El presente protocolo describe un método escalonado para analizar la mecánica respiratoria de un modelo murino ex vivo utilizando la técnica de oscilación forzada (FOT).
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Artículo de método
Evaluación de la función pulmonar en un modelo murino ex vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
La mecánica respiratoria es un área de estudio clave en la definición y el tratamiento de las patologías pulmonares mediante la evaluación de la capacidad pulmonar funcional. La mecánica pulmonar se puede evaluar a través de varias maniobras pulmonares que involucran diferentes formas de onda oscilatorias. Cuando se aplican a los pulmones, estas maniobras miden múltiples variables, como la presión, el volumen y el flujo, en función de la respuesta a las formas de onda. A continuación, estas señales se calculan y analizan para determinar parámetros como la histeriedad, la resistencia, la distensibilidad, la amortiguación de los tejidos y la elastancia de los tejidos, lo que proporciona una evaluación detallada de la función pulmonar general. El análisis de la mecánica respiratoria es particularmente importante en la evaluación de pulmones de donantes para el trasplante de pulmón. El presente protocolo es el primero de su tipo, y ofrece un método escalonado completo y reproducible para evaluar la mecánica respiratoria utilizando un modelo murino ex vivo . Incluye detalles sobre el modelo animal seleccionado, la recuperación, el almacenamiento y la preservación pulmonar, y la experimentación mediante un sistema basado en la técnica de oscilación forzada. Además, describe el análisis de datos, la importancia clínica y las aplicaciones de la técnica de oscilación forzada en el estudio de un modelo ex vivo .
Introducción
El trasplante de pulmón representa el único tratamiento duradero para las enfermedades pulmonares terminales. Aproximadamente 4.600 personas reciben trasplantes de pulmón cada año en todo el mundo, pero casi 600 pacientes mueren en la lista de espera debido a la escasez de pulmones de donantes adecuados 1,2. En los esfuerzos por aumentar la reserva de pulmones disponibles, los sistemas de asignación de donantes se ajustan continuamente, lo que ha llevado a los cirujanos a viajar distancias más largas para asegurar losórganos de los donantes. El aumento de las distancias aumenta invariablemente el tiempo de isquemia fría, lo que presenta la necesidad de métodos adicionales de preservación de órganos.
El estándar actual para la preservación de órganos de donantes para el trasplante de pulmón es la preservación estática en frío a 4 °C, lo que limita el tiempo de conservación a 6-8 h, una pequeña ventana de viabilidad para el trasplante4. Sin embargo, con distancias de viaje más largas y el consiguiente aumento de los tiempos isquémicos, la evaluación de la función pulmonar antes del trasplante es de vital importancia4. Con la evolución de las políticas para el trasplante de pulmón, se han llevado a cabo investigaciones novedosas para abordar esta necesidad. Recientemente, los estudios han sugerido que la conservación estática en frío a 10 °C es una temperatura de almacenamiento más óptima para la preservación pulmonar con la consiguiente mejora de la función pulmonar, la resistencia a las lesiones y tasas comparables de disfunción primaria del injerto cuando se implanta 4,5,6,7,8. Además, la investigación centrada en la perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) ha demostrado una mejora significativa en la utilización del pulmón del donante y en los trasplantes sin detrimento para los receptores9. Si bien el uso de EVLP para ampliar el grupo de donantes para el trasplante de pulmón y extender el tiempo de preservación está bien documentado, esta tecnología es costosa, requiere mucho tiempo y requiere capacitación especializadapara realizarla. Como tal, existe la necesidad de métodos adicionales para estudiar la función pulmonar ex vivo que sean completos, económicos y reproducibles.
Las medidas tradicionales de la mecánica pulmonar, por ejemplo, las curvas de distensibilidad, resistencia, elastancia y presión-volumen, se pueden determinar de forma fiable mediante pletismografía corporal o con técnicas de ventilación mediante un modelo de compartimento único. Se pueden obtener mecanismos más detallados utilizando el modelo de oscilación forzada para ajustarse al modelo de fase constante, que puede dividir la mecánica de las vías respiratorias en compartimentos centrales y periféricos (resistencia newtoniana, amortiguamiento/elastancia de tejidos, histeria)11. Si bien la aplicación de estas técnicas es reproducible y completa, una limitación hasta ahora ha sido el requisito de realizar tales medidas en un modelo in vivo, presumiblemente porque el pulmón exangüe pierde estructura en el anillo de entrada alveolar12. Este estudio utilizó un ventilador de roedores pequeños basado en la técnica de oscilación forzada disponible comercialmente con el objetivo de desarrollar un modelo ex vivo para caracterizar mejor la mecánica pulmonar para aplicaciones de trasplante de pulmón.
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Animal de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Se utilizaron ratones de tipo salvaje C57Bl/6, de 6-8 semanas de edad y con un peso de entre 18 y 28 g. Los detalles de los reactivos y el equipo se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Preparación
- Utilice un microscopio quirúrgico con un aumento de hasta 20x para todos los procedimientos quirúrgicos.
- Limpie y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos antes de comenzar el procedimiento. Instrumentos de autoclave o utilice una solución esterilizante adecuada para mantener las condiciones asépticas.
2. Extracción de pulmones de donantes
- Realizar todas las operaciones en condiciones estériles.
NOTA: Este paso se realiza en un espacio quirúrgico dedicado y en condiciones estériles. - Colocar al ratón en una cámara de inducción anestésica e inducir la anestesia con isoflurano al 5% en oxígeno y mantener la anestesia con isoflurano al 3,5% en oxígeno durante todo el procedimiento (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
- Registre el peso del ratón antes de la primera incisión.
- Asegure el mouse en la mesa de operaciones y asegure la profundidad adecuada de la anestesia aplicando presión en un dedo del pie. Si el ratón se retira con dolor, aumente la anestesia según sea necesario.
- Extraer los pulmones del donante siguiendo el procedimiento estándar13.
NOTA: Los pulmones y el corazón se extrajeron en bloque para perfundir los pulmones ex vivo, y se extrajo una parte de la tráquea para su posterior intubación.
3. Almacenamiento y preservación de pulmones
- Una vez extraídos los pulmones del donante, se intuba la tráquea con un angiocatéter intravenoso de 18 G avanzando con cuidado el catéter, asegurándose de que no perfore la tráquea.
- Asegure la tráquea sobre la cánula con una sutura de seda 3-0, asegurando un sellado hermético. Avance el angiocatéter intravenoso de 18 G hasta que esté dentro del tracto de salida del ventrículo derecho (TSVD), justo después de la válvula pulmonar.
- Registre la hora en que se extrajeron los pulmones del cuerpo.
- Almacene los pulmones en un tubo cónico de 50 ml que contenga la solución de conservación disponible en el mercado a 4 °C o 10 °C durante la noche.
4. Configuración y calibración
- Comience por encender el sistema y/o el software.
- Inicie el programa, haga clic en el botón Crear un nuevo estudio y siga las instrucciones en pantalla para definir el protocolo y asignar materias.
- Haga clic en Sesión de experimentación e inicie sesión con las iniciales del nombre y apellido del usuario.
- Comience a etiquetar los temas mediante una convención de nomenclatura coherente.
- Ingrese la información de sexo, fecha de nacimiento y peso de cada sujeto.
- Seleccione y asigne sujetos al sitio de medición y confirme los pesos.
- Continúe con la configuración y la calibración del software siguiendo las instrucciones en pantalla.
NOTA: Durante la calibración del tubo, el mismo tipo de cánula utilizada en la intubación de los pulmones del donante se conectó al tubo en Y del sistema para garantizar la consistencia. - Repita la calibración si los valores de calibración se encuentran fuera de los rangos aceptados.
- Cancele las indicaciones para comenzar la ventilación hasta que esté listo. Las sesiones experimentales con ventilación y registro de datos se pueden iniciar más adelante.
5. Ventilación pulmonar y adquisición de datos
- Retire los pulmones del tubo cónico de 50 ml. Enjuague el tracto de salida del ventrículo derecho (TSVD) utilizando el angiocatéter intravenoso de 18 G previamente colocado con solución de conservación adicional a una dosis de 60 mL/kg para lavar los capilares pulmonares.
NOTA: Se debe tener mucho cuidado para evitar la deshidratación de los pulmones del donante, ya que este es un factor de confusión conocido en el estudio de la mecánica pulmonar. - Asegure los pulmones del donante a la máquina de ventilación y comience el experimento.
- Haga clic en Iniciar ventilación y, cuando esté listo, presione Iniciar grabación para comenzar la sesión experimental.
NOTA: El ventilador utilizado para este estudio estaba configurado para tener una frecuencia respiratoria de 150 respiraciones/min, un volumen corriente de 10 mL/kg y una PEEP de 3. - Ejecute cada tarea haciendo doble clic en la tarea para evaluaciones de mecánica pulmonar de la lista de tareas en el lado derecho de la página.
- Ejecute la tarea Inflación profunda ubicada en la lista de tareas para asegurarse aún más de que se recluten las regiones atelectáticas y se hayan estandarizado los volúmenes pulmonares. Para obtener más información, consulte la sección Resultados.
- Continúe con la secuencia de tareas.
NOTA: La función pulmonar se puede evaluar a través de múltiples tareas de evaluación de propiedades mecánicas. Deep Inflation estandariza el volumen pulmonar, mientras que Prime-8 estabiliza la mecánica pulmonar. PV-P y PV-V miden la distensibilidad estática y dinámica, la resistencia de las vías respiratorias y la conductancia. Snapshot 150 proporciona una evaluación rápida de la resistencia, la distensibilidad y la elastancia, mientras que QuickPrime evalúa la resistencia de las vías respiratorias y los tejidos junto con la viscoelasticidad pulmonar. Estas tareas garantizan colectivamente un análisis exhaustivo de la función pulmonar. En este artículo, se proporcionan los datos de las tareas realizadas en Deep Inflation, Snapshot 150 y QuickPrime (utilizando equipos disponibles en el mercado) como resultados representativos. Los volúmenes pulmonares se estandarizaron entre las perturbaciones utilizando la tarea de inflación profunda con el fin de minimizar las variables de confusión al interpretar los datos. - Ejecute la secuencia de tareas elegida por triplicado.
- Haga clic en Detener grabación y luego en Detener ventilación.
- Exporte los datos individualmente o continúe con el siguiente tema y repita los pasos 5.1-5.9.
NOTA: Para los datos derivados de las perturbaciones Snapshot 150 y QuickPrime, se requiere una DQO de >0,95 para un análisis fiable.
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Resultados
Se proporciona una representación gráfica del diseño experimental para el modelo de ratón (Figura 1). Los pulmones se inflaron utilizando un sistema de ventilación de roedores pequeños basado en la técnica de oscilación forzada disponible en el mercado para evaluar la mecánica respiratoria del tejido donante en diversas condiciones (Figura 2). Al comparar los resultados entre los grupos de pulmones de donantes preservados, se encontró que los grupos de pulmones ...
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Discusión
Importancia y posibles aplicaciones
La mecánica respiratoria se utiliza de forma rutinaria en diversas aplicaciones para estudiar la patología pulmonar y las lesiones pulmonares. El estudio de la mecánica respiratoria ha sido descrito en numerosas ocasiones para la progresión de enfermedades como el SDRA y en casos de ventilación asistida, pero ha sido descrito mucho menos en la literatura en lo que se refiere al trasplante de órganos 15,16,17,18,19....
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Divulgaciones
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo sin ninguna relación comercial o financiera que pudiera malinterpretarse como un conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Sophie Paczensy por el uso del sistema de ventilación y a Colin Welsh por su ayuda. La Figura 1 se creó utilizando biorender.com. Esta investigación fue apoyada por una beca del Instituto Clínico y Traslacional de Carolina del Sur (NIH/Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales) bajo el número de premio UL1-TR001450.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Angiocatéter de 18 G | B. Braun | 4251687-02 | Buje recto |
| 24 G angiocatéter | B. Braun | 4251601-02 | |
| Jeringa de 3 mL | Fisher Scientific | 14-823-41 | |
| 3-0 sutura de seda | Medex | ETH-A304H | |
| Tubos cónicos de 50 mL | Thermo Fisher | 339652 | |
| 70% EtOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Cámara de inducción de anestesia | Harvard Apparatus | 75-2030 | Cámara de inducción hermética para ratas |
| Máquina de anestesia | Harvard Apparatus | 75-0238 | Sistema de anestesia móvil con barrido pasivo |
| Máscara de anestesia | Harvard Apparatus | 59-8255 Máscara de | anestesia para ratas |
| Micro pinzas romas | Mundo Precision Instruments | 501217 | Pinzas de vendaje, 12,5 cm, rectas, dentadas |
| C57Bl/6 ratones | Charles River | Strain Code 027 | Tipo salvaje, 6-8 semanas, 18-28g |
| Báscula de peso digital | Fisher Scientific | S72422 | |
| Sistema FlexiVent | Scireq | NC2926059 | ventilador para roedores pequeños basado en la técnica de oscilación forzada |
| Jeringa de insulina, 1 | mL Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Isoflurano, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Microscopio quirúrgico o lupas quirúrgicas | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x - 90x Microscopio estereoscópico |
| Perfadex solución | Xvivo | 19811, 19850 | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Bastoncillos de algodón estériles | Puritan | 25-806 1WC | |
| Esponjas de gasa estériles | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Tijeras quirúrgicas | World Precision Instruments | 1962C | Tijeras Metzenbaum |
Referencias
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