Este protocolo describe un método eficiente y no quirúrgico para la implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama en ratones. La técnica consiste en la disociación enzimática del tumor seguida de una inyección directa en las almohadillas de grasa mamaria, lo que permite una implantación de alto rendimiento. La validación exhaustiva garantiza la fidelidad del modelo, lo que facilita estudios rigurosos en varios subtipos de cáncer de mama.
Artículo de método
Disociación de alto rendimiento e implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama
En este artículo
Resumen
Resumen
Los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) proporcionan un método clínicamente relevante para recapitular los tipos de células tumorales involucradas y el microambiente tumoral, que es esencial para avanzar en el conocimiento del cáncer de mama (CM). Además, los modelos PDX permiten el estudio de los efectos sistémicos de la BC, lo que no es posible con modelos in vitro. Los métodos tradicionales para implantar xenoinjertos de BC suelen implicar anestesia y procedimientos quirúrgicos estériles, que requieren mucho tiempo, son invasivos y limitan la escalabilidad de los modelos PDX en la investigación de BC. Este protocolo describe un método simple y escalable para la implantación ortotópica de BC PDX en ratones. Para el injerto de PDX se utilizó la cepa de ratón inmunodeficiente NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG). Las muestras humanas de BC obtenidas de pacientes con consentimiento del IRB se disociaron mecánica y enzimáticamente, y luego se resuspendieron en una solución de extracto de membrana basal (BME) y RPMI 1640. Los animales fueron inmovilizados mediante el desaliño y se aplicó crema depilatoria para eliminar el vello de las almohadillas de grasa en el cuarto pezón inguinal, seguido de una inyección. Aproximadamente 2 millones de células en una suspensión de 100 μL se inyectaron bilateralmente por vía ortotópica en las almohadillas de grasa mamaria utilizando una aguja de 26 G. En particular, no se requirió anestesia y el tiempo total del procedimiento fue de menos de 5 minutos, desde la preparación de la célula hasta la inyección. Después de un período de crecimiento de varios meses, los tumores se extirparon y se procesaron para su autenticación. La validación incluyó la evaluación del estado de los receptores mediante inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para los receptores BC tradicionales (es decir, ER, PR, HER2). La morfología del tumor se confirmó con tinción de hematoxilina y eosina (H&E), que fue interpretada por un patólogo. La similitud genética con la muestra del paciente se verificó mediante secuenciación masiva de ARN y análisis de repeticiones cortas en tándem (STR). Este enfoque para el injerto y la validación de PDX respalda el desarrollo riguroso de modelos y la implantación de tumores de alto rendimiento, lo que permite estudios con buen poder estadístico en varios subtipos de BC.
Introducción
El cáncer de mama (CM) se diagnostica en más de 2 millones de mujeres en todo el mundo cada año1. Con el fin de avanzar en la comprensión biológica básica de la CM y traducir con éxito las nuevas terapias a tratamientos aprobados, se necesitan modelos animales preclínicos que conserven las características definitorias de los tumores de los pacientes. Se ha demostrado que los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) recapitulan la heterogeneidad tumoral con alta fidelidad cuando se implantan ortotópicamente, incluida la histopatología, la expresión del receptor y las aberraciones genéticas 2,3,4. Es importante destacar que también retienen las células estromales que contribuyen al microambiente del tumor, como la vasculatura, las células inmunitarias y los fibroblastos asociados al cáncer. Sin embargo, son reemplazados gradualmente por células estromales del huésped murino con paso5. Las PDX también permiten el estudio de las complicaciones sistémicas derivadas del crecimiento tumoral, como la fatiga 6,7, que actualmente no es posible con modelos in vitro.
Sin embargo, el éxito del injerto de BC PDX requiere una cepa de ratón inmunodeficiente, siendo la cepa más utilizada NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). Los ratones NSG están desprovistos de inmunidad adaptativa y exhiben una inmunidad innata altamente defectuosa8. El injerto de BC PDX se ha logrado en otras cepas inmunodeficientes, como SCID/Beige (CB17.Cg-PrkdcscidLyst bg-J/Crl), con tasas de injerto similares4.
Los métodos tradicionales de implantación de BC PDX implican la implantación quirúrgica de un fragmento tumoral en la almohadilla de grasa mamaria9, y este enfoque conduce a un injerto exitoso a tasas favorables. Sin embargo, la necesidad de procedimientos quirúrgicos estériles y el uso de anestésicos hace que requiera mucho tiempo, lo que limita el número de ratones que se pueden implantar en un determinado período de tiempo. Dados los posibles beneficios predictivos de las PDX en las respuestas a los fármacos en los tumores y su uso en la medicina de precisión10, es vital contar con un flujo de trabajo sencillo y reproducible para implantar PDX de forma homogénea en ratones. Este artículo demuestra la disociación de tumores de mama humanos en una suspensión de una sola célula y la posterior inyección ortotópica en almohadillas de grasa mamaria de ratones inmunodeficientes.
Protocolo
Este protocolo se adhiere a las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de West Virginia (WVU). Se utilizaron ratones hembra NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG), de 8 semanas o más y con un peso aproximado de 25 g, para las inyecciones de células tumorales. El tejido tumoral de cáncer de mama se obtuvo en el Instituto Oncológico de la Universidad de Virginia Occidental (Morgantown, WV) y por la Red Cooperativa de Tejido Humano del NCI bajo el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la WVU y el Comité de Revisión y Supervisión del Protocolo del Instituto del Cáncer de la WVU. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en condiciones asépticas dentro de un gabinete de seguridad biológica de Clase II, siguiendo los protocolos adecuados de equipo de protección personal (EPP). Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Disociación enzimática de alto rendimiento del tejido tumoral
- Descongele y combine las enzimas H, R y A del kit de disociación de tumores humanos en un tubo C estéril. Agregue 200 μL de enzima H, 100 μL de enzima R y 25 μL de enzima A. Lleve el volumen final a ~5 mL agregando 4.7 mL de medio RPMI 1640 estéril al tubo C.
NOTA: El medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco se puede utilizar en lugar de RPMI 1640. - Los fragmentos tumorales pueden cortarse y congelarse como se describe en los protocolos existentes9. Transfiera los fragmentos tumorales descongelados y el medio de congelación que los acompaña a la mitad de una placa de cultivo estéril de 100 mm. Con pinzas estériles, transfiera los fragmentos tumorales a un microtubo estéril de 5 ml.
NOTA: Se puede utilizar una aguja hipodérmica estéril como alternativa a las pinzas. Se puede utilizar una placa de 35 mm en lugar de un microtubo de 5 mL. - Lave los fragmentos tumorales con 1-3 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, 1x). Manipule los fragmentos de la solución con pinzas para asegurar la eliminación completa del medio de congelación residual.
- Transfiera los fragmentos lavados a un microtubo de 2 mL con pinzas. Aplique 1 mL de solución de antibiótico triple (TAB) a los fragmentos tumorales e incube durante 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Este paso se puede omitir si lo desea. Se puede fabricar un caldo de TAB 10x disolviendo gentamicina al 1%, clindamicina al 1% y sulfato de polimixina B al 0,5% en PBS estéril 1x. Diluir a 1x solución de TAB en 1x PBS estéril. - Con pinzas estériles, transfiera los fragmentos desinfectados a un nuevo microtubo de 5 mL. Realice un segundo lavado con 1-3 mL de PBS estéril. Transfiera los fragmentos lavados a la mitad seca de la placa de cultivo de 100 mm del paso 1.2.
- Con dos hojas de bisturí estériles No. 10, pique completamente el tejido tumoral. Transfiera los fragmentos tumorales picados a una cuchilla y deposítelos en el tubo C que contiene la solución enzimática preparada. Sujete firmemente la tapa del tubo hasta que se sienta un clic final.
- Invierta el tubo C varias veces para asegurar una distribución uniforme de los fragmentos tumorales dentro de la solución enzimática.
- Coloque el tubo C en el disociador mecánico. Invierta el tubo y asegúrese de que todo el contenido esté sumergido en el medio. El tubo estará en una posición invertida en la máquina.
- Asegure el tubo en una ranura con la parte dentada hacia el operador. Si corresponde, coloque el calentador alrededor del tubo.
- Seleccione el programa 37C_h_TDK_3 en la interfaz de la pantalla táctil. Este programa funciona durante 60 minutos a 37 °C. Para tumores más blandos, se pueden usar 37C_h_TDK_1 o 2.
NOTA: Para obtener la mayor eficiencia, se recomienda que los ratones estén preparados para la inyección durante este período de disociación mediante la aplicación de crema depilatoria en los sitios de inyección. - Una vez finalizado el programa de disociación, inspeccione el contenido del tubo. No deben quedar fragmentos tumorales visibles.
NOTA: Si hay fragmentos, es posible que se requiera un tiempo de disociación adicional. En tales casos, ejecute el programa durante 20-30 minutos adicionales. - Una vez que se logre la disociación adecuada, centrifugue el tubo C a 200 x g durante 5-8 min a 4 °C para pellets las células disociadas. Retire con cuidado el sobrenadante mediante aspiración endouterina o una pipeta.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 5-10 mL de medio RPMI fresco. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL para facilitar la manipulación. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5-8 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante.
NOTA: Este paso puede omitirse si el pellet de celda es pequeño. En tales casos, las células se resuspenden directamente en el volumen deseado de medios y luego se combinan con extracto de membrana basal (Matrigel) para minimizar la pérdida celular. - Vuelva a suspender el pellet de celda en un volumen de RPMI 1640, equivalente a la mitad del volumen de inyección final deseado. RPMI 1640 y Matrigel se combinarán en una proporción de 1:1 v/v, con un volumen de inyección final de 100 μL por sitio de inyección.
NOTA: Para inyección bilateral en 4 ratones, el volumen total requerido es de 800 μL. Por lo tanto, vuelva a suspender las células en al menos 400 μL de RPMI 1640. Para tener en cuenta la posible pérdida de volumen, es aconsejable añadir un 20% adicional al volumen final, manteniendo la relación 1:1 v/v. Alternativamente, se puede utilizar DMEM o 1x PBS en lugar de RPMI 1640. - Cuente las células resuspendidas usando un hemocitómetro o un método automatizado. Diluir según sea necesario para lograr la concentración deseada para la inyección. Se sugiere un punto de partida de aproximadamente 1-2 millones de células por sitio de inyección.
- En un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2 mL, combine la cantidad deseada de suspensión celular diluida en RPMI con un volumen igual de Matrigel. Mezcle suavemente la suspensión mediante pipeteo repetido para garantizar la homogeneidad.
NOTA: Siguiendo el paso anterior, añadir 400 μL de suspensión celular diluida a 400 μL de Matrigel. Tenga en cuenta el número de agujas de inyección que se utilizarán y tenga en cuenta las pérdidas de volumen asociadas. Mantén Matrigel en hielo en todo momento. No lo descongele hasta que las células se vuelvan a suspender, ya que se solidificará rápidamente. Se recomienda mantener alícuotas pequeñas (por ejemplo, 120 μL) para una descongelación rápida y combinación en un tubo de 2 mL. - Mantenga la suspensión celular en hielo hasta que esté lista para la inyección.
2. Inyección ortotópica de almohadilla de grasa mamaria inguinal de PDX disociado
- Determine la masa de cada ratón utilizando una balanza calibrada. Aplique una capa delgada de crema depilatoria en el (los) sitio(s) de inyección objetivo. Con un bastoncillo de algodón estéril, masajee la crema con movimientos alternos en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj para facilitar la eliminación rápida del pelaje.
- Retire el exceso de pelo y la crema depilatoria con una esponja de gasa estéril empapada en solución salina. Asegure la depilación completa en el área de inyección.
NOTA: No exceda los 60 segundos de exposición a la crema depilatoria para prevenir la irritación de la piel. Los ratones se pueden afeitar antes de la aplicación de la crema depilatoria para minimizar aún más el tiempo de exposición. Este paso se puede realizar durante la disociación tumoral para optimizar la eficiencia del tiempo y minimizar la duración del almacenamiento de la suspensión celular en hielo.
- Retire el exceso de pelo y la crema depilatoria con una esponja de gasa estéril empapada en solución salina. Asegure la depilación completa en el área de inyección.
- Realice una inspección visual exhaustiva de cada ratón para evaluar la aptitud para la inyección. Evalúe si hay signos de dolor, angustia, enfermedad u otras contraindicaciones.
- Con una jeringa de 1 ml sin aguja adjunta, aspire suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para garantizar la homogeneidad. Coloque una aguja de 26 g en la jeringa de 1 ml y extraiga el volumen de inyección deseado. Elimine las burbujas de aire de la jeringa dando golpecitos o movimientos suaves.
NOTA: Se recomienda no exceder los 600 μL por jeringa para facilitar la inyección con una sola mano. - Coloque la jeringa preparada horizontalmente encima del recipiente de hielo, con la aguja orientada en dirección opuesta al operador. Coloque el recipiente de hielo y la aguja en el mismo lado que la mano dominante del operador o la mano de inyección preferida. Retire el ratón de su carcasa y desinfecte la zona de inyección con una almohadilla limpiadora con alcohol.
- Sujete firmemente al ratón agarrando la piel dorsal firmemente por la nuca y la espalda. Asegure una inmovilización suficiente para exponer claramente las almohadillas de grasa mamaria. La almohadilla de grasa mamaria inguinal se extiende desde el pezón hasta la parte superior de la cadera. Se puede observar como un tejido blando y rosado en el área descrita debajo de la piel.
NOTA: Un operador asistente puede usar pinzas de lados planos para pellizcar y elevar la piel que contiene la almohadilla de grasa. Esta técnica ayuda a garantizar que el operador que realiza la inyección se dirija con éxito a la almohadilla de grasa. - Coloque el ratón en posición supina. Inserte la aguja (biselada hacia arriba) en un ángulo de 45 grados, apuntando hacia la cadera aproximadamente 0,5-1 cm caudal a la almohadilla de grasa, ajustando la longitud de la aguja.
- Avance la aguja en la almohadilla de grasa. De forma controlada, inyectar el volumen deseado de suspensión celular. La velocidad de inyección eficiente ayudará a minimizar la agitación de los animales debido a la sujeción prolongada.
NOTA: Para minimizar el sufrimiento del animal, la duración máxima de la sujeción manual continua no debe exceder los 30 s. Si la duración de la inmovilización supera los 30 s, el animal debe ser liberado en la jaula para que se recupere antes de un segundo intento.
- Avance la aguja en la almohadilla de grasa. De forma controlada, inyectar el volumen deseado de suspensión celular. La velocidad de inyección eficiente ayudará a minimizar la agitación de los animales debido a la sujeción prolongada.
- Después de la inyección, gire la aguja 180 grados (bisel hacia abajo). Mantenga la posición de la aguja brevemente antes de la extracción lenta para minimizar la pérdida de células del sitio de inyección. Si se produce algún sangrado, aplique una gasa estándar o una gasa hemostática según sea necesario.
- Repita los pasos 2.6 y 2.7 para la almohadilla de grasa contralateral si se requieren inyecciones bilaterales. Para varios animales, repita los pasos 2.2 a 2.7 según sea necesario.
3. Procedimientos de seguimiento
- Deseche todos los objetos punzocortantes en los recipientes designados para objetos punzocortantes. Deseche todo el resto del contenido en contenedores de residuos adecuados.
- Si se produce sangrado durante la inyección, vigile a los ratones durante al menos 1 hora después para asegurar la hemostasia.
- Controla la masa corporal semanalmente. Evaluar el volumen del tumor una vez que el crecimiento se vuelve palpable.
Resultados
Este estudio describe un enfoque eficiente y no quirúrgico para la implantación ortotópica de xenoinjertos de cáncer de mama derivados de pacientes en ratones. El tejido tumoral de mama se disoció utilizando enzimas específicas humanas y agitación mecánica, se resuspendió en una proporción de 1:1 v/v de Matrigel: RPMI 1640 y se inyectó ortotópicamente en las almohadillas de grasa mamaria inguinal de ratones NSG (Figura 1 y Figura 2). Para asegurar la fidelidad de los modelos PDX, se validó la concordancia de la muestra tumoral original del paciente con los tumores transitados con técnicas histopatológicas y genómicas establecidas. La expresión de los receptores se perfiló mediante tinción inmunohistoquímica (IHQ) de los receptores estándar del cáncer de mama, incluidos el receptor de estrógeno (RE), el receptor de progesterona (PR) y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) (Figura 3). La morfología celular se evaluó mediante la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de los cortes tumorales seccionados y la interpretación de los cortes teñidos por patólogos. La preservación del paisaje genético y la retención de células humanas se validaron mediante secuenciación masiva de ARN y autenticación de repeticiones cortas en tándem (STR) (Figura 4 y Tabla 1). Además, las pruebas de patógenos no identificaron contaminación del paciente ni muestras tumorales transitadas, lo cual es un paso de verificación esencial dado el uso de ratones inmunodeficientes.
Figura 1: Descripción general del protocolo. Representación de la disociación tumoral y el flujo de trabajo de inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los ratones NSG se prepararon para la inyección utilizando una crema depilatoria aplicada en movimientos alternos en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj para eliminar completamente el pelo del área de la almohadilla de grasa mamaria inguinal (Figura 2A). El exceso de crema depilatoria se limpió de la piel abdominal expuesta con gasa estéril y se desinfectó el área con una almohadilla con alcohol (Figura 2B). Una aguja estéril cargada con células tumorales disociadas se colocó en un ángulo de aproximadamente 45 grados, 0,5-1 mm caudal, con respecto a las almohadillas de grasa mamaria del cuarto pezón inguinal (Figura 2C). Las células tumorales se inyectaron de forma controlada en las almohadillas de grasa mamaria del cuarto pezón inguinal (Figura 2D). El crecimiento tumoral se detectó inicialmente mediante la palpación digital de las almohadillas de grasa. Posteriormente, se realizó un seguimiento cuantitativo de la progresión del volumen tumoral mediante resonancia magnética (RM) (Figura 2E). Tanto el peso corporal (Figura 2F) como los volúmenes tumorales (Figura 2G) se midieron semanalmente para controlar las fluctuaciones en el peso y la progresión de los volúmenes tumorales. Los tumores se inspeccionaron visualmente para detectar heridas, como ulceraciones, que requirieran una terminación prematura. El injerto bilateral exitoso de PDX en las almohadillas de grasa mamaria inguinal se muestra en la Figura 2H, y las almohadillas de grasa después de la extirpación de los tumores se muestran en la Figura 2I.
Figura 2: Preparación de ratones, inyección de PDX y seguimiento de la progresión tumoral. (A) Las almohadillas de grasa mamaria se depilaron minuciosamente. (B) Presentación del sitio de inyección con una clara visibilidad de las áreas de inyección objetivo. (C) Posición de la jeringa en la almohadilla de grasa, normalmente de 0,5-1 mm caudal a la almohadilla de grasa, dependiendo de la longitud de la aguja. La flecha blanca indica el área objetivo de la aguja al insertarla. (D) Representación de la inyección de células disociadas en la almohadilla de grasa mamaria del cuarto pezón inguinal izquierdo. La aguja debe sostenerse en un ángulo de aproximadamente 45 grados, como se muestra para la inyección. (E) Imagen de resonancia magnética representativa de tumores injertados bilateralmente en el lugar de la inyección. Los tumores se resaltan en verde. (F) Progresión representativa del peso corporal en gramos después de la inyección de células tumorales (n = 5). La línea azul oscuro representa una regresión lineal simple, que es significativamente distinta de cero (p < 0,0001); Los ratones ganaron, en promedio, 22 mg.Día-1. El sombreado azul oscuro es un intervalo de confianza del 95%, el sombreado azul claro es un intervalo de predicción del 95% y las líneas naranjas son mediciones longitudinales del peso corporal. (G) Progresión representativa de los volúmenes tumorales individuales en mm3 después de la inyección de células tumorales (n = 10). La línea azul oscuro representa la regresión exponencial; El tiempo de duplicación del volumen tumoral fue de 19,08 días. El sombreado azul oscuro es un intervalo de confianza del 95 %, el sombreado azul claro es un intervalo de predicción del 95 % y las líneas naranjas son volúmenes tumorales longitudinales. (H) Injerto bilateral exitoso de células PDX en las almohadillas de grasa mamaria inguinal. Tenga en cuenta que la vascularización se puede ver irrigando cada tumor. Las flechas blancas identifican los tumores. (I) El área de la almohadilla de grasa mamaria inguinal después de la extirpación de tumores. (H,I) Las unidades de la regla están en cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El PDX representativo (PEN_056) se originó a partir de una mujer caucásica de 31 años con carcinoma mamario invasivo en estadio 3A. El tumor primario, extraído de la mama derecha, tenía un estado del receptor de ER y PR negativo, HER2 positivo (ER-PR-HER2+). La tinción IHQ para los receptores ER, PR y HER2 mostró concordancia entre el paciente y los tumores PDX (Figura 3). Sin embargo, el PDX muestra una mayor expresión de HER2, lo que puede deberse a un crecimiento selectivo de células HER2+. La evaluación del patólogo de los cortes teñidos con H&E confirmó la presencia de un carcinoma pobremente diferenciado con morfología y citología consistentes tanto en el paciente como en las muestras de PDX (Figura 3).
Figura 3: Tinción del receptor IHQ y H&E. (Columna izquierda) Tinción IHQ de los receptores ER, PR y HER2 y tinción H&E en el tumor del paciente. Las tinciones ER y PR no muestran tinciones positivas evidentes, como se esperaba. Las tinciones de HER2 muestran positividad para HER2 (marrón). (Columna derecha) Tinción IHQ de los receptores ER, PR y HER2 y tinción H&E en la muestra de PDX transitada. La tinción del receptor se asemeja mucho a la observada en la muestra del paciente, aunque HER2 muestra una mayor expresión después del paso. Barra de escala: 50 μm; Aumento: 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El genotipado de repeticiones cortas en tándem (STR) confirmó una similitud del >80% entre los 13 loci autosómicos definidos por las directrices de consenso ASN-0002-2022 de American Type Cell Culture Collection (ATCC) más 3 loci adicionales (Tabla 1). La secuenciación masiva de ARN (RNA-seq) de la muestra tumoral del paciente y PDX confirmó niveles equivalentes de alineación con el genoma de referencia humano más reciente (T2T CHM13v2.0), con un 82,3 % y un 79,1 % de las lecturas alineadas, respectivamente. Además, el tumor del paciente y el PDX mostraron una fuerte correlación positiva con un valor r de Pearson de 0,9559 (Figura 4A). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes en el que se comparó el PDX con el tumor del paciente reveló que las 10 vías significativamente enriquecidas de los procesos biológicos de ontología génica eran predominantemente conjuntos de genes inmunológicos, lo que sugiere que la mayor parte de la variación transcripcional entre PDX y el tumor del paciente se deriva de la falta de células inmunitarias en la muestra de PDX (Figura 4B).
| D5S818 | D13S317 | D7S820 | SVA | TH01 | AM | TPOX | CSF1PO | D3S1358 | D21S11 | D18S51 | Penta_E | Penta_D | D8S1179 | FGA | |
| Tumor del paciente | 12 13 | 8 8 | 8 9 | 17 17 | 9 9.3 | X X | 8 10 | 15 16 | 29 31.2 | 16 19 | 12 13 | 14 14 | 10 14 | 21 25 | |
| Tumor PDX | 13 14 | 8 8 | 8 9 | 17 17 | 9 9.3 | X X | 10 10 | 15 15 | 29 29 | 16 19 | 12 13 | 14 14 | 10 14 | 21 25 |
Tabla 1: Autenticación de repetición corta en tándem (STR).
Figura 4: Correlación entre secuenciación de ARN y enriquecimiento de conjuntos de genes. (A) Diagrama de dispersión que visualiza los recuentos normalizados log2 por millón (CPM) para todos los genes del tumor del paciente (eje x) y PDX (eje y). Se encontró una fuerte correlación positiva, con un valor de r de Pearson de 0,9559. (B) Gráficos de Ridge para los 10 conjuntos de genes de proceso biológico de ontología génica más enriquecidos al comparar PDX vs. tumor del paciente. Las curvas representan la distribución de la puntuación de enriquecimiento para cada conjunto de genes; El color representa el valor q de FDR para cada conjunto de genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Este artículo presenta un método eficiente y de alto rendimiento para implantar ortotópicamente BC PDX en las almohadillas de grasa mamaria inguinal de ratones inmunodeficientes. Este flujo de trabajo optimizado permite a un solo investigador implantar PDX en docenas de ratones por día, lo que respalda estudios a gran escala y con la potencia adecuada. La capacidad de disociar e implantar simultáneamente múltiples PDX únicos también permite enfoques oncológicos de precisión. Más allá de la eficiencia del tiempo, la disociación de los tumores crea una suspensión homogénea de tipos de células que se distribuye uniformemente entre los ratones. En nuestra experiencia, esta homogeneidad contribuye a tasas consistentes de injerto y crecimiento tumoral.
Si bien generalmente es efectivo, este protocolo puede requerir modificaciones en ciertos escenarios. Por ejemplo, el tiempo de ejecución estándar de 1 h en el disociador mecánico ocasionalmente resulta insuficiente para la disociación completa del tejido tumoral. Mientras agarra firmemente la sonda C, muévala hacia abajo varias veces para acumular cualquier tejido suelto en la parte inferior. Si quedan fragmentos de tejido visibles, continúe la disociación y vuelva a inspeccionar a intervalos de 15 minutos. Es importante tener en cuenta que algunos tejidos, en particular el tejido fibroso o adiposo, pueden resistir la disociación y requerir extracción manual para evitar la obstrucción de la aguja durante la inyección.
Recomendamos utilizar la aguja de calibre más pequeño posible (27 G o 26 G) para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el riesgo de reflujo celular desde el lugar de la inyección, lo que podría afectar el éxito del injerto y las tasas de crecimiento tumoral. Sin embargo, si quedan fragmentos de tejido adiposo o tejido no disociados, puede ser necesaria una aguja de mayor calibre (16 G o 18 G), aunque con un mayor riesgo de sangrado o pérdida de células. Independientemente del calibre de aguja seleccionado, la competencia en el manejo de los animales es el componente más importante para realizar las inyecciones de manera efectiva. No se utiliza anestesia en este protocolo, y si bien esto ahorra tiempo, también permite que el animal tenga cierto grado de movilidad cuando se realizan las inyecciones. Si no se logra una sujeción adecuada al desaliñarse, los movimientos bruscos de las extremidades pueden causar la punción de los vasos, la creación de una herida de salida que impide la retención celular o punciones en la pared abdominal. Se recomienda encarecidamente practicar suficientemente la inyección antes de inyectar células valiosas.
La técnica de disociación descrita es altamente transferible y puede emplearse en la implantación de muchos otros tipos de tumores, tanto en modelos ortotópicos como subcutáneos. Sin embargo, al menos en el contexto de la CM, debe evitarse la implantación subcutánea. La inyección ortotópica BC PDX da como resultado una vascularización superior del huésped del tumor injertado en comparación con la subcutánea, y la implantación de una almohadilla de grasa inguinal conduce a mayores tasas de injerto que la almohadilla de grasa torácica11. Además, las PDX implantadas ortotópicamente tienen un tiempo de injerto más corto y una tasa de crecimiento más rápida en comparación con las inyecciones subcutáneas12. También debe tenerse en cuenta que, si bien la disociación facilita la inyección rápida de células tumorales, inherentemente resulta en la pérdida del contexto de célula a célula; Por lo tanto, puede no ser un enfoque adecuado en todos los casos. Para los casos que exigen una interacción celular auténtica (por ejemplo, transcriptómica espacial de los tumores), puede ser preferible inyectar trozos de tumor picados o implantar fragmentos.
Si bien es esencial para los estudios de PDX, el uso de ratones inmunodeficientes presenta ciertas limitaciones. Desde el punto de vista logístico, se requiere un entorno totalmente estéril, que incluya vivienda, alimentos y agua. Esto requiere además áreas de alojamiento dedicadas para animales inmunodeficientes para reducir el riesgo de infección, lo que podría aumentar los costos de alojamiento. Esta mayor susceptibilidad a las infecciones es la razón por la que se sugiere una etapa de incubación de antibióticos para los fragmentos tumorales antes de la disociación. Sin embargo, algunos estudios han demostrado que el uso de antibióticos en cultivos celulares conduce a alteraciones en los perfiles de expresión génica13. Teniendo en cuenta esto, los investigadores deben evaluar el uso de antibióticos para cada estudio. Si bien la ausencia efectiva de un sistema inmunitario permite que las PDX se injerten, también impide el estudio de los numerosos efectos del sistema inmunitario en la progresión del CM14.
Este método demuestra una alta fidelidad a las muestras tumorales del paciente. La autenticación histopatológica confirmó la concordancia de la PDX transitada en relación con la muestra tumoral del paciente, como se esperaba. La alta alineación de las lecturas con el genoma humano sugiere fuertemente que el PDX mantiene un alto porcentaje de células humanas después del paso. Esto se ve respaldado por la similitud del >80% en los perfiles de STR y la fuerte correlación positiva en los datos de RNA-seq entre el tumor del paciente y PDX. Las adaptaciones moleculares en los tejidos periféricos de ratones PDX después del crecimiento de un tumor de mama también son consistentes con las adaptaciones moleculares en pacientes con CM humanos. Los análisis proteómicos y de secuenciación masiva de ARN de los músculos esqueléticos de ratones BC PDX son sorprendentemente concordantes con los cambios moleculares en las biopsias musculares obtenidas de pacientes diagnosticados con BC 6,7 en etapa temprana. En conjunto, la similitud del perfil STR y la secuenciación de ARN, junto con adaptaciones consistentes en tejidos periféricos, proporciona datos convincentes para el uso de ratones BC PDX en ensayos preclínicos.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer las generosas contribuciones de los pacientes que proporcionaron muestras tumorales para el desarrollo de PDX. Emidio Pistilli reconoce las importantes contribuciones previas de Hannah Wilson, MD/PhD. Esta investigación fue apoyada por las siguientes organizaciones: Institutos Nacionales de Artritis, Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel (NIAMS) bajo el premio número R01AR079445 (Pistilli); el Centro Central de Genómica de WVU (U54GM104942); el Centro de Modelos Animales e Imágenes de WVU (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); Institutos Nacionales de Ciencias Médicas Generales bajo el premio número P20GM121322 (Lockman). La Figura 1 se creó con BioRender.com.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 mL jeringa de tuberculina | BD | 305945 | estéril |
| 1x solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| microcentrífuga estéril de fondo redondo de 2.0 mL | Eppendorf 0030123620 | estéril | |
| 26 G, ½ in. | BD | 305111 | estéril |
| 5,0 | mL Eppendorf | 0030119401 | estéril |
| NSG de 8+ semanas de edad (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) ratones | The Jackson Laboratory | #005557 | |
| Almohadillas de preparación para el alcohol | Fisher Scientific | 22-363-750 | estéril |
| Extracto de membrana basal (Matrigel) | Cultrex | 3632-005-02 | |
| Aplicadores con punta de algodón, 6 in. | Fisher Scientific | 22-029-553 | estéril |
| Pinza curva con puntas medianas no dentadas, 152 mm | Microscopía electrónica Sciences | 50-365-845 | estéril |
| Crema depilatoria | Nair | ||
| gentleMACS C Tubos | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo disociador con calentadores | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Nº 10 hojas de bisturí | Fisher Scientific | 12-000-162 | estériles |
| Esponjas de gasa no tejidas, 4x4 pulgadas | Fisher Scientific | 22-028-558 | estéril |
| RPMI 1640 1x + L-Glutamina | Gibco | 11875093 | estéril |
| Kit de disociación tumoral, humano | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
Referencias
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).
- Wilson, H. E., et al. Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue. Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).
- Wilson, H. E., et al. Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).
- Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power. Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).
- Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).
- Okano, M., et al. Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
- Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).
- Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. Immune system effects on breast cancer. Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).
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