la solución de Tyrode (Figura 2C, D).
  9. Oriente los organoides inyectados hacia los electrodos de modo que se dirija la glía radial apical en las regiones similares a los ventrículos que miran hacia el exterior del organoide.
  10. Conecte los cables a la cámara de electroporación con el lado inyectado del organoide hacia el polo positivo (ánodo; Figura 2D).
  11. Presione el botón de pulso de la máquina electroporadora para electroporatar con cinco impulsos de 38 V durante 50 ms cada uno a intervalos de 1 s.
    NOTA: Los ajustes de electroporación pueden depender del electroporador disponible y es posible que deban optimizarse.
  12. Repita los pasos de inyección y electroporación hasta que se procese el número deseado de organoides.
  13. Recoja los organoides electroporados en un medio a RT hasta que se hayan procesado todas las muestras para la misma condición. Asegúrese de que no estén fuera de la incubadora durante más de 30 minutos en total.
  14. A continuación, devuelva los hCOs electroporados al medio de cultivo adecuado y cultívelos sin agitar durante las primeras 24 h.
    NOTA: Después de 2-3 días, la señal GFP debe ser visible en hCOs electroporados bajo un estereoscopio fluorescente (Figura 2H). El punto de tiempo del análisis después de la electroporación debe elegirse en función de la pregunta biológica a responder. Después de 3-7 días, las células GFP positivas se localizan en VZ, SVZ y CP15,60.

8. Fijación y criosección de organoides corticales humanos electroporados

  1. Fijar organoides electroporados en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 30 min en RT en un tubo de reacción de 2 mL.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y cancerígeno. Realice cualquier paso que involucre PFA debajo de una campana extractora. Se recomienda encarecidamente el uso de guantes de nitrilo y gafas de seguridad.
  2. Lavar una vez en PBS durante 5 min y almacenar en sacarosa al 30% en PBS filtrada estérilmente a 4 °C hasta que el tejido esté completamente saturado de sacarosa.
  3. Incruste organoides fijos en un medio de inclusión para muestras de tejido congelado más un 15% de sacarosa en PBS en bloques sobre hielo seco.
  4. Preparar secciones de 20-30 μm en un criostato y recoger el tejido en portaobjetos adhesivos 26,64.
    NOTA: El protocolo puede pausarse una vez que los organoides fijados estén en sacarosa (estable a 4 °C durante varios meses) o incrustado en un medio de inclusión (los bloques congelados pueden almacenarse en bolsas herméticas a -20 °C durante varios meses o años).

9. Análisis inmunohistoquímico de organoides corticales humanos electroporados

  1. Para el análisis inmunohistoquímico26,64, realizar la recuperación de antígenos en tampón de citrato (10 mM de citrato de sodio, 0,05% de polisorbato 20 en dH2O, pH 6,0) durante 1 h a 70 °C en baño de agua.
  2. Lavar una vez en PBS durante 5 minutos, luego secar brevemente los portaobjetos y rodear las secciones con un bolígrafo de cera.
  3. Apagar con glicina 0,1 M en PBS (pH 7,4) durante 30 min a RT y posteriormente lavar dos veces con PBS durante 5 min cada una.
  4. Cubrir las secciones con tampón bloqueante (10% de suero de caballo, 0,1% de Octoxinol 9 en PBS) e incubar durante 30 min en RT.
  5. Preparar los anticuerpos primarios en tampón de bloqueo e incubar en secciones durante la noche a 4 °C.
  6. Al día siguiente, lavar tres veces con PBS durante 5 min cada una, incubar con anticuerpos secundarios y DAPI en tampón de bloqueo durante 1 h en RT, y lavar tres veces de nuevo con PBS durante 5 min cada una.
  7. Monte los portaobjetos en el medio de montaje y obtenga la imagen en un microscopio fluorescente (Figura 3).
    NOTA: Se recomienda incluir un anticuerpo contra el fluoróforo utilizado en la mezcla de inyección para identificar las células objetivo, ya que la señal nativa a menudo se apaga después de la fijación. Los anticuerpos y colorantes utilizados para la tinción de inmunofluorescencia, como se representa en la Figura 3, se enumeran en la Tabla 1.

10. Verificación de la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 a nivel de proteínas

  1. Para verificar el knockout a nivel de proteína, se debe realizar inmunohistoquímica para la proteína diana en los organoides electroporados (Figura 3I).
  2. Tome imágenes tanto del control gLACZ como de los organoides objetivo utilizando los mismos ajustes para permitir la comparación de la intensidad de fluorescencia (Figura 3I, J). Haga esto de una manera específica de la zona para comparar el efecto en los diferentes tipos de células del neocórtex en desarrollo. Cuente las celdas en ImageJ/Fiji (plugin Cell Counter) o segmentando usando el pluginStarDist 65.

Resultados

La ablación génica mediada por CRISPR/Cas9 requiere el diseño de ARNg. En general, dirigirse a uno de los primeros exones de un gen de interés con un par de ARNg espaciados entre 7 y 11 pb (evitando múltiplos de 3 pb) funciona bien (Figura 1A). Como primera prueba, la eficiencia del reconocimiento de plantillas por parte de los ARNg puede ser interrogada in vitro utilizando una plantilla de PCR 26,40,62. La focalización eficiente y el corte mediado por Cas9 son visibles en la reducción del ADN molde y la aparición de productos de ADN escindidos en un gel de agarosa (Figura 1B). Se pueden realizar más pruebas de ARNg en la línea iPSC que se utiliza para la generación de organoides corticales. Esto requiere la nucleofección de iPSCs, que se puede visualizar mediante la expresión exitosa de un reportero fluorescente (Figura 1C). La focalización eficiente del locus de interés puede verificarse mediante la secuenciación de Sanger, lo que da como resultado un cromatograma que termina abruptamente o se superpone alrededor del sitio de focalización (Figura 1D), como resultado de un espectro de indels de la reparación de rotura de doble cadena por unión de extremos no homólogos66. Las pruebas de eficiencia del ARN guía in vitro y en células iPSC ayudan a la selección de pares de ARNg eficientes para la ablación de genes en organoides corticales.

Antes de la electroporación, se cortan los organoides corticales, lo que apoya la identificación de los lúmenes de los ventrículos para la inyección de la mezcla de electroporación (Figura 2A-C). A continuación, los organoides inyectados se transfieren a la cámara de electroporación (Figura 2D). Para la electroporación, se deben utilizar organoides corticales con estructuras ventricles bien desarrolladas (Figura 2E), mientras que los organoides corticales que carecen de estructuras visibles deben descartarse (Figura 2F). La mezcla de electroporación contiene un tinte que permite la visualización de los ventrículos inyectados durante el procedimiento (Figura 2G). Después de 1-3 días en cultivo, los ventrículos dirigidos con éxito son visibles por la señal GFP nativa bajo un microscopio fluorescente (Figura 2H).

Para el análisis histológico en profundidad, se puede realizar la inmunohistoquímica de las criosecciones. Idealmente, múltiples ventrículos dirigidos están presentes dentro de un organoide cortical electroporado (Figura 3A,B). Las electroporaciones más óptimas se dirigen a estructuras similares a ventrículos en la región externa del organoide que mira hacia el exterior (Figura 3C), ya que estos suelen ser los ventrículos más expandidos. En algunos casos, la electroporación puede conducir a una muerte celular excesiva (Figura 3D, E), por ejemplo, cuando las concentraciones de plásmidos son demasiado altas o los ajustes de electroporación no son óptimos. Las electroporaciones que miran hacia el interior del organoide (Figura 3F) a menudo involucran regiones menos expandidas de las estructuras similares a ventrículos en comparación con el exterior. En nuestra experiencia, es útil centrar el análisis cuantitativo en regiones definidas del organoide para reducir la variabilidad. A veces, la electroporación puede causar alteración de la superficie apical (Figura 3G), por ejemplo, cuando el volumen de inyección es demasiado alto, lo que provoca la ruptura de los ventrículos, o cuando los pulsos eléctricos son demasiado fuertes, lo que provoca la delaminación de las células. Por último, cuando se dirigen dos ventrículos adyacentes (Figura 3H), puede resultar difícil asignar los límites de las zonas corticales y el origen de las células objetivo.

La inmunohistoquímica puede utilizarse para verificar el éxito de la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 a nivel de proteína en células de interés (Figura 3I), ejemplificada aquí dirigiéndose a la proteína PCGF467 del Complejo Represivo Polycomb 1 (PRC1). La intensidad de la señal puede analizarse en células positivas para GFP en condiciones de control frente a experimentales (Figura 3J). Alternativamente, si no se dispone de un anticuerpo adecuado, las células diana pueden aislarse mediante FACS a partir de organoides corticales60 y analizarse posteriormente mediante Sanger o Next Generation Sequencing36. Además, la reducción de los niveles de proteínas también puede analizarse mediante Western blot.

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Figura 1: Diseño y validación de ARN guía para el knockout agudo de genes mediado por CRISPR/Cas9. (A) Ilustración esquemática de la estrategia de diseño de ARN guía (ARNg), con dos ARNg dirigidos a un exón de un gen de interés. Las flechas negras indican los cebadores de PCR para la preparación de plantillas utilizados para la validación de ARNg. (B) Validación de la eficiencia del ARNg in vitro. Las plantillas amplificadas por PCR se digierieron con complejos RNP. Tras una escisión exitosa, dos bandas de diferentes tamaños son visibles después de la electroforesis en gel (izquierda), mientras que la plantilla permanece sin cortar para los ARNg de baja eficiencia (derecha). (C) Imagen de campo claro (izquierda), fluorescencia GFP (centro) e imágenes fusionadas (derecha) de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) 3 días después de la nucleofección con el complejo RNP y un plásmido GFP. Barras de escala: 350 μm. (D) Validación de la eficiencia del ARNg en hiPSCs mediante secuenciación de Sanger de ADN amplificado de células GFP positivas. Tras la escisión exitosa del ADN bicatenario, las pistas de secuenciación muestran señales superpuestas a partir del sitio objetivo del ARNg (arriba, KO1). En el caso de una selección infructuosa, el seguimiento de la secuencia de ADN permanece sin cambios (abajo, KO2) en comparación con el control LACZ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas. (A) Ilustración esquemática que muestra el flujo de trabajo para la electroporación de organoides corticales humanos (hCOs). En primer lugar, los hCO se dividen en rodajas de 500 μm de grosor. Dos días después, la mezcla de RNP que contiene un plásmido de expresión de GFP y Fast Green se inyecta en los lúmenes de las estructuras similares a los ventrículos, preferentemente en la región externa de los hCO. Para la electroporación, los hCOs se colocan en la cámara de electroporación. Después de varios días de cultivo, se puede detectar una señal GFP en áreas electroporadas. (B) Imágenes del corte en vibratomo de los hCOs. Los organoides están incrustados en agarosa de bajo punto de fusión al 3% en un medio en un bloque (izquierda). El bloque se secciona en rodajas de 500 μm de grosor (centro). Los organoides cortados en rodajas se transfieren de nuevo a la placa de cultivo con una punta de pipeta de diámetro ancho (derecha). (C) Imágenes que muestran la inyección de la mezcla que contiene RNP, pCAG-GFP y 0.1% Fast Green en estructuras ventrículas de los organoides. Los organoides se sumergen en la solución de Tyrode y el capilar de vidrio delgado se inserta en la luz del centro de las estructuras similares a ventrículos (izquierda). Se utilizan pinzas para estabilizar los organoides (izquierdo y medio). Los ventrículos en el exterior de los organoides son dirigidos (centro). Los organoides inyectados se transfieren a la cámara de electroporación, o posteriormente a la placa de cultivo, con puntas de pipeta de diámetro ancho (derecha). (D) Imágenes de la cámara de electroporación, que está formada por una placa de Petri de vidrio y dos cuchillas de metal que están pegadas al vidrio. Las cuchillas metálicas sirven como electrodos y contienen orificios para sujetar los cables que se conectan al electroporador. El lado inyectado del hCO, visible a través de una sombra verde, debe mirar hacia el ánodo (polo positivo, cable rojo) (derecha). (E) Imágenes representativas de hCOs que muestran estructuras ventrículas bien desarrolladas. El anillo más claro representa el área similar a la zona ventricular. El círculo más oscuro en el centro de la estructura similar a un ventrículo representa la luz y debe ser el objetivo de la inyección. (F) Imágenes representativas de hCOs que carecen de estructuras similares a ventrículos bien desarrolladas, que recomendamos no incluir para futuros experimentos. (G) Imágenes representativas de hCOs después de la inyección de la mezcla de electroporación, en las que las áreas objetivo son visibles por Fast Green (flechas naranjas). (H) Imagen representativa de hCO que muestra la señal GFP nativa 24 h después de la electroporación. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Análisis inmunohistoquímico de organoides corticales humanos electroporados en rodajas. (A) Esquema que representa un organoide cortical humano electroporado (hCO) con señal fluorescente verde. (B) Tinción de DAPI (gris) e inmunofluorescencia para GFP (verde) de un hCO crioseccionado con múltiples ventrículos electroporados, 7 días después de la electroporación. (C-H) Imágenes de ejemplo de diferentes resultados de electroporación, teñidas para GFP (verde) y núcleos (DAPI, gris). (C) Una electroporación óptima con núcleos intactos (ver inserto 1, D), una estructura similar a un ventrículo ininterrumpida y células electroporadas en el área que mira hacia el exterior del organoide, que generalmente está más expandida. (E) Ejemplo de hCO que muestra muerte celular masiva en el área electroporada (véase también el inserto 2, D), caracterizado por núcleos pequeños, densos en DAPI y distorsionados. (F) Una electroporación exitosa dirigida hacia el interior del organoide, que a menudo es más difícil de interpretar debido a las áreas en forma de placas corticales que se fusionan con los ventrículos adyacentes. (G) Estructuras similares a ventrículos alteradas en el centro del área electroporada (flecha naranja). (H) Un ejemplo de hCO que contiene múltiples ventrículos más pequeños que están parcialmente fusionados y, por lo tanto, son difíciles de cuantificar. (I) Tinción de DAPI (gris) e inmunofluorescencia para GFP (verde) y PCGF4 (magenta) 7 días después de la electroporación de un complejo RNP dirigido a LACZ (gLACZ KO, izquierda) o PCGF4 (gPCGF4 KO, derecha) para el knockout mediado por CRISPR/Cas9. Las células encerradas en un círculo resaltan la intensidad reducida de PCGF4, lo que indica una ablación génica exitosa. Se puede ver una señal uniforme en el control LACZ (izquierda). (J) El gráfico muestra la intensidad cuantificada de PCGF4 después de la inmunofluorescencia en células GFP positivas para el control (gLACZ KO) y el KO de PCGF4 (gPCGF4 KO) en relación con la expresión media de PCGF4 en la condición gLACZ. Cada punto representa una celda. Datos de 3-4 organoides de dos lotes diferentes (gris y negro) de la misma línea hiPSC. p < 0,0001, prueba de Mann-Whitney. Todas las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal (B, C) o fluorescente (E-I) de barrido láser. Las imágenes representan proyecciones de máxima intensidad de pilas z de 10-15 μm de grosor. Las líneas discontinuas blancas indican la superficie apical frente a la luz del ventrículo y las superficies externas de los hCO. Las líneas discontinuas de color naranja indican el borde VZ/SVZ en los ventrículos fusionados. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Anticuerpo/TinteDilución
Pollo anti-GFP1:2,000
Ratón anti-PCGF41:300
Alexa Fluor 488 Burro Anti-Pollo1:1,000
Alexa Fluor 555 Burro Anti-Conejo1:1,000
DAPI1 mg/mL de caldo; 1:1,000

Tabla 1: Lista de anticuerpos y colorantes y su dilución utilizados para la tinción con inmunofluorescencia.

Discusión

Los organoides cerebrales y corticales humanos se han convertido en modelos clave para investigar el desarrollo del neocórtex humano 7,16,17. Para el modelado de trastornos humanos, las líneas isogénicas de hiPSC y los organoides se han convertido en el estándar de oro68. Sin embargo, dado que la generación de nuevas líneas de iPSC requiere mucho tiempo y es costosa, se ha aplicado ampliamente la manipulación aguda de modelos de organoides corticales para estudios de la función de los genes.

La electroporación de organoides cerebrales y corticales 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 es fácil de implementar, y muchos laboratorios que tradicionalmente han utilizado modelos animales para estudios funcionales están equipados con las herramientas necesarias. Para la inyección in vivo, los ventrículos laterales suelen ser dirigidos 34,36,37,39,40,41,42. Estos se modelan en organoides corticales mediante estructuras similares a ventrículos con una luz central que también se puede inyectar. La electroporación de los organoides corticales se dirige principalmente a las patas terminales de las células que recubren los ventrículos, típicamente la glía radial apical69. La eficiencia de la focalización varía entre los experimentos, pero por lo general, se pueden obtener unas pocas células positivas para GFP por organoide después de 3 a 7 días de electroporación. La duración del ciclo celular en las células progenitoras neurales humanas es aproximadamente el doble en comparación con el ratón, donde la glía radial apical tiene una duración de ciclo celular de 14 h y las células progenitoras basales de 23 h70. Por lo tanto, después de 3 días, principalmente la glía radial apical y las células progenitoras intermedias son GFP positivas, mientras que las células GFP positivas se distribuyen en todas las zonas después de 7 días. La señal de GFP todavía se puede observar varios meses después de la electroporación, y las células positivas para GFP representan principalmente neuronas que están dispersas por todo el organoide, lo que nos permite analizar la morfología de las células individuales. Es factible dirigirse a las células progenitoras neurales que recubren el ventrículo durante las etapas en las que las regiones similares a los ventrículos son identificables bajo el microscopio de campo claro. En el protocolo actual15, esto es posible desde la semana 2 hasta la semana 12 de desarrollo de organoides corticales, después de lo cual los ventrículos se encogen y ya no son visibles. Para un experimentador experimentado, es factible inyectar de 50 a 80 organoides en una sesión.

Si bien la progenie de la glía radial apical hereda reactivos de manipulación génica durante la división celular, la focalización directa de células maduras, como neuronas y astrocitos, no es factible con el enfoque de electroporación estándar. En cambio, se han aplicado métodos de diana viral a células postmitóticas en el sistema nervioso33,71. En particular, los virus adenoasociados recombinantes (AAV) son ampliamente utilizados para la transferencia de genes en el sistema nervioso, ya que son fáciles de producir y transducir células terminalmente diferenciadas con alta eficiencia71. Además, los AAV pueden dirigirse a subpoblaciones neuronales específicas. Ya se han aplicado diferentes enfoques de focalización viral, incluyendo el uso de adeno, Sendai y lentivirus, en organoides cerebrales y corticales 15,25,29,30,32,47,72,73,74.

Una limitación en los protocolos de organoides cerebrales es el desarrollo de un núcleo necrótico debido al suministro limitado de oxígeno y nutrientes. Se han implementado varias estrategias para mejorar la viabilidad celular en el centro de organoides, incluyendo el cultivo de organoides en biorreactores giratorios14,54, el cocultivo de células endoteliales o enfoques de bioingeniería para modelar la vascularización75,76, el trasplante de organoides en modelos de roedores18,77 y el corte de organoides15,47. Aquí, hemos utilizado el protocolo de organoides corticales humanos cortados, que se demostró que muestra una hipoxia reducida en el núcleo del organoide y apoya la expansión de las estructuras similares a ventrículos y la región similar a la placa cortical15. Además, el corte de los organoides cerebrales también es beneficioso para la obtención de imágenes en vivo de la glía radial basal, que se encuentra en la zona subventricular, lo que permite la generación de mapas de decisión del destino celular72. Del mismo modo, se utilizaron imágenes en vivo para estudiar organoides cerebrales cortados cultivados en la interfaz aire-líquido, lo que apoya la supervivencia neuronal y el crecimiento axonal47. Descubrimos que el corte de organoides corticales humanos también hace que estos modelos de organoides sean particularmente susceptibles a la electroporación, ya que las estructuras similares a los ventrículos se pueden identificar fácilmente después del corte. La electroporación de organoides corticales permite la introducción de plásmidos de ADN, utilizados clásicamente para la sobreexpresión de genes y, más recientemente, para la entrega de bibliotecas completas de plásmidos55, y de herramientas de edición génica CRISPR/Cas9 para la inactivación de la función génica26.

La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la investigación de la función de los genes 56,57,58,63,66. En este protocolo, hemos descrito la aplicación de los complejos de ribonucleoproteínas gRNA/Cas936 para la inactivación aguda de genes en organoides corticales humanos. La validación inicial de la eficiencia del ARNg se realizó in vitro, primero en un tubo de ensayo y segundo en iPSCs. Descubrimos que estas pruebas iniciales sencillas ayudan a la selección de pares de ARNg prometedores, particularmente en ausencia de anticuerpos funcionales. A medida que se caractericen más y más herramientas para la eliminación de genes mediada por CRISPR/Cas9, es posible que se omitan los pasos iniciales de validación en el futuro. Si bien la secuenciación de próxima generación de regiones de ADN objetivo aisladas de iPSC es más cuantitativa y tiene un mayor contenido de información, descubrimos que la secuenciación de Sanger a menudo puede ofrecer resultados mucho más rápidos durante la preselección de ARNg. En última instancia, la validación de la edición eficiente de CRISPR/Cas9 en organoides corticales y la reducción de los niveles de proteínas en las células de interés es la prueba más definitiva del éxito de la ablación génica mediada por CRISPR/Cas9.

La electroporación de organoides corticales humanos cortados permite la manipulación genética aguda para estudios de ganancia y pérdida de función, la visualización de la morfología celular y los axones neuronales, la entrega de bibliotecas de plásmidos para enfoques de cribado y ensayos de reporteros paralelos masivos, el etiquetado de células para imágenes en vivo y la entrega de herramientas de edición del epigenoma. Como tal, la electroporación de organoides corticales humanos en rodajas es un método poderoso que puede revelar conocimientos mecanicistas sobre el desarrollo cortical humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución cortical.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a las instalaciones de los socios de CRTD y Dresden Concept por el excelente apoyo brindado, en particular a K. Neumann y su equipo en el Centro de Ingeniería de Células Madre, H. Hartmann y su equipo en el Centro de Microscopía Óptica, A. Gompf y su equipo en el Centro de Citometría de Flujo y Hartmut Wolf del taller MPI-CBG para la construcción de las cámaras de electroporación. Agradecemos a Joshua Schmidt por sus comentarios sobre el manuscrito. MA agradece la financiación del Centro de Terapias Regenerativas de la Universidad Técnica de Dresde, la DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) y la Fundación Schram.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de centrífuga PP de 15 mL, cónicosUnidad central Corning430791
4D-NucleofectorUnidad Lonza
4D-Nucleofector XTubo
de fondo redondo de poliestireno de 5 mL con tapa de filtro de celdaspocillosCorning Falcon 352235
tratada con nunclonThermo Fisher140675para hiPSC Placa de cultivo
de 6 pocillos, fijación ultra bajaCorning3471Para cultivo de organoides
A83-01STEMCELL Technologies72022Medio de prosencéfalo 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Compresor de aireAerotec
Alexa Fluor 488 Burro Anti-Pollo IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155Anticuerpo secundario, RRID: AB_2340375; dilución 1:1000
Alexa Fluor 555 Burro Anti-Conejo IgG (H+L)InvitrogenA-31572Anticuerpo secundario, RRID: AB_162543; dilución 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolTecnologías de ADN integradasDiseño personalizado (pedido como 2 nmol)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNATecnologías de ADN integradas10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Tecnologías de ADN integradas1081060100 y micro; g, de Streptococcus pyogenes
Anfotericina B (Fungizone)Gibco15290018Medio del prosencéfalo 2, 3 y 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Anticuerpo primario anti-GFP (pollo, policlonal)Abcamab13970RRID: AB_300798; dilución 1:2000
Anticuerpo primario anti-PCGF4 (ratón, monoclonal)Millipore05-637 RRID: AB_309865; dilución 1:300
Microscopio fluorescente ApoTomeZeiss
Ácido ascórbicoSigma Aldrich1043003Medio prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-suplemento (+ vitamina A)Gibco17504044Medio prosencéfalo 3, 4    (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Kit de cable de plátano a microagarradorAparato Harvard BTX45-0216
Biometra TRIO-Termociclador (máquina de PCR)Analytik Jena846-2-070-723
Capilares, vidrio de borosilicato con filamento, diámetro exterior 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm de longitudScience ProductsBF120-69-10Necesita ser estirado hasta un grosor específico
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Medio de prosencéfalo 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Colagenasa tipo IVGibco17104019
CRTDi004-APlanta de ingeniería de células madre en CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-ALínea hiPSC adaptada a una sola célula del donante
sano DAPIRoche 102362760011 mg/mL de stock, uso diluido 1:1000 para
IF Dibutiril-cAMPSTEMCELL Technologies73884Medio del prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Medio de prosencéfalo 1, 2 y 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Medio de prosencéfalo 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Pinzas, rectas, 11 cmFine Science Tools11295-51
ECM 830 Sistema de electroporación de onda cuadradaHarvard Apparatus BTX45-2052
EtanolSigma Aldrich32205-1L-M
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
Fast Green FCFSigmaAldrich F7252
FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Tirador de micropipetas Flaming/BrownSutter Instrument Co.P-97Para la extracción de microcapilares
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware versión 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleótidos subrayados = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Medio prosencéfalo 1, 2, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1este documento5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corresponde a las imágenes KO en la Figura 3I+J)
gPCGF4 KO2este documento5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corresponde al KO imágenes en la Figura 3I + J)
HEPEShecho en casa1 M stock
Horse Serum, Gibco 26050088
inactivado por calor Proteína recombinante GDNF humanaThermo Fisher450-10Medio de prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Humano/Ratón/Rata BDNF Proteína RecombinanteThermo Fisher450-02Medio de prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Ácido clorhídrico (HCl)Sigma Aldrich258148Para hacer TrisHCl
ImmEdge (cera)Pluma Vector LaboraoriesH-4000
Solución de insulina humanaSigma Aldrich  I9278Medio del prosencéfalo 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Suero Knockout ReemplazoGibco 10828-010Medio prosencéfalo 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Laser Scanning Microscopio confocal 980Agarosa de
, ultrapuraThermo Fisher16520100para la inclusión de hCOs durante el seccionamiento por vibratomo
Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal, sin LDEVCorning354230Para el cultivo
de organoidesMatrigel Matriz con calificación hESC, sin LDEV354277Corning para cultivo hiPSC
MgCl2, 1 MThermo FisherAM9530G
PicoPump + Interruptor de pieWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Microloader Puntas de pipeta 0.5 a 20 &; LEppendorf5242956003Para la carga de capilares de vidrio
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850Medio de células madre
N-2 suplementoGibco17502048Medio de prosencéfalo 2 y 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix New England BiolabsM0541S
Cámara de recuento NeubauerMarca718605
Medio neurobasalGibco21103049Medio prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Aminoácidos no esencialesGibco 11140050Medio de prosencéfalo 1, 2, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
tampón dúplex sin nucleasasTecnologías de ADN integradas1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583Medio de inclusión para muestras de tejido congelado
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
ParaformaldehídoFisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Peel-A-Way Molde de inclusión truncadoT12Polysciences Inc.18986-1Para la inclusión de hCOs para vibratomo y crioseccionamiento
penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) Gibco15140122Prosencéfalo medio 1, 2, 3 y 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 y para medio de células madre después de la nucleofección
Placa de Petri 60 mm x 15 mm, sin ventilación, estérilCorningBP50-02
Petri Cámara de electrodos de platino, espacio de 5 mmHarvard Apparatus BTX45-0504
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)hecha en casa
Proteinasa KSigma AldrichP2308De Titrachium album; 10 mg/mL stock
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
Inhibidor de la vía RHO/ROCK (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Medio prosencéfalo 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Citrato de sodio dihidratadoSigma AldrichW302600-1KG-K
Dodecil sulfato de sodio (SDS)Sigma AldrichL3771
Sacarosa Sigma AldrichS7903
SuperFrost Plus correderas de adherenciaFisher Scientific10149870
SZX10 con un KL 300 LEDOlympusSZX10O estereoscopio alternativo
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284a.k.a. Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503Para hacer TrisHCl
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021Disociation enzmye para hacer suspensiones unicelulares
Tween 20Sigma AldrichP1379a.k.a. Polisorbato 20
Sal de TiroSigma AldrichT2145-10x1l
Vibrador Microtomo (vibrátomo)LeicaVT1200 S
Wide-Bore 1000 µ L Puntas de filtro de ajuste universalCorningTF-1005-WB-R-S
β-MercaptoethanolGibco 21985-023Medio prosencéfalo 1, 3 y 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Placa de 6 , Suero fetal bovino (FBS) ( bajo punto de fusión Zeiss Microinyector de Placa de

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