Aquí, presentamos la manipulación genética aguda de organoides corticales humanos cortados en rodajas por electroporación. Estos modelos de organoides corticales son particularmente susceptibles a la inyección, ya que las estructuras similares a los ventrículos se pueden identificar fácilmente después del corte, lo que permite la investigación funcional del desarrollo cortical humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución cortical.
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Artículo de método
Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica
En este artículo
Resumen
Resumen
Los organoides corticales humanos se han convertido en herramientas importantes para estudiar el desarrollo del cerebro humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución del cerebro humano. Los estudios que analizan la función génica por sobreexpresión o knockout han sido fundamentales en modelos animales para proporcionar información mecanicista sobre la regulación del desarrollo del neocórtex. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la eliminación aguda de genes mediada por CRISPR/Cas9 por electroporación de organoides corticales humanos cortados. El corte de organoides corticales ayuda a la identificación de estructuras similares a ventrículos para la inyección y la posterior electroporación, lo que lo convierte en un modelo particularmente adecuado para la manipulación genética aguda durante el desarrollo cortical humano. Describimos el diseño de RNAs guía y la validación de la eficiencia de focalización in vitro y en organoides corticales. La electroporación de los organoides corticales se realiza en las etapas neurogénicas medias, lo que permite dirigirse a la mayoría de las principales clases de células en el neocórtex en desarrollo, incluida la glía radial apical, las células progenitoras basales y las neuronas. En conjunto, la electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas representa una técnica poderosa para investigar la función de los genes, la regulación de los genes y la morfología celular durante el desarrollo cortical.
Introducción
El neocórtex se refiere a la cubierta externa de los hemisferios cerebrales y es una estructura exclusiva de los mamíferos. El neocórtex representa la sede de las funciones cognitivas superiores 1,2,3,4,5. Durante el desarrollo, las células madre neurales y progenitoras dan lugar a neuronas en un proceso denominado neurogénesis. Los estudios funcionales que investigan el desarrollo del neocórtex humano proporcionan la base para dilucidar los mecanismos que subyacen a la reg....
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Protocolo
Todos los experimentos con células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) se realizaron de acuerdo con las normas éticas descritas en la Declaración de Helsinki de 1964 y aprobadas por el Comité de Revisión Ética del Hospital Universitario de Dresde (IRB00001473; IORG0001076; número de aprobación ética SR-EK-456092021).
1. Diseño de ARN guía para la eliminación aguda de genes mediada por CRISPR/Cas9
- Diseñar un par de ARN guía (ARNg) dirigidos al mismo exón con una distancia idealmente de 7-11 pb (evitando múltiplos de 3 pb) entre los motivos adyacentes del protoespaciador....
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Resultados
La ablación génica mediada por CRISPR/Cas9 requiere el diseño de ARNg. En general, dirigirse a uno de los primeros exones de un gen de interés con un par de ARNg espaciados entre 7 y 11 pb (evitando múltiplos de 3 pb) funciona bien (Figura 1A). Como primera prueba, la eficiencia del reconocimiento de plantillas por parte de los ARNg puede ser interrogada in vitro utilizando una plantilla de PCR 26,40,62.
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Discusión
Los organoides cerebrales y corticales humanos se han convertido en modelos clave para investigar el desarrollo del neocórtex humano 7,16,17. Para el modelado de trastornos humanos, las líneas isogénicas de hiPSC y los organoides se han convertido en el estándar de oro68. Sin embargo, dado que la generación de nuevas líneas de iPSC requiere mucho tiempo y es costosa, se h.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a las instalaciones de los socios de CRTD y Dresden Concept por el excelente apoyo brindado, en particular a K. Neumann y su equipo en el Centro de Ingeniería de Células Madre, H. Hartmann y su equipo en el Centro de Microscopía Óptica, A. Gompf y su equipo en el Centro de Citometría de Flujo y Hartmut Wolf del taller MPI-CBG para la construcción de las cámaras de electroporación. Agradecemos a Joshua Schmidt por sus comentarios sobre el manuscrito. MA agradece la financiación del Centro de Terapias Regenerativas de la Universidad Técnica de Dresde, la DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) y la Fundación Schram.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de centrífuga PP de 15 mL, cónicos | Unidad central Corning | 430791 | |
| 4D-Nucleofector | Unidad Lonza | ||
| 4D-Nucleofector X | Tubo | ||
| de fondo redondo de poliestireno de 5 mL con tapa de filtro de celdas | pocillos | Corning Falcon 352235 | |
| tratada con nunclon | Thermo Fisher | 140675 | para hiPSC Placa de cultivo |
| de 6 pocillos, fijación ultra baja | Corning | 3471 | Para cultivo de organoides |
| A83-01 | STEMCELL Technologies | 72022 | Medio de prosencéfalo 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Compresor de aire | Aerotec | ||
| Alexa Fluor 488 Burro Anti-Pollo IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immuno Research | 703-545-155 | Anticuerpo secundario, RRID: AB_2340375; dilución 1:1000 |
| Alexa Fluor 555 Burro Anti-Conejo IgG (H+L) | Invitrogen | A-31572 | Anticuerpo secundario, RRID: AB_162543; dilución 1:1000 |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol | Tecnologías de ADN integradas | Diseño personalizado (pedido como 2 nmol) | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | Tecnologías de ADN integradas | 1072532 | 5 nmol |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Tecnologías de ADN integradas | 1081060 | 100 y micro; g, de Streptococcus pyogenes |
| Anfotericina B (Fungizone) | Gibco | 15290018 | Medio del prosencéfalo 2, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Anticuerpo primario anti-GFP (pollo, policlonal) | Abcam | ab13970 | RRID: AB_300798; dilución 1:2000 |
| Anticuerpo primario anti-PCGF4 (ratón, monoclonal) | Millipore | 05-637 | RRID: AB_309865; dilución 1:300 |
| Microscopio fluorescente ApoTome | Zeiss | ||
| Ácido ascórbico | Sigma Aldrich | 1043003 | Medio prosencéfalo 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| B27-suplemento (+ vitamina A) | Gibco | 17504044 | Medio prosencéfalo 3, 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Kit de cable de plátano a microagarrador | Aparato Harvard BTX | 45-0216 | |
| Biometra TRIO-Termociclador (máquina de PCR) | Analytik Jena | 846-2-070-723 | |
| Capilares, vidrio de borosilicato con filamento, diámetro exterior 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm de longitud | Science Products | BF120-69-10 | Necesita ser estirado hasta un grosor específico |
| CHIR-99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | Medio de prosencéfalo 2 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Colagenasa tipo IV | Gibco | 17104019 | |
| CRTDi004-A | Planta de ingeniería de células madre en CMCB DD | https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A | Línea hiPSC adaptada a una sola célula del donante |
| sano DAPI | Roche 10236276001 | 1 mg/mL de stock, uso diluido 1:1000 para | |
| IF Dibutiril-cAMP | STEMCELL Technologies | 73884 | Medio del prosencéfalo 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Fisher Scientific | 31330095 | Medio de prosencéfalo 1, 2 y 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Dorsomorphin | STEMCELL Technologies | 72102 | Medio de prosencéfalo 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Dumont #55 Pinzas, rectas, 11 cm | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| ECM 830 Sistema de electroporación de onda cuadrada | Harvard Apparatus BTX | 45-2052 | |
| Etanol | Sigma Aldrich | 32205-1L-M | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Fast Green FCF | Sigma | Aldrich F7252 | |
| FBS) | GE Healthcare | SH30070.03 | |
| Tirador de micropipetas Flaming/Brown | Sutter Instrument Co. | P-97 | Para la extracción de microcapilares |
| Geneious Prime | GraphPad Software LLC d.b.a Geneious | Software versión 2024.0.5 | |
| gLACZ | Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014 | 5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleótidos subrayados = PAM | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | Medio prosencéfalo 1, 2, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | |
| gPCGF4 KO1 | este documento | 5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corresponde a las imágenes KO en la Figura 3I+J) | |
| gPCGF4 KO2 | este documento | 5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corresponde al KO imágenes en la Figura 3I + J) | |
| HEPES | hecho en casa | 1 M stock | |
| Horse Serum, Gibco 26050088 | |||
| inactivado por calor Proteína recombinante GDNF humana | Thermo Fisher | 450-10 | Medio de prosencéfalo 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Humano/Ratón/Rata BDNF Proteína Recombinante | Thermo Fisher | 450-02 | Medio de prosencéfalo 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Ácido clorhídrico (HCl) | Sigma Aldrich | 258148 | Para hacer TrisHCl |
| ImmEdge (cera) | Pluma Vector Laboraories | H-4000 | |
| Solución de insulina humana | Sigma Aldrich | I9278 | Medio del prosencéfalo 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Suero Knockout Reemplazo | Gibco | 10828-010 | Medio prosencéfalo 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Laser Scanning Microscopio confocal 980 | Agarosa de | ||
| , ultrapura | Thermo Fisher | 16520100 | para la inclusión de hCOs durante el seccionamiento por vibratomo |
| Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal, sin LDEV | Corning | 354230 | Para el cultivo |
| de organoidesMatrigel Matriz con calificación hESC, sin LDEV | 354277 | Corning para cultivo hiPSC | |
| MgCl2, 1 M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| PicoPump + Interruptor de pie | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Microloader Puntas de pipeta 0.5 a 20 &; L | Eppendorf | 5242956003 | Para la carga de capilares de vidrio |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | |
| mTeSR 1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Medio de células madre |
| N-2 suplemento | Gibco | 17502048 | Medio de prosencéfalo 2 y 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix | New England Biolabs | M0541S | |
| Cámara de recuento Neubauer | Marca | 718605 | |
| Medio neurobasal | Gibco | 21103049 | Medio prosencéfalo 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140050 | Medio de prosencéfalo 1, 2, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| tampón dúplex sin nucleasas | Tecnologías de ADN integradas | 1072570 | |
| O. C. T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Medio de inclusión para muestras de tejido congelado |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | |
| Paraformaldehído | Fisher Chemical | P/0840/53 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Peel-A-Way Molde de inclusión truncadoT12 | Polysciences Inc. | 18986-1 | Para la inclusión de hCOs para vibratomo y crioseccionamiento |
| penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Prosencéfalo medio 1, 2, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 y para medio de células madre después de la nucleofección |
| Placa de Petri 60 mm x 15 mm, sin ventilación, estéril | Corning | BP50-02 | |
| Petri Cámara de electrodos de platino, espacio de 5 mm | Harvard Apparatus BTX | 45-0504 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | hecha en casa | ||
| Proteinasa K | Sigma Aldrich | P2308 | De Titrachium album; 10 mg/mL stock |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Inhibidor de la vía RHO/ROCK (Y-27632) | STEMCELL Technologies | 72308 | |
| SB-431542 | STEMCELL Technologies | 72232 | Medio prosencéfalo 2 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Citrato de sodio dihidratado | Sigma Aldrich | W302600-1KG-K | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Sacarosa | Sigma Aldrich | S7903 | |
| SuperFrost Plus correderas de adherencia | Fisher Scientific | 10149870 | |
| SZX10 con un KL 300 LED | Olympus | SZX10 | O estereoscopio alternativo |
| Thermo Shaker | Grant bio | PSC24N | |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T9284 | a.k.a. Octoxinol 9 |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | Para hacer TrisHCl |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Thermo Fisher | 12604021 | Disociation enzmye para hacer suspensiones unicelulares |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | a.k.a. Polisorbato 20 |
| Sal de Tiro | Sigma Aldrich | T2145-10x1l | |
| Vibrador Microtomo (vibrátomo) | Leica | VT1200 S | |
| Wide-Bore 1000 µ L Puntas de filtro de ajuste universal | Corning | TF-1005-WB-R-S | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | Medio prosencéfalo 1, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
Referencias
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
- Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellu....
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