Artículo de método

Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

DOI:

10.3791/67651

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18 de abril de 2025

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los monocitos y macrófagos son células inmunitarias muy plásticas y reprogramables cruciales para la salud y la enfermedad. Perciben y responden a una amplia gama de estímulos mediante la adopción de programas de diferenciación y fenotipos específicos. Hemos estandarizado un modelo in vitro para estudiar la polarización y reprogramación de los macrófagos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células del linaje monocitos-macrófagos son multifuncionales y se encuentran en casi todos los tejidos del cuerpo. Coordinan las fases de inicio y resolución de la inmunidad innata y adaptativa, lo que afecta significativamente a la inmunidad protectora y a la lesión patológica inmunomediada. Mientras que los macrófagos residentes en los tejidos son actores clave para mantener la homeostasis en un estado estacionario, grandes cantidades de monocitos se reclutan de la sangre periférica en el tejido después de un daño o lesiones inflamatorias. Los macrófagos derivados de monocitos (M-DM) pueden diferenciarse en muchos subtipos dinámicos, y sus fenotipos y funciones dependen del entorno tisular local.

Para comparar diferentes estímulos o condiciones ambientales durante la diferenciación y polarización M-DM, estandarizamos un modelo in vitro de M-DM M0 humano no polarizado y algunos macrófagos con citocinas cardinales, M1 derivado de IFNγ/LPS, M2a derivado de IL-4 y M2c derivado de IL-10 o dexametasona, para analizar la reprogramación sesgada de M-DM mediante citometría de flujo y PCR en tiempo real. Descubrimos que CD64, CD206, CD163, CD14 y MERTK pueden discriminar claramente M0 no polarizado y M1, M2a y M2c polarizados por citometría de flujo. Además, definimos IRF1 y CXCL10 como genes específicos para las transcripciones clásicas M1, IRF4, CCL22 y TGM2 derivadas de IFNγ/LPS para M2a derivadas de IL-4, y el gen MERTK para M2c derivado de dexametasona. En resumen, nuestro protocolo estandarizado de M-DM podría proporcionar el mapa cardinal in vitro para analizar la diferenciación y polarización de la M-DM humana bajo diversos estímulos.

Introducción

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Los macrófagos, identificados por primera vez por Metchnikoff por su capacidad fagocítica, son células antiguas fundamentales para la vida de los metazoos. Se encuentran en todas partes en los mamíferos adultos, y presentan una notable diversidad anatómica y funcional. Como parte del sistema fagocítico mononuclear, junto con las células dendríticas y los monocitos, los macrófagos desempeñan un papel crucial en diversos procesos biológicos, desde el desarrollo y la homeostasis hasta las respuestas inmunitarias contra patógenos1,2. Los macrófagos residentes, especializados en sus microambientes tisulares, actúan como centinelas, monitoreando la salud de los tejidos y respondiendo a los cambios fisiológicos y amenazas externas. Se cree que su limitada plasticidad es una adaptación evolutiva para mantener la homeostasis de los tejidos. Por el contrario, los monocitos reclutados son más flexibles y pueden diferenciarse en diversos fenotipos de macrófagos durante la inflamación. Esta doble influencia de la inflamación y el nicho tisular da forma a la diversidad funcional de los macrófagos3. Por lo tanto, dependiendo del entorno tisular local, los macrófagos derivados de monocitos (M-DM) pueden diferenciarse en muchos subtipos. Los metabolitos locales, los factores de crecimiento, las citocinas y la interacción célula-célula 4,5,6 describen sus fenotipos y funciones. Además, los macrófagos son productores clave de factores que amortiguan la inflamación e impulsan la revascularización y la reparación de tejidos7,8.

Dado que al menos tres brazos principales controlan la polarización (condiciones ambientales extrínsecas, intrínsecas y tisulares), la polarización de los macrófagos debe verse como multidimensional2. Los principales obstáculos y escollos en la descripción de la diferenciación y polarización de macrófagos son las condiciones experimentales heterogéneas en la literatura y la falta de consenso sobre la definición de términos de macrófagos en experimentos in vitro e in vivo9. No obstante, se ha iniciado cierta unificación de estándares experimentales para diversos escenarios experimentales.

Para comprender mejor el campo de los macrófagos humanos, necesitamos modelos in vitro estandarizados y bien definidos de M-DM para vincular, diferenciar, polarizar, fenotipar y reprogramar, así como funciones específicas. Nuestro objetivo fue establecer un modelo estandarizado in vitro de M-DM M0 humano no polarizado y macrófagos con citocinas polarizadas para estudiar la reprogramación sesgada de M-DM mediante citometría de flujo y PCR en tiempo real. A pesar de que la polarización de los macrófagos es un proceso dinámico debido a su alta plasticidad y capacidad de integrar múltiples señales de su entorno, caracterizamos aquí los estados de polarización M-DM (M0) no polarizados y algunos estados de polarización in vitro, como el proinflamatorio clásico, comúnmente reconocido también como M1, inducido con IFNγ y LPS. Del mismo modo, los macrófagos M2 de reparación y regulación de tejidos pueden definirse como M2a cuando se inducen con IL-4 y M2c cuando se estimulan con dexametasona o IL-10. Estos estados polarizados capturan una instantánea del amplio espectro del entorno M-DM en el tiempo y el espacio, pero nos dan algunos puntos cardinales para establecer el mapa analítico donde ubicar las condiciones de prueba.

A pesar de la compleja y dinámica combinación de marcadores de superficie y programas transcripcionales, al analizar in vitro M-DM, hemos establecido que CD64, CD206, CD163, CD14 y MERTK pueden separar la condición M0 no polarizada, de la M1 inducida por IFNγ/LPS, la M2a inducida por IL-4 y la IL-10 o dexametasona inducida por citometría de flujo. Además, la expresión génica de IRF1 y CXCL10 se definió como específica para M1 inducida por IFNγ/LPS; Transcripciones específicas de IRF4, CCL22 y TGM2 para M2a derivada de IL-4; y el gen MERTK para M2c derivado de dexametasona, estableciendo puntos cardinales adicionales para comparar la reprogramación sesgada de M-DM desafiada con diferentes estímulos o incluso co-cultivada con otros tipos de células.

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Protocolo

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Todos los donantes de sangre voluntarios sanos dieron su consentimiento informado por escrito, y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de la Academia Nacional de Medicina (IMEX-CONICET-ANM) Argentina. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs)

NOTA: Las PBMC se aíslan de 40 mL de sangre periférica anticoagulada con citrato de sodio al 3,8% y utilizando centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (1077). Este protocolo se realiza en condiciones estériles en una cabina de bioseguridad BSL2.

  1. Transfiera la muestra de sangre periférica anticoagulada recibida a tubos apropiados de 15 mL o 50 mL para la centrifugación.
  2. Centrifugar muestras de sangre a 200 × g durante 15 min (aceleración: 4 desaceleración: 2, cuando el máximo es 5) a temperatura ambiente para obtener plasma rico en plaquetas (PRP) en la parte superior y fracción celular, incluidos los glóbulos rojos y blancos en la parte inferior. Véase Figura 1.
  3. Transfiera la fracción superior (PRP) a tubos de 15 mL (si se almacenará plasma) y centrifugue a 600 × g durante 10 min (aceleración y desaceleración máximas) para obtener la fracción final de plasma sin plaquetas. Almacene el plasma a -20 °C.
  4. Diluir la fracción celular obtenida de la primera centrifugación, 2x (mínimo) a 3x (máximo) utilizando solución salina estéril tamponada con fosfato (1x PBS) precalentada a temperatura ambiente. Homogeneizar suavemente y utilizar esta fracción diluida para la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque.
  5. Transfiera 15 mL de Ficoll-Hypaque a un tubo estéril de 50 mL. A continuación, añadir con cuidado y lentamente 30 mL de sangre diluida sobre el Ficoll, evitando mezclar las fases. Si trabaja con 10 mL o menos de sangre diluida, transfiera 4 mL de Ficoll-Hypaque a un tubo de 15 mL y luego agregue los 10 mL de muestra de sangre diluida><. NOTA: Este paso es crítico para obtener la fracción mononuclear.
  6. Centrifugar el tubo que contiene el Ficoll más sangre diluida a 600 × g durante 25 min (aceleración: 1; Deceleración: 0) a temperatura ambiente.
  7. Retire parte de la capa superior amarilla con una pipeta Pasteur estéril de 3 mL. A continuación, recoja cuidadosamente la interfaz (fracción "anular" mononuclear) formada entre la capa superior amarilla y la capa Ficoll con una pipeta Pasteur estéril. Este "anillo" contiene las células mononucleares (PBMC) de interés.
    NOTA: Se puede recolectar parte de la fase plasmática restante, pero asegúrese de evitar la fase Ficoll, ya que podría ser tóxica para los PBMC.
  8. Transfiera las PBMC recolectadas a un nuevo tubo de 15 mL que contenga un mínimo de 3 mL de PBS estéril 1x. A continuación, rellene con el volumen correspondiente de 1x PBS estéril a 12-15 mL. Centrifugar los PBMC a 600 × g (aceleración y desaceleración máximas) durante 10 min.
  9. Deseche el sobrenadante y vuelva a lavar los PBMC. Vuelva a suspender el pellet celular agregando 1 mL de PBS estéril 1x, luego rellene hasta 12-14 mL con PBS estéril adicional 1x. Centrifugar los tubos a 600 × g (aceleración y deceleración máximas) durante 10 min.
  10. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de PBMC en 1x PBS estéril que contenga 2% de suero fetal bovino inactivado (1x PBS-2% FBS) y aumente el volumen hasta 10 mL. Utilice un contador automático de células o cuente las células, preparando una suspensión celular 1:5 diluida en frío estéril 1x PBS y luego (1:2) en Azul de Tripán para obtener una dilución final de 1:10. Use un microscopio óptico para contar.
  11. Centrifugar la suspensión de PBMC a 300 × g durante 5 min a 8-10 °C. Volver a suspender las células en un volumen deseado de FBS estéril y frío 1x PBS-2% para obtener una concentración final de 108 células/mL. Deje estas celdas a 4 °C hasta el siguiente paso.
    NOTA: Si las PBMC recolectadas no se van a utilizar el mismo día, se recomienda congelar en un vial criogénico a 108 células/mL en un medio de congelación apropiado (90% de FBS que contiene 10% de dimetilsulfóxido, DMSO). Almacene a -80 °C en un recipiente de polietilenglicol durante la noche para permitir que las células se congelen lentamente, minimizando así el daño celular. Al día siguiente, transfiera las celdas a una caja de almacenamiento y déjelas a -80 °C durante un par de días o transfiéralas a un tanque de nitrógeno líquido durante un largo período de almacenamiento.

2. Clasificación de monocitos CD14+ mediante perlas magnéticas

NOTA: La cantidad de monocitos CD14 encontrados en las PBMC de donantes sanos varía dependiendo de la edad y el sexo. Cuando esté disponible, use un contador de células para obtener el % de monocitos en cada muestra y luego calcule el número de PBMC necesarios para clasificar los monocitos CD14 requeridos. Si no se dispone de un contador de células, el 10% de los monocitos por muestra de PBMC podría considerarse un enfoque amplio4,6,7,10,11,12,13.

Los monocitos CD14+ se aíslan utilizando un kit de selección positivo para CD14 humano5. Hemos estandarizado el protocolo de aislamiento utilizando 1 a 2 × 107 PBMCs en 100 μL de reacción; Utilice esta proporción para números más altos. El volumen mínimo de reacción sugerido es de 100 μL, incluso con un número de células inferior a 1 × 107 PBMC.

  1. Prepare la suspensión celular de PBMC a 1-2 × 108 celdas/mL de concentración en 1x PBS-2% FBS que contenga 1 mM de tampón de ácido etilendiaminotetraacético (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) y transfiera la cantidad deseada de PBMC a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 mL.
  2. Agregue 10 μL de Positive Selection Cocktail por cada 100 μL de suspensión celular, mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 15 min.
  3. Agregue 10 μL de nanopartículas magnéticas por cada 100 μL de suspensión celular, pipetee vigorosamente hacia arriba y hacia abajo más de 5 veces para suspender uniformemente las nanopartículas magnéticas, e incube a temperatura ambiente durante 10 min.
    NOTA: No se recomienda el vórtice.
  4. Agregue 1x tampón EDTA PBS-2% FBS-1 mM para aumentar el volumen total de la suspensión celular a 2,5 mL. Pipetea suavemente las células del tubo hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces. Inserte el tubo en el clasificador de imanes y apártelo durante 5 minutos.
  5. Tome el imán e inviértalo junto con el tubo en un movimiento continuo, descartando la fracción sobrenadante. Las células marcadas magnéticamente permanecerán dentro del tubo. Deje el imán y el tubo invertidos durante 2-3 s, luego gírelos verticalmente en posición vertical.
    NOTA: Deje las gotas que cuelguen de la boca del tubo; No los sacuda ni los seque.
  6. Retire el tubo del imán y vuelva a introducir en el tubo 2,5 mL de 1x tampón PBS-2% FBS-1 mM EDTA. Pipetea suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces para mezclarla. Vuelva a insertar el tubo en el imán y apártelo durante 5 minutos.
  7. En un movimiento continuo, invierta tanto el imán como el tubo, descartando la fracción sobrenadante. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender las células en una cantidad adecuada de 1x tampón PBS-2% FBS (sin EDTA). Las celdas seleccionadas positivamente ya están listas para usar.
    NOTA: Se requieren un total de dos separaciones de 5 minutos en el imán.
  8. Lave las células CD14 clasificadas empleando 1x tampón PBS-2% FBS, llevando la suspensión de la célula a 12-14 mL para diluir cualquier EDTA restante, y luego centrifugar a 600 × g (aceleración y desaceleración máximas) durante 10 min.
  9. Deseche el sobrenadante y repita el lavado volviendo a suspender el pellet de celda con 1 mL de tampón FBS 1x PBS-2% primero y luego rellenando el volumen a 12-14 mL. Centrifugar los tubos a 600 × g (aceleración y deceleración máximas) durante 10 min.
  10. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los monocitos CD14 positivos seleccionados en 2 mL de tampón FBS 1x PBS-2%. Utilice el contador automático de células o cuente las células diluyendo la suspensión celular (1:5) en frío estéril 1x PBS y luego (1:2) en azul de tripán utilizando un microscopio óptico. Deje las células en hielo hasta la preparación del cultivo.
    NOTA: La pureza celular se puede probar mediante citometría de flujo, tomando 50 μL de la suspensión celular y tiñéndola para células CD14+ (clon HCD14). Se recomienda más del 90% de pureza.
  11. Para el cultivo, centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 5 min a 8-10 °C. Vuelva a suspender el pellet a una concentración de 106 células/mL utilizando RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS inactivado y 1% de penicilina-estreptomicina (RPMI-10% FBS-1% P/S).
    NOTA: Es fundamental utilizar un FBS de alta calidad, bajo en endotoxinas e inactivado por calor. Mantener siempre en hielo para evitar la adherencia de los monocitos a la pared de plástico antes de enchapar.

3. Diferenciación y polarización de macrófagos derivados de monocitos (M-DM)

NOTA: El cultivo M-DM se realiza mediante la siembra de 2,5 ×10 5 monocitos CD14+ en placas de 48 pocillos que contienen 500 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S y se cultiva en una incubadora humidificada a 37 °C con CO2 (5%) durante 7 días. Elija placas tratadas para mejorar la adherencia de los monocitos a la placa.

  1. Defina todas las condiciones experimentales a ejecutar, incluidos los pocillos para M-DM basal (M0), el M1 inflamatorio, el M2a de reparación de tejidos, el M2c regulador y las condiciones de prueba deseadas.
  2. Pipetear 250 μL de la suspensión celular preparada en el paso 2.11 para sembrar 2,5 ×10 5 monocitos CD14+ en cada pocillo.
  3. Agregue 250 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S más 50 ng/mL de M-CSF a cada pocillo para completar los 500 μL de volumen total.
  4. Incubar la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 días para permitir el primer paso de la diferenciación de macrófagos.
    NOTA: Verifique periódicamente la diferenciación del cultivo celular para ver si se produjeron cambios morfológicos como se esperaba o si existen células no adheridas no deseadas.
  5. Reemplace la mitad del medio de cultivo (250 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S) en el día 4 del cultivo M-DM. Agregue citocinas o reactivos para las condiciones de polarización y cultive durante 3 días (el criterio de valoración es el día 7): LPS (1 ng/mL) más IFNγ (50 ng/mL) para M1, IL-4 (40 ng/mL) para M2a, IL-10 (50 ng/mL) o dexametasona (0,1 μM) para M2c.
  6. Coseche M-DM el día 7 para realizar la caracterización fenotípica, recolecte para la expresión de ARNm como se indica en los dos pasos siguientes o realice un ensayo funcional.

4. Caracterización del fenotipo superficial en M-DM polarizado por citometría de flujo

  1. Deseche el volumen total del medio de cultivo (500 μL de una placa de 48 pocillos) y agregue 200 μL de tampón EDTA 1x PBS-2% FBS-1 mM para la recolección de células. Incubar durante 20 minutos en hielo y luego agregar 200 μL de 1x PBS-2% FBS para diluir el tampón EDTA. Recoja el M-DM pipeteando hacia arriba y hacia abajo en microtubos de 1,5 mL. Lave estas células recolectadas una vez con 1x PBS-2% FBS y centrifugue a 800 × g durante 3 min.
  2. Vuelva a suspender el pellet M-DM con 200 μL de 1x PBS-5% FBS y transfiéralos a una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos para bloquearlos a temperatura ambiente durante 15 min. Centrifugar las células a 800 × g durante 3 min.
  3. Prepare la combinación adecuada de anticuerpos directamente conjugados en 1x PBS- 2% FBS. Teñir cada pocillo o condición (1x) con 50 μL del panel de anticuerpos e incubar a 4 °C durante 30 min en la oscuridad.
    NOTA: En este caso, el panel de anticuerpos consistió en CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 y MERTK-biotina más estreptavidina-PE. La concentración de anticuerpos pretitulados se muestra en la Tabla 1.
  4. Lavar el M-DM manchado añadiendo 150 μL de 1x PBS y centrifugar a 800 × g durante 3 min.
  5. Para medir la viabilidad celular, añadir 100 μL del colorante de viabilidad fijable Zombie Violet (1:1.000 en 1x PBS) e incubar a 4 °C durante 30 min en la oscuridad.
  6. Lave las células teñidas añadiendo 100 μL de 1x PBS y centrifugue a 800 × g durante 3 min. Repita el procedimiento de lavado con 200 μL de 1x PBS.
  7. Fijar resuspendiendo el pellet M-DM con 100 μL del reactivo fijador (del kit fijador/permeabilización) e incubándolos durante 20 min en hielo y en la oscuridad.
    NOTA: Para conseguir una correcta fijación, es fundamental homogeneizar correctamente el pellet celular.
  8. Lave el M-DM añadiendo 100 μL de 1x PBS-2% FBS y centrifugue a 800 × g durante 3 min. Repita el procedimiento de lavado utilizando 200 μL de 1x PBS-2% FBS.
  9. Vuelva a suspender el pellet M-DM en 200 μL de 1x PBS y ejecute las células teñidas en el citómetro de flujo.

5. Perfil del programa genético para discriminar la polarización M-DM por qPCR

NOTA: En el día 7 del cultivo, se pueden recolectar 2,5 × 105 M-DM utilizando el reactivo de extracción de ARN para el aislamiento de ARN total de alta calidad. El aislamiento de ARN también se puede realizar utilizando métodos alternativos, como la extracción de ARN basada en columna y un kit de elución.

  1. Deseche el volumen total del medio de cultivo y el M-DM lisado añadiendo directamente 350 μL del reactivo de extracción. Homogeneizar y transferir esta suspensión celular a un microtubo de 1,5 mL libre de RNasa/DNasa y continuar con el aislamiento de ARN
    NOTA: Si el aislamiento del ARN no se va a realizar el mismo día, la muestra del paso 5.1 puede almacenarse a 4 °C durante la noche o -20 °C durante un máximo de un año.
  2. Para permitir la disociación completa del complejo de nucleoproteínas, incubar las muestras homogeneizadas del paso 5.1 durante 5 min a 25 °C
  3. Añadir 70 μL de cloroformo a cada muestra. Tape firmemente cada tubo para evitar fugas y mezcle bien el contenido agitando el tubo. Incubar las muestras durante 2-3 min y luego centrifugar las muestras a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C. Este paso separará completamente las fases en una fase inferior de fenol-cloroformo, una interfase y una fase acuosa superior incolora.
    NOTA: El volumen de cloroformo se basa en una proporción de 0,2 mL de cloroformo por 1 mL de reactivo de extracción utilizado durante la etapa de lisis.
  4. Transfiera la fase acuosa que contiene el ARN a un nuevo microtubo de 1,5 mL libre de ARNasa/DNasa.
    NOTA: Deje un pequeño volumen al tomar la fase acuosa para evitar transferir alguna de las capas de interfase u orgánicas.
  5. Agregue 175 μL de isopropanol a cada muestra para precipitar el ARN. Incubar durante 10 min a 4 °C o, alternativamente, toda la noche a -20 °C.
    NOTA: El volumen de isopropanol se basa en una proporción de 0,5 mL de isopropanol por mL de reactivo de extracción inicial.
  6. Centrifugar las muestras a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. Una bolita blanca de ARN total se precipitará en el fondo del tubo. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante con una micropipeta.
  7. Lave el ARN resuspendiendo el gránulo blanco en forma de gel en 350 μL de etanol al 75% (1 mL por 1 mL de reactivo de extracción (v/v) utilizado para la lisis).
    NOTA: El ARN puede almacenarse en etanol al 75% durante un máximo de 1 año a -20 °C o hasta 1 semana a 4 °C.
  8. Agite brevemente el pellet resuspendido y centrifugue a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C. Retire y deseche el sobrenadante con una micropipeta. Seque al aire o al vacío el pellet de ARN durante 5-10 min.
    NOTA: Para solubilizar el ARN, evite el secado excesivo de la pelletza de ARN.
  9. Vuelva a suspender el pellet en 20-30 μL de agua libre de RNasa pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar en un baño de agua o bloque de calor ajustado a 55-60 °C durante 10-15 min. Proceda a medir la concentración de ARN y almacene el ARN a -70 °C.
  10. Realice la transcripción inversa (copia de ADNc) utilizando 100-500 ng de ARN (mínimo y máximo, respectivamente) en 20 μL de volumen de reacción empleando un kit de síntesis de ADNc.
  11. Ejecute las reacciones de PCR en tiempo real utilizando 1 μL de ADNc (5-25 ng).
    1. Prepare la mezcla de reacción para cada tubo (1x) utilizando 5 μL de mezcla verde SYBR (2x), 0,2 μL de cada cebador (hacia adelante y hacia atrás) y 3,6 μL de agua sin nucleasas. Escale todos los componentes de acuerdo con el número de muestra. Mezcle bien la mezcla de reacción y dispense 9 μL en cada tubo de qPCR y, finalmente, 1 μL de ADNc para alcanzar el volumen total final de 10 μL.
    2. Programe el protocolo de ciclo térmico en un instrumento de PCR en tiempo real de la siguiente manera: 2-3 min a 98 °C (1x); 5-15 s a 98 °C más 15-30 s a 60 °C (35-40x); finalmente incluya el análisis de la curva de fusión (65-95 °C) con incrementos de 0.5 °C a 2-5 s/paso o use la configuración predeterminada del instrumento.
      NOTA: Esta reacción se estandarizó empleando la mezcla universal SYBR Green. Los cebadores recomendados para el análisis de polarización M-DM se enumeran en la Tabla 2.
  12. Normalizar los resultados utilizando como gen de referencia el factor de elongación de la traducción eucariota 1 alfa 1 (EEF1A1), y comprobar la especificidad de los productos amplificados mediante el análisis de las curvas de disociación.
    NOTA: El análisis de la curva de disociación permite confirmar la presencia de un solo producto de amplificación de qPCR en la reacción.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Basándonos en nuestro trabajo en la caracterización de macrófagos durante varios años, hemos establecido una combinación precisa de marcadores que distingue claramente los diferentes subconjuntos de M-DM in vitro. Los marcadores de fenotipo se seleccionaron en base a la literatura y a un amplio cribado previo que habíamos realizado previamente9,14,15,16,17<...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La diferenciación, activación y polarización de macrófagos se han convertido en un enfoque central en inmunología, homeostasis tisular, patogénesis de enfermedades y resolución de inflamación. Además, la imagen emergente de que los macrófagos tisulares pueden derivarse de monocitos circulantes en condiciones de homeostasis alterada enfatiza la necesidad de modelos precisos de M-DM caracterizados por fenotipos, programas transcripcionales y vías de activación definidos.

Algunos pasos críticos e...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Agencia Nacional de Promoción de la Ciencia y la Tecnología (ANPCyT-FONCYT) a través de las subvenciones PICT 2018-3070 y 2021-I-A-00807 a la E.A.C.S. y PICT 2021-I-A-00716 a la A.E.E, y por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) a través de la beca PIP 2022-0763 y por la Universidad de Buenos Aires a través de Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 a A.E.E. E.A.C.S. y A.E.E. son investigadores de carrera en el CONICET.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alexa Fluor 488 ratón anti-humano  Clon de anticuerpo CD206 15-2BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Gato# 321113; RRID:AB_571874
clon del anticuerpo CD64 antihumano del ratón APC 10.1BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Gato# 305013; RRID:AB_1595539 clon de
anticuerpo CD11b humano anti-ratón / Cy7 rata APC / Cy7 BioLegend M1/70San Diego, CA, EE. UU.Gato# 101226; RRID:AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San José, CA, EE. UUKit de fijación/permeabilizaciónCat# 554714
de anticuerpo MERTK antihumano de biotina 590H11G1E3BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Gato# 367616; RRID:AB_2721500 
Equipo CFX-Connect Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU
Kit de selección positiva EasySep Human CD14; Cóctel EasySep Selección Positiva; Nanopartículas magnéticas EasySep; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadáCat# 18058
Citómetro FACS Canto Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos.
Suero fetal bovino, calificado, Nueva Zelanda  Gibco&comercio;   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA EE. UU.  		Cat# 10091148
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Carlsbad, CA, EE. UU.  		Cat#  15596026reactivo de extracción de ARN
Zombie Violet Fixable Viability Kit BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Gato# 423113
, . clon . . .

Referencias

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