Flujo de trabajo de imágenes y análisis de alto rendimiento para evaluar los fenotipos de las células de la piel y los estados de proliferación en muestras de tejido

La piel es el órgano más grande del cuerpo humano y la barrera primordial para proteger el cuerpo del entorno exterior¹. En consecuencia, está expuesto a una gran cantidad de desafíos externos que comprometen su función de barrera. Por lo tanto, la piel ha desarrollado mecanismos complejos para restaurar la integridad y funcionalidad de los tejidos después del daño. La cicatrización de heridas en la piel se lleva a cabo en tres etapas superpuestas: inflamación, proliferación y maduración/remodelación. Estas tres etapas involucran varios tipos de células diferentes, como fibroblastos dérmicos y células inmunes, que actúan juntas para restaurar las propiedades biológicas iniciales del tejido cutáneo lesionado ^1,2,3.

La piel es un órgano densamente inervado, y se sabe que la inervación nerviosa es crucial para un proceso de reparación exitoso ^4,5,6. Además de la señalización axonal ^4,7,8, la glía periférica, que normalmente envuelve los axones, participa en la regeneración exitosa del tejido ^9,10,11. Sin embargo, el papel de los tipos de células subrepresentadas, como las células gliales periféricas, sigue siendo poco conocido en procesos dinámicos como la regeneración del tejido cutáneo. Para determinar mejor la función de estas células, es fundamental analizar el microambiente celular y los tipos de células vecinas con las que pueden interactuar durante el proceso regenerativo. Además, dado que la proliferación celular es una etapa clave para la regeneración de tejidos, es importante detectar y clasificar con precisión los tipos de células proliferantes a lo largo del proceso de reparación.

Se han desarrollado métodos de imágenes ópticas multiplexadas y de alto contenido, como IBEX¹², para caracterizar la composición celular, visualizar y cuantificar las interacciones célula-célula y diseccionar patrones microambientales dentro de tejidos complejos con resolución espacial. Mientras que otros métodos de multiplexación requieren instrumentos especializados y reactivos patentados, una ventaja particular de IBEX es que se puede establecer a costos relativamente bajos utilizando anticuerpos, reactivos y microscopios disponibles comercialmente accesibles en un entorno de investigación estándar. Si bien los anticuerpos anti-Ki-67, a menudo utilizados en los paneles IBEX, marcan de manera confiable los tipos de células proliferantes en muchos tejidos^13,14, se encontró que el número de células Ki-67 positivas (Ki-67+) estaba subestimado en comparación con otras metodologías en secciones de tejido congelado fijo de heridas cutáneas murinas agudas. Por lo tanto, combinamos la química de Click-iT EdU con IBEX y descubrimos que el número de células EdU⁺ representa con mayor precisión el número total de células proliferantes obtenidas por otras metodologías.

Además, al emplear un microscopio confocal de disco giratorio totalmente automatizado, se estableció un flujo de trabajo de alto rendimiento para obtener imágenes iterativas de secciones de tejido colocadas en una placa de 24 pocillos. Las imágenes resultantes se procesan combinando múltiples herramientas de Python de código abierto en una novedosa canalización de procesamiento de imágenes que corrige las imágenes para una iluminación desigual, realiza la unión de los mosaicos individuales y, en última instancia, el registro de imágenes. En detalle, se utilizó la biblioteca BaSiCPy¹⁵ para la corrección de la iluminación, la biblioteca m2stitch para unir las imágenes y la correlación cruzada de fase para el registro del ciclo. Las imágenes registradas se guardan como OME-TIFF y luego se pueden cargar en software de análisis de imágenes convencional, como Fiji¹⁷ y QuPath¹⁸, donde las imágenes se procesan y se puede realizar la categorización del tipo de celda y otras mediciones, como cálculos de intensidad y distancia. En conjunto, el presente protocolo nos permitió realizar una caracterización detallada y altamente eficiente de los principales tipos de células de la piel en regeneración, con un enfoque particular en el microambiente celular que rodea a la población de células gliales periféricas.

Toda la cría, el alojamiento y la experimentación de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la oficina veterinaria del Cantón de Zúrich, Suiza.

1. Heridas cutáneas de espesor total (Día 0)

1. Induzca ratones de 8 a 10 semanas de edad con isoflurano al 5% en O₂ al 70% y manténgalo usando isoflurano al 2,5%.
2. Afeita la piel de la espalda y límpiala a fondo.
3. Desinfecte antes de la cirugía con jabón antibacteriano y solución de EtOH al 70%.
4. Aplicar analgesia preoperatoria mediante una inyección subcutánea de buprenorfina (30 μg∙mg∙kg⁻¹).
5. Genere cuatro heridas circulares por escisión de espesor total de 5 mm de diámetro en la piel de la parte inferior de la espalda de cada animal, dos a cada lado, a 1 cm de la línea media del animal y aproximadamente a 2 cm de distancia entre sí¹⁹.
6. Realizar analgesia postoperatoria con un tratamiento de 3 días de buprenorfina a través del agua de bebida (9 μg/mL con sacarosa al 2%).
7. Deje que las heridas sanen sin vendar.
8. Recoger las heridas en puntos de tiempo definidos para el examen histológico y el análisis de citometría de flujo.
9. Para el protocolo IBEX, diseccionar y fijar los tejidos de la piel con una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C durante la noche. Utilice una cápsula de biopsia disponible en el mercado para evitar que las muestras se enrollen durante la fijación. Crioproteger los tejidos fijados con PFA al 4% en sacarosa al 30% en PBS durante la noche a 4 °C. Transfiera los tejidos a una mezcla 1:1 de sacarosa al 30% con compuesto OCT durante 2 h a temperatura ambiente y finalmente insértelos en OCT antes de congelarlos rápidamente en isopentano.

2. Preparación de la muestra (Día 1)

1. Cubra la placa de 24 pocillos con 200 μL de gelatina de alumbre de cromo durante 15 minutos en una coctelera basculante. A continuación, retirar completamente la gelatina y secar los pocillos recubiertos durante 60 min en un horno a 40 °C. Cubra el doble de los pocillos necesarios como respaldo. Agregue 2 ml de PBS por pocillo.
   NOTA: Asegúrese de que el recubrimiento esté completamente seco antes de colocar el pañuelo. Los pocillos también se pueden recubrir un día antes y secar durante la noche a temperatura ambiente. Una vez recubiertos, no guarde los pocillos recubiertos en el refrigerador o congelador, y para obtener mejores resultados, use la placa recubierta de 24 pocillos dentro de 1-2 días.
2. Corte el tejido incrustado en OCT a un grosor de 15-30 μm en el criostato y transfiéralo rápidamente a un pocillo recubierto que contenga 2 ml de PBS.
   NOTA: El tejido se puede transferir con una espátula de metal o fórceps.
3. Retire con cuidado el PBS con una pipeta de 1 ml, con el objetivo de mantener la sección de tejido centrada en el pocillo. Para hacer esto de manera efectiva, aspire lentamente el PBS desde los bordes del pocillo, ajustando la posición de la pipeta según sea necesario para evitar que el tejido se mueva.
   NOTA: La colocación precisa del tejido es esencial para el éxito del protocolo. Una vez que el tejido se adhiere a la superficie recubierta, no se puede reposicionar.
4. Secar las secciones de tejido durante 1 h en un horno a 37 °C.

3. Bloqueo tisular, reacción EdU Click-iT e inmunomarcaje de anticuerpos, ciclo 1 de IBEX (día 1)

1. Rehidratar con 1 mL de PBS durante 5 min.
2. Permeabilizar el tejido con 500 μL de Tritón al 0,5% en PBS durante 30 min a RT.
3. Lave el pañuelo brevemente 2 veces con PBS.
4. Realice la reacción Click-iT, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Mantenga las muestras protegidas de la luz.
5. Lave el pañuelo brevemente 2 veces con PBS.
6. Bloquee el tejido durante 1 h a temperatura ambiente (RT) usando un tampón de bloqueo.
   NOTA: Aquí, se usó suero de burro al 10% en PBS para este experimento, pero esto se puede ajustar según sea necesario; Cualquier tampón de bloqueo compatible con los protocolos estándar de inmunoetiquetado es adecuado.
7. Aplicar anticuerpos primarios (diluidos en tampón de bloqueo; ver la tabla de materiales) para el 1er ciclo durante la noche a 4 °C.
   NOTA: El bloqueo y el inmunomarcaje también se pueden realizar durante ~ 1 h utilizando un microondas sin calentamiento, como se describe en Radtke et ^al.12. Sin embargo, para las heridas cutáneas, la mejor relación señal-ruido se obtiene cuando los anticuerpos primarios se incuban durante la noche. Las secciones de tejido inmunomarcadas se pueden almacenar en PBS durante varios días antes de la obtención de imágenes. Se recomienda la obtención de imágenes al día siguiente para una calidad de señal óptima.

4. Inmunomarcaje secundario de anticuerpos y contratinción nuclear (día 2)

1. Lave los pocillos con 3 x 1 ml de PBS.
2. Incubar la sección de tejido con la tinción secundaria de anticuerpos anti-conejo (1:300) en solución de bloqueo, junto con contratinción nuclear Hoechst 1:1.000, durante 1 h a RT en la oscuridad.
3. Lavar 3 x 5 min con 1 ml de PBS a temperatura ambiente.
4. Deje ~ 500 μL de PBS en cada pocillo y lleve la placa al microscopio.
   NOTA: Este puede ser un punto de pausa: las muestras son estables durante varios días a 4 °C, pero la relación señal-ruido es la mejor cuando se obtienen imágenes dentro de las 24 h posteriores al inmunomarcado.

5. Configuración del microscopio e imágenes del primer ciclo IBEX (Día 2)

1. Inicie sesión en el microscopio, cargue el software e inicie sesión en el perfil de usuario.
2. Introduzca la configuración de adquisición (abrir a través de Cribado | Configuración de adquisición) para la configuración del protocolo y la adquisición de imágenes.
3. Utilice el botón Expulsar para cargar la placa en el microscopio.
4. Limpie el fondo de la placa de 24 pocillos con etanol al 70% justo antes de colocar la placa en el microscopio. Haga clic en el botón Cargar placa para cargar la placa en el microscopio.
5. Seleccione el modo de ampliación y adquisición deseado en Objetivo y cámara. Como modo de adquisición , seleccione el modo de hendidura confocal de 51 μm .
   NOTA: Aquí, se utilizó un objetivo de inmersión en agua de 20x con una apertura numérica de 0,95 y un disco giratorio con orificios de 50 μm, espaciados a 250 μm para el experimento.
6. En la pestaña Placa , seleccione el modelo de placa utilizado.
7. Vaya a la pestaña Plato/Sitios para visitar. En las opciones del sitio, haga clic en Número fijo de sitios. Elija el número de columnas y filas de modo que se cubra aproximadamente todo el pozo. Haga clic en Superponer sitios 10%.
   NOTA: Este botón debe activarse para garantizar la unión de los mosaicos individuales.
8. Seleccione solo el primer pozo lleno para la adquisición haciendo clic con el botón derecho en el pozo correspondiente en el mapa de pozos. Los pocillos seleccionados son verdes y los pocillos no seleccionados son grises.
9. Mueva el escenario a una posición donde debería estar el tejido haciendo clic con el botón izquierdo en el primer pocillo lleno en el mapa de placas y en un sitio cerca del centro en el mapa del sitio. Busque un color más oscuro del pozo y el sitio que indique la posición actual.
10. Vaya a la pestaña Adquisición . Seleccione las opciones Habilitar enfoque basado en láser y Adquirir serie Z.
11. Vaya a la pestaña Adquisición/Enfoque automático . Para Enfoque automático de pocillo a pozo, seleccione la opción Enfoque en la placa y en la parte inferior del pozo , y para Enfoque automático del sitio, seleccione la opción Todos los sitios .
12. Vaya a la pestaña Longitudes de onda y elija el número de tintes que se van a fotografiar en el ciclo actual. Busque el número correspondiente de nuevas pestañas que se abren debajo de la pestaña Longitudes de onda .
13. Vaya a la primera pestaña de longitud de onda. En Iluminación, seleccione la configuración de filtro más adecuada para el fluoróforo de interés (por ejemplo, elija DAPI si se usó Hoechst).
14. Elija Láser con desplazamiento z para el posicionamiento z y haga clic en el botón Calcular desplazamiento para establecer la altura de imagen correcta. Se adquirirán una serie de imágenes en diferentes posiciones z. Elija aquel en el que la muestra esté mejor enfocada.
    NOTA: Asegúrese de que la posición de la platina esté configurada en un lugar con tejido. Si no hay tejido visible en esta posición, seleccione un sitio diferente e inténtelo de nuevo (consulte el paso 4.9).
15. Presione el botón Focus y espere a que se muestre una imagen enfocada del tejido.
16. En Potencia de iluminación, elija 50 %. Introduzca 2000 para la intensidad máxima del objetivo y pulse Exposición automática para ajustar el tiempo de exposición automáticamente.
    NOTA: Para acelerar la adquisición, se puede aumentar la potencia del láser, lo que debería reducir el tiempo de exposición. Sin embargo, esto podría conducir a más fotoblanqueo, lo que conducirá a artefactos de imagen donde los mosaicos individuales se superponen.
17. En Serie Z, elija Serie Z e Imagen de proyección 2D, y en Corrección de sombreado, elija Solo sombreado FL.
18. Repita los pasos 5.13-5.17 para las otras longitudes de onda, pero en lugar de Láser con desplazamiento z, elija Desplazamiento Z de W1 y elija 0.
19. Vaya a la pestaña Serie Z . Introduzca el tamaño de paso deseado (para el objetivo de 20x, utilice un tamaño de paso de 0,5 μm).
    NOTA: La velocidad de adquisición se puede aumentar utilizando un tamaño de paso que sea 2-3 veces el valor recomendado.
20. Haga clic en el botón Enfoque y espere a que aparezca una flecha etiquetada como posición actual .
21. Haga clic en Iniciar en vivo y espere a que aparezca una nueva ventana con imágenes en vivo. Arrastre la flecha de posición actual hasta llegar a la parte inferior del tejido y haga clic en el botón Establecer B . Arrastre la flecha de posición actual hasta llegar a la parte superior del tejido y haga clic en el botón Establecer T . Haga clic en F2: Detener.
    NOTA: Se puede elegir la longitud de onda utilizada para la obtención de imágenes en vivo en Longitud de onda activa.
22. Seleccione los sitios a adquirir; primero, asegúrese de que la etapa esté en el primer pozo haciendo clic izquierdo sobre ella y presione Iniciar en vivo nuevamente. Vaya a diferentes posiciones dentro del pozo haciendo clic izquierdo en diferentes sitios en el mapa del sitio. Encuentre el borde del tejido y marque todos los sitios que contienen tejido para su adquisición haciendo clic con el botón derecho. Los sitios seleccionados serán verdes y los sitios no seleccionados grises.
    NOTA: Por ahora, haga esto solo para el primer pozo y asegúrese de que solo se seleccione el primer pozo para la adquisición.
23. Vaya a la pestaña Ejecutar . Para el nombre de la placa, nómbralo "Cycle{i}_Well{w}_{description}"; Reemplace {i}, {w} y {description} con los valores / descripción correspondientes.
24. Haga clic en Guardar protocolo y guárdelo, nuevamente incluyendo "Ciclo {i}_Well {w}" en el nombre.
25. Configure las regiones de adquisición para todos los demás pozos. Para ello, repita los pasos 5.22-5.24.
    NOTA: Para cada pocillo que se adquiera, se debe guardar un archivo de protocolo individual. Asegúrese de que el pozo correcto esté activado antes de extraer el nuevo ROI. El resultado debería ser un protocolo guardado por pozo para adquirir. Esto es necesario ya que los tejidos tienen diferentes formas de pozo a pozo. En caso de que el ROI y la pila z sean idénticos entre los pocillos, se pueden omitir los pasos repetidos 5.22-5.24, y también se pueden omitir los pasos 5.26-5.29. En ese caso, simplemente seleccione todos los pocillos a fotografiar (consulte el paso 5.22), vaya a la pestaña Ejecutar y presione Adquirir placa.
26. Haga clic en Control | Diario | Inicie la grabación y luego controle inmediatamente | Diario | Detener la grabación. Guarde el diario creado y ábralo de nuevo a través de Control | Diario | Editar diario.
27. En el panel izquierdo, busque y haga doble clic en Adquisición de placas - Cargar protocolo desde archivo y en Adquisición de placas para agregar esos pasos al diario; Búscalos en el panel derecho. Haga doble clic en el agregado Adquisición de placas - Cargar protocolo desde archivo y elija el protocolo guardado para el primer pocillo (consulte el paso 5.24).
28. Repita el paso 5.27 para cada pozo a adquirir, siempre cargando el protocolo respectivo.
29. Haga clic en Guardar y finalmente en Ejecutar diario para iniciar la adquisición (requiere aproximadamente 3 h para adquirir 180 mosaicos con una pila z de 15 μm).

6. Blanqueamiento con fluoróforos (día 2)

1. Aproximadamente 30 minutos antes del final del diario, prepare el reactivo blanqueador. Disolver 10 mg de borohidruro de litio en 10 mL de ddH₂O y pasar por un filtro de 0,22 μm. Dejar actuar durante 10 min, esperando a que se formen burbujas. Para garantizar un blanqueo eficaz, utilice el reactivo blanqueador dentro de las 4 horas posteriores a la preparación.
   PRECAUCIÓN: Trabaje bajo una campana química cuando manipule el borohidruro de litio, ya que puede reaccionar con el aire y puede producir gas hidrógeno que es inflamable.
2. Blanquee los fluoróforos con 1 ml de 1 mg / ml de borohidruro de litio durante 15 minutos mientras se expone a la iluminación ambiental estándar. Busque pequeñas burbujas en el tejido durante el procedimiento de blanqueamiento.
   NOTA: Cuando trabaje bajo una campana química, asegúrese de que la iluminación no se apague automáticamente durante el procedimiento de blanqueo.
3. Repita el blanqueamiento con otro 1 ml de 1 mg / ml de borohidruro de litio (preparado a partir de la misma solución) durante 15 minutos.
4. Lave bien durante 3 x 5 min con 1 ml de PBS.
   NOTA: No acorte los tiempos de lavado, ya que la eliminación incompleta del reactivo blanqueador podría dañar el siguiente panel de anticuerpos.

7. Ciclos IBEX (Día 2)

1. Aplicar anticuerpos primarios para el siguiente ciclo de inmunomarcación (paso 3.7) e incubar a 4 °C durante la noche. Repita los pasos 4.4-5.4.
   NOTA: Los pasos 4.2-4.3 no se repiten ya que un anticuerpo de conejo desacoplado solo se usa en el primer ciclo de IBEX. Sin embargo, los anticuerpos desacoplados criados en especies menos comunes como el pollo o el conejillo de indias también se pueden usar en ciclos posteriores, ya que su anticuerpo secundario no reaccionará de forma cruzada con los anticuerpos primarios acoplados. Los detalles exactos de los anticuerpos utilizados en cada ciclo se pueden encontrar en la Tabla de materiales.
2. En el microscopio, cargue la configuración del protocolo del ciclo IBEX anterior para el pocillo correspondiente haciendo clic en cargar protocolo, guardado en el PC local como Cycle{i}_Well{w} (paso 5.24). La configuración del protocolo tendrá el ROI (mosaicos seleccionados para adquirir), la ampliación, la configuración de enfoque automático y cualquier configuración de adquisición adicional guardada del ciclo IBEX anterior (pasos 5.5-5.25).
3. Seleccione las pestañas de longitud de onda y ajuste la potencia de exposición e iluminación para el nuevo panel de anticuerpos (pasos 5.12-5.18). Asegúrese de obtener imágenes de un marcador (generalmente DAPI o Hoechst) a lo largo de todos los ciclos para alinear los ciclos después.
   NOTA: Como se informó en Radtke et ^al.18, las proteínas fluorescentes de uso común, como GFP y tdTomato, no son sensibles al blanqueamiento con borohidruro de litio. Cuando se trabaja con tejido que contiene proteínas fluorescentes endógenas como tdTomato, la longitud de onda correspondiente se puede omitir de la adquisición después del ciclo 1, si no es necesaria para el registro de imágenes, lo que acelerará la obtención de imágenes. Las longitudes de onda se pueden eliminar en la pestaña Longitud de onda general reduciendo el número de canales de adquisición. Además, no se observó un aumento constante en la autofluorescencia tisular durante los ciclos de imágenes; sin embargo, es probable que esto varíe según el tipo de tejido¹⁸.
4. Compruebe si la configuración de z-Stack sigue siendo razonable y ajústela en consecuencia (pasos 5.19-5.21).
   NOTA: Asegúrese de que el tamaño de paso de la pila z sea el mismo para todos los ciclos.
5. Actualice el nombre de la placa en la pestaña Ejecutar y vuelva a guardar el protocolo.
6. Repita los pasos 7.2-7.5 para que adquieran todos los pozos.
   NOTA: Se recomienda anotar la configuración de exposición para todas las longitudes de onda utilizadas en el primer pocillo y usar la misma configuración en todos los pocillos posteriores.
7. Edite el diario, seleccione los nuevos archivos de protocolo y guarde el diario para este ciclo.
8. Ejecute el diario.
9. Repita los pasos 6.1-6.4 para blanquear los fluoróforos.
10. Repita los pasos 7.1-7.9 hasta que se haya alcanzado la cantidad deseada de inmunoetiquetado.

8. Procesamiento de imágenes (día 2)

1. Después de finalizar la adquisición de imágenes de los ciclos IBEX, exporte los datos de la imagen:
   1. Seleccionar Proyección | Utilidades de datos de placas | Exportar imágenes.
   2. Haga clic en Seleccionar placa(s) y elija todas las placas adquiridas para cada ciclo y pozo.
   3. Elija Todos los planos Z, seleccione un directorio de salida y pulse OK para exportar los datos.
      NOTA: Los datos se exportarán como archivos tiff individuales para cada mosaico y plano. Para combinar todas las baldosas y ciclos, se realizaron los siguientes pasos de procesamiento.
2. Organice los datos exportados en carpetas de acuerdo con el siguiente esquema: asegúrese de que cada ciclo sea una carpeta, cada una de las cuales contiene nuevamente una carpeta para cada pozo. Nombra de la siguiente manera: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", donde {i} y {well} son el ciclo y pozo correspondiente, y * es cualquier carácter. Por ejemplo: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   NOTA: Se requiere una estructura de carpetas y nomenclatura correcta para los pasos de procesamiento posteriores.
3. Instale los paquetes de Python necesarios: use Miniforge para administrar el entorno de Python. Consulte https://github.com/conda-forge/miniforge para obtener instrucciones de instalación.
   NOTA: El código para los pasos de procesamiento se proporciona en forma de Jupyter Notebooks. Se pueden encontrar en https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove o como archivos complementarios (Archivo complementario 1, Archivo complementario 2, Archivo complementario 3, Archivo complementario 4 y Archivo complementario 5).
4. Al descargar el código de Github, descargue todos los archivos haciendo clic en Código | Descargue ZIP y siga las instrucciones de instalación en el archivo README.md.
5. Inicie Jupyter-Lab (Archivo complementario 2):
   1. Active el entorno de conda instalado ingresando conda activate zmb-ibex-jove en una terminal.
   2. En el terminal, cambie al directorio descargado introduciendo, por ejemplo, cd C:\path\to\zmb-ibex-jove.
   3. Inicie Jupyter-Lab introduciendo jupyter-lab en el terminal. Se abrirá una ventana del navegador con jupyter-lab.
6. Calcular la corrección de iluminación:
   1. En la pestaña izquierda, vaya al bloc de notas " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" y ábralo haciendo doble clic en él. Este cuaderno calculará las imágenes de corrección de iluminación, utilizando la biblioteca BaSiCPy (Archivo complementario 3).
   2. Cambie el "base_dir" y el "save_dir" a las rutas correctas, donde se encuentran los datos y donde se deben guardar las imágenes de corrección de iluminación.
   3. Para ejecutar el código dentro del cuaderno, seleccione cada celda y presione Mayús+Entrar para ejecutarlo. Ejecute el cuaderno de arriba a abajo.
7. Realice costuras para cada ciclo individual (Archivo complementario 4):
   1. En la pestaña izquierda, navegue hasta el siguiente bloc de notas y ábralo : "02_stitching_MD.ipynb". En este cuaderno, para cada ciclo, se cargan las baldosas individuales, se corrige la iluminación y se unen, lo que da como resultado un archivo de imagen por pocillo y ciclo. Utilice la biblioteca m2stitch (https://github.com/yfukai/m2stitch) para unir.
   2. Cambie las entradas de la primera celda a las rutas de archivo correctas. Vuelva a ejecutar el cuaderno de arriba a abajo.
8. Realice el registro de imágenes entre ciclos (Archivo complementario 5):
   1. En la pestaña izquierda, navegue hasta el siguiente bloc de notas y ábralo : "03_registration_pcc.ipynb". En este cuaderno, los ciclos individuales se alinean entre sí utilizando solo transformaciones traslacionales, que se calculan con el algoritmo de correlación cruzada de fase de la biblioteca scikit-image (https://scikit-image.org/) de acceso abierto.
   2. Cambie las entradas de la primera celda a las rutas de archivo correctas. Elija un ciclo de referencia y un canal de referencia para usar (generalmente DAPI). Vuelva a ejecutar el cuaderno de arriba a abajo.
      NOTA: Solo es necesario ejecutar uno de los capítulos "Opción 1: Cargar y guardar todos los canales juntos" y "Opción 2: Cargar y guardar canales como archivos individuales". El primer capítulo creará un archivo grande, que contiene todos los canales de todos los ciclos. El segundo capítulo creará un archivo individual para cada canal. La segunda opción requerirá menos memoria para procesar.

9. Análisis de imagen (Día 2)

1. Descargue y abra Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   NOTA: Las imágenes resultantes serán imágenes multiplano y multicanal, que podrían analizarse como imágenes 3D. Aquí, se muestra un ejemplo de flujo de trabajo de análisis solo para datos 2D, para los que primero se calcula una proyección de intensidad máxima.
2. Abra el archivo en Fiji arrastrando el archivo a la ventana de Fiji.
3. Calcule la proyección de intensidad máxima seleccionando Imagen | Pilas | Z Project..., elija Intensidad máxima y pulse ok. Vuelva a guardar la imagen a través de Archivo | Guardar como | OME-TIFF".
4. Para analizar las células, utilice el software de código abierto QuPath; Descárgalo e instálalo desde https://qupath.github.io/.
5. Abra QuPath y cree un nuevo proyecto arrastrando una carpeta vacía a la ventana.
6. Importe todos los archivos en el proyecto arrastrándolos a la ventana de QuPath y pulsando Importar con la configuración estándar.
7. Haga doble clic en una imagen en el panel izquierdo para abrirla. Especifíquelo como Fluorescencia cuando se le solicite.
8. Abra la ventana Brillo/Contraste presionando Mayús+C.
   NOTA: Aquí, se pueden seleccionar los canales que se muestran y ajustar el brillo y el contraste. También se pueden cambiar los nombres y colores de los canales haciendo doble clic en los nombres.
9. Seleccione las herramientas | Polígono y anote la región de tejido. Busque una nueva anotación en la pestaña Anotaciones . Establézcalo en una clase específica seleccionando la anotación, seleccionando una clase (por ejemplo, Otro) y presionando Establecer clase.
10. Detectar células: Ir a Analizar | Detección celular | Detección celular.
    1. Elige un canal nuclear.
    2. Deje la mayoría de las configuraciones como están, pero ajuste el umbral pasando el cursor sobre un núcleo con el mouse y anotando la intensidad que se muestra en la esquina inferior derecha. Pase el cursor sobre una región de fondo y observe la intensidad nuevamente. Elija un valor a medio camino entre el fondo y el primer plano como umbral.
    3. Haga clic en Ejecutar.
11. Inspeccione las celdas y las mediciones:
12. Al hacer doble clic en una celda o seleccionarla en la pestaña Jerarquía , inspeccione sus medidas en el panel inferior izquierdo. Se deben agregar diferentes mediciones de forma e intensidad para la célula, el núcleo y el citoplasma.
13. Clasificar celdas:
    1. Para clasificar las celdas detectadas según la intensidad de un canal, vaya a Clasificar | Clasificación de objetos | Cree un clasificador de medición único.
    2. Seleccione el canal deseado en Filtro de canal y una medición adecuada en Medición (por ejemplo, Celda: Media del canal).
    3. Ajuste el umbral colocando nuevamente el cursor sobre una celda positiva y sobre una celda negativa y eligiendo un valor entre los dos.
    4. Seleccione, por ejemplo, Positivo para Encima del umbral y Negativo para Debajo del umbral. Compruebe el resultado marcando Vista previa en vivo.
    5. Presione Aplicar para clasificar las celdas.
14. Mida la distancia a los objetos anotados (p. ej., haces de nervios):
    1. Seleccione las herramientas | Herramienta Pincel .
    2. Dibuje sobre regiones de interés (p. ej., haces de nervios).
    3. Vaya a la pestaña Anotaciones . Seleccione todas las anotaciones nuevas, seleccione una clase correspondiente y presione Establecer clase.
       NOTA: Se puede crear una nueva clase haciendo clic con el botón derecho en la ventana de la clase y seleccionando Agregar/Quitar | Agrega clase.
    4. Ir a Análisis espacial | Distancia firmada a las anotaciones 2D y pulse Sí cuando se le solicite.
    5. Agregue una nueva medida a cada celda, indicando la distancia a la anotación más cercana de una clase determinada.
15. Exportar medidas:
    1. Ir a Medir | Mostrar medidas de detección y esperar a que aparezca una lista de todas las mediciones de todas las detecciones.
    2. Exporte la tabla como .txt mediante el botón Guardar .
    3. Importe los datos al software de procesamiento de datos de su elección para analizarlos más a fondo.

Este método permite la detección adecuada de tipos celulares proliferantes mediante la combinación de la química EdU Click-iT con IBEX en secciones fijas de piel murina congelada. La detección de tipos de células proliferantes se comparó utilizando diferentes metodologías, en particular, el etiquetado de tipos de células proliferantes con anticuerpos Ki-67 y la detección de proliferación celular utilizando el enfoque químico EdU Click-iT (Figura 1). Observamos que el etiquetado de anticuerpos Ki-67 subestima el número de células proliferantes en secciones fijas de piel murina congelada (Figura 1B, D), mientras que la incorporación de EdU refleja adecuadamente el número de células proliferantes (Figura 1A, C). Los resultados obtenidos por la incorporación de EdU se compararon con los resultados de la citometría de flujo (Figura 1G) y con el inmunomarcaje de Ki-67 en secciones de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) (Figura 1E-G). Estos resultados sugieren que el marcado de anticuerpos Ki-67 en secciones fijas de piel murina congelada puede subestimar la proliferación de células debido a una recuperación insuficiente del antígeno, ya que se observaron recuentos comparables en las secciones FFPE después de la recuperación.

Figura 1: Detección de proliferación celular usando Click-iT EdU en combinación con IBEX en heridas cutáneas. (A,B) Imágenes representativas de IBEX de una herida cutánea de día 4 de ratones Plp1-CreERT2:tdTomato 19. Las células endoteliales están marcadas con CD31, los fibroblastos con Vimentina y las células gliales periféricas con NGFR y el trazador endógeno tdTomato. Las células proliferantes se detectan utilizando (A) el enfoque químico EdU Click-iT o (B) el etiquetado de anticuerpos Ki-67 en secciones consecutivas de tejido de heridas cutáneas. La línea discontinua delinea la región del lecho de la herida y el área del cuadro de la línea discontinua se muestra con mayor aumento en C, D. Tenga en cuenta que el inmunomarcaje se realizó en secciones criogénicas congeladas fijas. Barra de escala = 200 μm. (C,D) Imágenes de mayor aumento del cuadro discontinuo delineado en A,B. Barras de escala = 50 μm. (E) Imagen representativa de una herida cutánea del día 4 de ratones Plp1-CreERT2:tdTomate. Las células gliales periféricas se marcan con NGFR y las células proliferantes con Ki-67. Tenga en cuenta que el inmunomarcaje se realizó en secciones de tejido FFPE. Barra de escala = 200 μm. (F) Imágenes de mayor aumento del cuadro discontinuo delineado en E. Barra de escala = 20 μm. (G) El gráfico de barras muestra el porcentaje de células proliferantes en las secciones de heridas de la piel. Las células proliferantes en secciones de piel se marcaron con el anticuerpo Ki-67 en secciones fijas congeladas o FFPE o se detectaron utilizando el enfoque químico EdU Click-iT (n = 3 para cada condición). Además, las células aisladas de heridas cutáneas se marcaron con anticuerpos Ki-67 y se analizaron mediante citometría de flujo (n = 10). Los valores de p se calcularon con ANOVA de una vía. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). *P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Configuración de Git Ignore para scripts de Python. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Instrucciones de configuración y uso para el análisis de imágenes multiplex ZMB-Ibex-Jove. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Script básico. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Guión de unión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: Script de registro. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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