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Artículo de método

Colección de exosomas liberados naturalmente a partir de tejido tumoral

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DOI:

10.3791/67739

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10 de junio de 2025

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1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo demuestra un método novedoso para extraer exosomas de los tejidos tumorales liberándolos de forma natural y recolectándolos repetidamente para proporcionar una base experimental para estudiar la función de los exosomas en el desarrollo tumoral.

Resumen

Como vesículas secretadas por las células, los exosomas encierran y transfieren varios ácidos nucleicos, proteínas y lípidos, y participan en la comunicación entre diferentes células. Los exosomas en el microambiente tumoral juegan un papel importante en las características biológicas de las células tumorales y pueden influir fuertemente en los estados de otras células. Por lo tanto, para estudiar más a fondo las funciones específicas de los exosomas en el desarrollo de tumores, es indudablemente necesario extraer y aislar exosomas de los tejidos tumorales. La extracción directa de exosomas del tejido tumoral reduce la necesidad de cultivo celular in vitro , y los exosomas del tejido tumoral pueden ser más similares a los del estado natural. Por lo tanto, mantener el estado natural de los exosomas en el tejido tumoral es la clave para el proceso de extracción. La digestión enzimática a menudo se combina con la ultracentrifugación para extraer exosomas de los tejidos tumorales. Aquí, proporcionamos un método novedoso para extraer exosomas del tejido tumoral. Utilizamos un medio sin suero para incubar pequeños trozos de tejido tumoral en una mesa vibratoria, recogimos y extrajeron repetidamente exosomas liberados naturalmente del tejido tumoral e identificamos la estructura, la concentración y las características del exosoma extraído, proporcionando un nuevo método para los investigadores que estudian la función de los exosomas en el desarrollo tumoral.

Introducción

Los exosomas son un subtipo de vesículas extracelulares secretadas por las células, cuyo tamaño suele oscilar entre los 30 nm y los 200 nm 1,2. Participan en la comunicación intercelular y entregan varias moléculas de señalización, incluidos los ácidos nucleicos (por ejemplo, ácido desoxirribonucleico (ADN), ARN mensajero (ARNm), ácido microrribonucleico (miARN), ARN largo no codificante (lncRNA), ARN circular (circRNA)), proteínas y lípidos 1,3,4,5, a las células receptoras para influir en sus funciones fisiológicas 6,7. Inicialmente identificados en reticulocitos de ovejas8, los exosomas se han identificado desde entonces en varios fluidos corporales, incluyendo sangre, saliva, orina, líquido cefalorraquídeo, ascitis, líquido amniótico y leche materna 9,10,11,12,13,14,15,16. Además, los exosomas pueden ser secretados por muchos tipos de células, incluidos linfocitos, macrófagos, mastocitos, células grasas y células tumorales17. Con su amplia distribución, los exosomas desempeñan un papel fundamental en diversos procesos patológicos, especialmente el cáncer, y en diversos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la reparación y regeneración de tejidos, y la regulación inmunitaria 18,19,20.

En los últimos años, se ha demostrado que los exosomas promueven la aparición de tumores, la invasión, la metástasis, la resistencia a la quimioterapia y la inmunidad anti o protumoral 20,21,22. Los exosomas derivados del cáncer pueden activar la expresión génica en los receptores o en las células cancerosas vecinas para cambiar sus fenotipos biológicos, y las células cancerosas pueden interactuar con las células estromales en el microambiente tumoral para promover la proliferación, invasión y angiogénesis de las células cancerosas 23,24,25. Los exosomas liberados por las células tumorales pueden ayudarlas a excretar medicamentos tóxicos, y los exosomas derivados de las células estromales pueden promover la formación de células cancerosas20. Los exosomas derivados del cáncer están involucrados en varias etapas de la metástasis de las células cancerosas, incluida la invasión de los tejidos vecinos, la transferencia a través del sistema circulatorio y la diseminación a órganosdistantes. Por último, los exosomas realizan funciones de inmunoactivación e inmunosupresión en el cáncer, dependiendo de los ligandos, proteínas y miRNAs que portan20. Debido a las importantes funciones de los exosomas derivados del tejido tumoral, muestran un valor potencial de aplicación en el diagnóstico precoz, el tratamiento preciso y el seguimiento pronóstico de los tumores21,22.

Dada la importancia de los exosomas derivados del tejido tumoral, muchos investigadores han intentado extraerlos para estudiar más a fondo sus propiedades y funciones. La extracción directa de exosomas de los tejidos tumorales no solo reduce la necesidad de cultivo celular in vitro, sino que también se asemeja más al estado natural de los exosomas. Por lo tanto, mantener el estado natural de los exosomas en el tejido tumoral es la clave para el proceso de extracción. Las propiedades físicas de los exosomas son la base de los métodos de extracción comunes, y rara vez se consideran los cambios en los componentes del exosoma causados por la estimulación durante el proceso de extracción. De hecho, la calidad de los exosomas se ve fuertemente afectada por diferentes procedimientos de extracción de exosomas26,27. En la actualidad, los tejidos tumorales son digeridos por enzimas y sometidos a métodos como la centrifugación en gradiente de densidad, la ultracentrifugación, la ultrafiltración, la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la precipitación de polímeros, la cromatografía de inmunoafinidad y los métodos microfluídicos, antes de la separación 2,21,28,29 . Aquí, proporcionamos un método para extraer exosomas del tejido tumoral. Utilizamos un medio libre de suero para cultivar pequeños bloques de tejido tumoral en un agitador, luego recolectamos y extrajeron los exosomas liberados naturalmente por el tejido tumoral e identificamos la concentración y las características de los exosomas extraídos, proporcionando materiales básicos y evidencia experimental para estudiar la función de los exosomas en el desarrollo tumoral.

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Protocolo

Todos los experimentos relacionados con exosomas de tejido tumoral se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Este estudio fue aprobado y realizado por las directrices del Comité de Ética del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan (20220301101). Cuatro semanas después de la inoculación con células SGC-7901, un ratón desnudo (BALB/c, macho, 8 semanas de edad, 26 g) fue sacrificado por dislocación cervical.

1. Adquisición de tejido tumoral

  1. Remojar en alcohol al 75% durante 5 min.
  2. Muévase a una mesa de operaciones estéril, use tijeras quirúrgicas estériles para abrir la piel exterior del tumor ectópico.
  3. Pele el tejido tumoral ectópico, luego córtelo y péselo para obtener dos piezas de igual peso.
    NOTA: Una pieza de tejido tumoral se utiliza para la extracción de exosomas bajo este protocolo, y otra pieza de tejido tumoral de igual peso se utiliza para la extracción de exosomas por digestión enzimática30.

2. Preacondicionamiento del tejido tumoral

NOTA: Realice estos pasos en hielo y en un ambiente estéril.

  1. Pipetear 10 mL de solución salina tampón de fosfato (PBS) preenfriada (0,01 M) para lavar el tejido tumoral y eliminar la sangre y la grasa de la superficie.
  2. Cortar el tejido tumoral (~400mm3) en trozos de 1-2 mm con unas tijeras oftálmicas en 20 mL de PBS con 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en una placa de Petri estéril de 10 cm. Transfiera la mezcla anterior a un tubo cónico de 50 mL.

3. Liberación de exosomas

  1. Centrifugar el tubo desde el paso 1.2 a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
  2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 20 mL de medio α de medio esencial mínimo (α-MEM). Incubar a 37 °C a 100 rpm durante 1 h en un agitador de temperatura constante.
  3. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
  4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 10 mL de medio α-MEM. Incubar a 37 °C a 100 rpm durante 6 h en un agitador de temperatura constante.
    NOTA: Sea amable con todos los pasos. Una incubación corta y un lavado con medio α-MEM son suficientes para eliminar los componentes intracelulares que se filtran debido al corte, incluidas las vesículas intracelulares y los orgánulos.
  5. Centrifugar a 200 × g durante 5 min, 4 °C y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo.
  6. Vuelva a suspender el tejido tumoral con 10 mL de medio α-MEM.
  7. Repita la incubación del paso 2.4 seguido del paso 2.5.
  8. Mezcle los sobrenadantes medios recolectados en los pasos 2.5 y 2.7.
    NOTA: Sea amable con todos los pasos. Dos incubaciones de 6 h indujeron la liberación natural de exosomas de las piezas de tejido tumoral.

4. Ultracentrifugación

  1. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro microporoso de 0,45 μm.
  2. Centrifugar el sobrenadante a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C para eliminar las vesículas grandes.
  3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugue a 120.000 × g durante 90 min a 4 °C para recoger los exosomas.
  4. Lavar el precipitado del exosoma con PBS (0,01 M) y centrifugar de nuevo a 140.000 × g durante 60 min a 4 °C.
  5. Suspender los exosomas precipitados en PBS (0,01 M) para su uso inmediato o almacenamiento a -80 °C.
    NOTA: Sea amable con todos los pasos. Realice cada paso con la menor fuerza centrífuga posible y el menor tiempo centrífugo.

5. Presentación de los resultados de la identificación de exosomas

  1. Identificar la morfología de los exosomas del tejido tumoral mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)30.
  2. Determinar el tamaño y la concentración de exosomas del tejido tumoral mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)30.
  3. Identificar los marcadores de proteínas exosomales CD9 y CD63 mediante Western blot (WB)30.
    NOTA: Directrices recientes para la investigación de exosomas, incluido el uso de CD63, CD9, como criterios para los marcadores de exosomas31.

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Resultados

La TEM reveló que los exosomas derivados del tejido tumoral a través de este método tenían estructuras típicas en forma de copa (Figura 1A), y no había diferencias significativas entre la forma de los exosomas extraídos por este método y por la digestión enzimática (Figura 1B). Los resultados de la NTA revelaron que el diámetro medio del exosoma era de 172,8 nm, que estaba en el rango de 30-200 nm y era consistente con el tamaño de los exosomas; la concentración...

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Discusión

En este método, los exosomas derivados del tejido tumoral se extrajeron de los tejidos de cáncer gástrico ectópico de ratones desnudos, y los pasos clave fueron la liberación, exudación, separación y purificación de los exosomas. Se han diseñado y verificado varios métodos de separación de exosomas de acuerdo con las propiedades físicas y la composición de los exosomas 2,21,28,29, cada uno con ventajas y desventajas, pero el propósito es minimizar el i...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del Programa de Apoyo a la Ciencia y la Tecnología de la Provincia de Sichuan (2024NSFSC0592, 2023YFS0064).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
α-MEMHyCloneSH30265.01B
Anticuerpo anti-CD63Biossbsm-43117M
Anticuerpo anti-CD9Biossbs-2489R
Tubo de centrífugaThermo339650
Agitador de temperatura constanteThermoMAXQ4450
Pipeta estéril desechable-10mL JET
EDTABiosharpBS107
Pipeta eléctricaThermo9501
Centrífuga horizontal de temperatura controladaThermoSorvall ST1R plus
Analizador de seguimiento de nanopartículasMalvinNanoSight Pro
Tijera oftálmicaJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
Ácido fosfotúngstico   Sigma455970-10G
Tijera quirúrgicaJinzhongJ21010
Anticuerpo secundarioBiossBs-0295GCabra Anti-Conejo IgG H& L/FITC
Microscopio electrónico de transmisiónNikonPlan Apo WF
Tubo ultracentrífugoBeckman355618
GSP01001

Referencias

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