Perfilado de O-glicanos de mucina permetilada mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo detallado para la liberación de O-glicanos de las mucinas, y la posterior desalado, permetilación y análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.

Resumen

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) es una potente herramienta para el perfilado de glicanos de mucina que ofrece una alta sensibilidad y rendimiento. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el análisis de glicanos ligados a O de mucinas utilizando MALDI-TOF MS, que abarca la liberación de glicanos, la desalinización, la permetilación y la adquisición y análisis de datos. Este estudio muestra que la desalinización basada en cromatografía de intercambio iónico conduce a una mejor recuperación de glicanos más grandes y una mejor calidad de los espectros producidos en comparación con la extracción en fase sólida utilizando carbono grafitizado poroso (PGC). Además, este trabajo sugiere que podría ser necesario un tiempo de reacción de permetilación más largo que el empleado actualmente para la modificación eficiente de las estructuras sialiladas. También demostramos la importancia y la necesidad de los datos de fragmentación y el conocimiento previo de las vías biosintéticas de O-glicanos para la identificación precisa de la composición y estructura de los glicanos y discutimos los beneficios y limitaciones inherentes que MALDI-TOF presenta en el análisis de O-glicanos de mucina.

Introducción

Las mucinas son glicoproteínas grandes que constituyen la mayoría de los componentes estructurales del moco. Son producidos por células epiteliales especializadas llamadas células caliciformes y se someten a una extensa O-glicosilación antes de ser secretadas en la superficie mucosa. La glicosilación de las mucinas tiene lugar en el aparato de Golgi, donde una familia de glicosiltransferasas especializadas, polipéptido N-acetilgalactosamina transferasas (ppGalNAc-T) inicia el proceso uniendo un residuo de GalNAc a una serina (Ser) o una treonina (Thr)¹. Luego, un arsenal de glicosiltransferasas extiende las estructuras de glicanos mediante la adición de residuos de galactosa (Gal), N-acetilglucosamina (GlcNAc), GalNAc, ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y fucosa (Fuc), mientras que otras enzimas modificadoras de carbohidratos pueden llevar a cabo reacciones como la sulfatación de los glicanos¹. Los glicanos que decoran la columna vertebral de la proteína de mucina se encuentran principalmente en grupos en regiones proteicas ricas en residuos de Ser y Thr, ya que los grupos hidroxilo en la cadena lateral de estos residuos sirven como sitios de O-glicosilación. Esta densa glicosilación da a las mucinas la apariencia de un "cepillo de botella" y es responsable de sus propiedades físicas, como la capacidad de retener grandes cantidades de agua, su capacidad de formación de gel y su alta viscoelasticidad ^2,3. Debido a estas propiedades, las mucinas proporcionan lubricación, protegen el epitelio de la deshidratación y las lesiones físicas, y forman una barrera física entre el epitelio y su microambiente ^4,5. Los glicanos de mucina también pueden servir como sitios de unión y como fuente de carbono para bacterias comensales o patógenas ^6,7,8. La organización y composición del moco son fundamentales para proteger el epitelio al mantener a los microbios cerca pero lejos de la superficie del epitelio. Los glicanos de mucina también participan en la comunicación y adhesión célula-célula⁹.

Los glicanos de mucina desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis de la mucosa, y los perfiles aberrantes de glicosilación de la mucina se asocian con un deterioro de la función de barrera, una composición alterada de la microbiota, un aumento de la metástasis tumoral, enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y otras enfermedades 10,11,12. Por lo tanto, el estudio de la glicosilación de la mucina es importante para comprender el papel del moco y las mucinas en la salud humana y puede conducir a nuevos enfoques para el manejo o tratamiento de enfermedades.

Las técnicas basadas en espectrometría de masas se encuentran entre las opciones más populares para estudiar los glicanos de mucina. MALDI-TOF MS es una técnica de ionización suave que permite el análisis de grandes biomoléculas no volátiles como glicanos y glicoproteínas¹³. Este enfoque ofrece una alta sensibilidad y un amplio rango de masas, lo que permite la detección e identificación de mezclas de glicanos poco abundantes y diversas. Además, los patrones de fragmentación obtenidos de los experimentos de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) pueden proporcionar información estructural valiosa sobre la composición y la secuencia de glicanos¹³.

Por lo general, el análisis de glicanos ligados a O de mucinas por MALDI-TOF MS implica un flujo de trabajo de varios pasos, en el que los O-glicanos primero se liberan químicamente desde la columna vertebral de la proteína utilizando métodos como la eliminación reductiva β, luego se desalinizan para eliminar las sales de la liberación química y se derivatizan para mejorar la ionización y la detección. A continuación, los glicanos purificados y derivatizados se cocristalizan con una matriz MALDI adecuada en una placa objetivo MALDI y se adquieren espectros de masas que proporcionan información sobre las masas de los iones glicanos intactos. A continuación, los glicanos se fragmentan en experimentos MS/MS para obtener información sobre la estructura de los glicanos¹⁴. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para liberar, desalinizar y permetilar glicanos y analizarlos mediante MALDI-TOF MS.

Protocolo

NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener una representación esquemática del flujo de trabajo.

Figura 1: Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Liberación de glicanos

1. Preparación del tampón de eliminación de β
   NOTA: Este debe prepararse fresco antes de cada uso.
   1. Pesar un pellet de hidróxido de sodio (NaOH) y disolverlo en una cantidad adecuada de_H2Oen un tubo de 50 mL para obtener una solución de 0,1 M.
   2. En un tubo de 5 mL, disolver 189 mg de borohidruro de sodio (NaBH₄) en 5 mL de la solución alcalina preparada anteriormente en el paso 1.1.1.
      PRECAUCIÓN: El NaOH es corrosivo y el NaBH₄ es corrosivo, tóxico, inflamable y representa un peligro para la salud. Ambos productos químicos deben manipularse debajo de una vitrina de gases utilizando un equipo de protección personal adecuado. No disuelva el NaBH₄ directamente en H₂O, ya que se descompone y libera hidrógeno que puede autoinflamarse.
2. Configuración de la reacción de eliminación de β
   1. En un vial de vidrio de 4 mL, disuelva hasta 100 μg de mucinas purificadas en 250 μL de_H2O.
      NOTA: Es posible que algunas mucinas no se disuelvan completamente y, en cambio, formen una suspensión de partículas muy pequeñas.
   2. Añada 250 μL del tampón de eliminación de β y cierre herméticamente el vial con un tapón revestido de PTFE. Incubar la reacción a 45 ^oC durante 16 h.
3. Detener la reacción
   1. En un frasco de vidrio de 100 mL, agregue 5 mL de ácido acético glacial a 95 mL de_H2O (concentración de 5% (v/v)).
      NOTA: Esto se puede almacenar a temperatura ambiente y reutilizar.  PRECAUCIÓN: El ácido acético es inflamable y corrosivo y debe usarse en una vitrina de gases con el equipo de protección personal necesario.
   2. En hielo, añadir 1 mL de la solución de ácido acético al 5% a cada reacción (paso 1.2.3) gota a gota. En este punto, busque la efervescencia de la liberación de hidrógeno a partir del exceso de NaBH₄. Si la efervescencia no se ha detenido después de la adición de 1 mL de ácido acético al 5%, repita este paso.
      NOTA: Si no hay efervescencia tras la adición de ácido acético al 5%, entonces la reacción de eliminación de β podría ser incompleta o infructuosa.
4. Desalinización de las muestras
   1. En un frasco de vidrio de 100 mL, prepare una suspensión densa de resina de intercambio catiónico, forma H⁺ , malla 200-400 en ácido acético al 5% (v/v).
   2. Tape una pipeta de vidrio con una pequeña cantidad de lana de vidrio. Añade 1,5 mL de la suspensión de resina a la pipeta de vidrio desde la parte superior y deja que se asiente y se escurra. Esto hará la columna de desalinización.
   3. Lavar la resina con 2 mL de ácido acético al 5%. Deseche el flujo.
   4. Agregue la muestra de mucina a la columna de desalinización. Recoja el flujo en un tubo de 5 mL.
   5. Enjuague los viales de muestra con 1 ml de ácido acético al 5% y cárguelo en la columna de desalinización. Recoja el flujo en el mismo tubo.
   6. Lavar la columna 2 veces con 1 mL de ácido acético al 5%. Recoja el flujo en el mismo tubo.
   7. Utilice un evaporador centrífugo para eliminar el ácido acético y concentrar las muestras (5 mbar, 30 ^oC, 2 h).
   8. Congele las muestras a -80 ^oC y séquelas durante la noche en un liofilizador.
      NOTA: Alternativamente, la evaporación centrífuga puede continuar hasta la sequedad, pero dificultará la redisolución de las muestras.
   9. En un frasco de vidrio de 100 ml, agregue 5 ml de ácido acético a 95 ml de metanol (concentración del 5% (v/v)).
      PRECAUCIÓN: El metanol es inflamable y tóxico. Debe utilizarse en una cámara de gases con el equipo de protección personal necesario.
   10. Disuelva las muestras en 0,5 mL de ácido acético metanólico y seque las muestras bajo una corriente de nitrógeno. Repita este paso de 3 a 5 veces. Almacene las muestras secas a 4 ^oC.
5. Permetilación de los glicanos
   1. En un frasco de vidrio de 8 mL, mezcle bien la solución de NaOH al 50% (0,2 mL) con 0,4 mL de metanol y vórtice. Se formará un precipitado blanco que se disolverá rápidamente de nuevo.
   2. Con una jeringa de vidrio, agregue 4 mL de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) y vórtice bien.
   3. Centrifugar la solución durante 2 min a 2.000 × g. Esto formará un gel en la parte inferior del tubo, una fase líquida en el medio y sales acumuladas en la parte superior.
   4. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y las sales, sin alterar el gel.
   5. Repita los pasos 1.5.2-1.5.4 5 veces hasta que no se formen más sales. Si las sales se adhieren a las paredes del tubo, agite suavemente el tubo para que las sales queden en suspensión, sin alterar el gel en la parte inferior, o retírelas con una pipeta Pasteur de vidrio.
   6. Después de que no se formen más sales, vuelva a suspender el gel en 4 mL de DMSO anhidro. Esta suspensión es la base de la permetilación.
      NOTA: Esta cantidad de base de permetilación es suficiente para ~ 25 muestras. Las cantidades se pueden ajustar en consecuencia.
   7. A las muestras secas, añadir 100 μL de DMSO anhidro y 150 μL de base de permetilación. Con una pipeta de vidrio, agregue 80 μL de yodometano lo más rápido posible, para evitar la absorción de humedad del ambiente.
      PRECAUCIÓN: El yodometano es tóxico y representa un peligro para la salud y el medio ambiente. Debe utilizarse en una cámara de gases con el equipo de protección personal necesario.
   8. Incubar las reacciones de permetilación durante 30 min a temperatura ambiente con agitación vigorosa.
   9. Añadir 0,5 mL de_H2O para terminar la reacción. Las muestras se volverán turbias.
      NOTA: Si las muestras no se vuelven turbias, es posible que la reacción de permetilación haya sido incompleta.
   10. Enjuague las muestras con nitrógeno hasta que se aclaren.
   11. Cargue las muestras en una placa de extracción de 96 pocillos (60 mg) o cartuchos de HLB con equilibrio hidrofílico-lipofílico (HLB). Aplique presión positiva para empujar las muestras a través de la fase sólida a un caudal de ~1 mL/min. Si usa cartuchos de HLB, use una tetina de goma o un colector de vacío para aplicar presión a las muestras. Deseche el flujo.
   12. Lave los pozos con 2 x 1 mL de H₂O. Aplique presión positiva y deseche el flujo.
   13. Eluir los glicanos de la placa de HLB utilizando 1 mL de metanol. La presión se aplica solo hasta que el metanol comienza a salir de la placa. Entonces, el flujo por gravedad es suficiente para dar el caudal requerido. Recoge el flujo.
   14. Repita el paso de elución una vez más.
   15. Secar las muestras con un evaporador centrífugo
   16. En un frasco de vidrio de 4 ml, prepare el tampón TA50 mezclando 1 ml de acetonitrilo, 998 μL de_H2Oy 2 μL de ácido trifluoroacético.
       PRECAUCIÓN: El acetonitrilo es inflamable y el ácido trifluoroacético es corrosivo. Ambos deben usarse en una vitrina de gases, utilizando equipo de protección personal adecuado.
   17. En un tubo de microcentrífuga, prepare la solución de matriz disolviendo 10 mg de super-DHB [mezcla 9:1 (p/p) de ácido 2,5-dihidroxibenzoico y ácido 2-hidroxi-5-metoxibenzoico] en 1 mL de TA50.
   18. Disolver las muestras secas en 10 μL de TA50.
   19. Mezcle 1 μL de la muestra con 1 μL de la solución de la matriz, colóquela en una placa objetivo de acero MALDI y déjela secar.

2. Análisis MALDI TOF de las muestras

1. Configuración para adquirir datos de iones primarios
   1. Dispara 1.000 disparos desde el láser al 50% de intensidad.
      NOTA: Estos pueden variar dependiendo de la configuración global del instrumento y se pueden ajustar según sea necesario.
   2. En la pestaña Portador de láser , establezca la configuración de paseo aleatorio en Muestra completa.
   3. En la pestaña Detección , establezca el rango de masa en 500 - 3.000; Aumente este rango si se observan picos fuertes a 2.500-3.000 m/z. Ajuste la ganancia del detector a 20x.
      NOTA: La ganancia puede variar en función de la configuración global del instrumento y se puede ajustar según sea necesario.
   4. En la pestaña Espectrómetro , establezca la polaridad en positiva y la Supresión de matriz en Deflexión, 300 Da.
   5. Haga clic en Inicio | una vez finalizada la adquisición de datos, Guardar como para guardar los datos en un directorio adecuado.
2. Apertura de los espectros principales para adquirir espectros de fragmentación
   1. Después de hacer clic con el botón derecho en los espectros, seleccione Buscar lista de masas.
   2. De la lista generada, seleccione los iones relevantes para la fragmentación y haga clic en agregar a la lista MS/MS después de hacer clic con el botón derecho en los picos seleccionados.
   3. Haga clic con el botón derecho del ratón de nuevo en la lista masiva y seleccione MS/MS list.
   4. Haga clic en Enviar a flexControl.
   5. En flexControl, cargue el método LIFT y navegue hasta la pestaña LIFT .
   6. Seleccione cada pico cargado uno por uno y adquiera tanto los iones padre como los fragmentos cambiando entre los modos padre y fragmentos. Ajuste la intensidad del láser y el número de disparos según sea necesario. Haga clic en Guardar para guardar los datos después de la fragmentación de cada ion padre.
   7. Exporte los espectros en formato '.ascII'.
      NOTA: Esto se puede importar más tarde a Glycoworkbench para su posterior análisis.
3. Análisis de datos mediante glycoworkbench
   1. En Glycoworkbench, cargue el archivo .ascII exportado del espectro de masas y realice una corrección de línea de base y filtrado de ruido utilizando los botones correspondientes en la parte inferior de la ventana, antes de calcular los centroides de pico. En la ventana emergente, seleccione el rango de masa, la relación señal/ruido mínima y la intensidad máxima mínima de MS adecuadas.
   2. Una vez calculados los centroides de pico, utilice la herramienta Glyco-Peakfinder para encontrar composiciones de estructuras que coincidan con la lista de picos. Seleccione perMe como Derivatización, redEnd como Extremo Reductor y el número mínimo y máximo de residuos esperados.
      1. Para las mucinas, seleccione hexosa, N-acetil-hexosamina, desoxi-hexosa y ácido N-acetil-neuramínico. En el caso de los glicanos sulfatados, utilice la otra opción de residuo con una masa de 87,9. Para los datos MALDI-TOF, establezca los iones Max # Na y las cargas Max # se establecen en 1 y la precisión en 0.5 Da.
         NOTA: Es posible que sea necesario aumentar aún más la precisión, dependiendo de la calibración del espectrómetro de masas.
   3. Seleccione todas las anotaciones correctas manteniendo presionada la tecla de control y haciendo clic en cada anotación; luego haga clic con el botón derecho en la anotación y haga clic en Agregar a la lista de picos anotados.
   4. Para generar un informe que compare varios espectros anotados, en la pestaña herramientas , en Informes, seleccione Crear un informe que compare diferentes perfiles. Imprima el informe en formato PDF para guardarlo.
   5. Después de identificar los picos de glicanos, calcule la abundancia relativa de cada estructura individual como un porcentaje del área total bajo la curva de todos los picos de glicanos.
   6. Para el análisis de espectros de fragmentación, cargue los espectros en Glycoworkbench y genere la lista de picos como en el paso 2.3.1.
   7. Dibuje estructuras de glicanos putativas que correspondan a las composiciones de glicanos anotadas. Genere fragmentos para cada estructura dibujada seleccionando la opción de cálculo de fragmentos correspondiente en la herramienta Fragmentos . A continuación, selecciona todos los fragmentos, haz clic con el botón derecho del ratón sobre ellos y haz clic en Copiar fragmentos en el lienzo.
   8. Para respaldar aún más el análisis de la fragmentación, seleccione un pico de interés haciendo clic en él en el visor de espectro. A continuación, haciendo clic con el botón derecho y seleccionando Buscar todas las estructuras que coincidan con los picos, interrogue los m/z del pico seleccionado con las bases de datos en línea para las estructuras de glicanos putativas.
   9. Seleccione las estructuras putativas de interés y cópielas en la ventana de lienzo del software haciendo clic con el botón derecho y seleccionando la opción adecuada.
   10. Para calcular los posibles fragmentos que se pueden generar a partir de cada estructura de glicanos, seleccione la estructura de interés en el lienzo y, a continuación, en la pestaña Herramientas , elija Fragmentos y Calcular fragmentos para la estructura actual.
   11. Si se han calculado fragmentos para más de una estructura de glicanos, vea la tabla de comparación en la pestaña de resumen, en la vista de tabla Fragmentos.
   12. Seleccione los fragmentos que coincidan con la lista de picos para cada posible estructura de glicanos y seleccione Copiar fragmentos en el lienzo en el menú desplegable del botón derecho.
   13. En la pestaña Herramientas , en el generador de perfiles, seleccione anotar picos con todas las estructuras y, a continuación, haga clic en Herramientas | Presentación de informes | Cree un informe de las anotaciones. Imprima el informe en formato PDF para guardarlo.

Resultados

En los siguientes resultados, se utilizó mucina gástrica porcina (PGM) para optimizar las etapas de desalinización y permetilación. Para comparar dos enfoques de desalinización comúnmente utilizados, después de la liberación de los glicanos, las muestras se desalinizaron mediante intercambio catiónico (como se describe en el protocolo anterior) y coevaporación de borato con metanol o por extracción en fase sólida con cartuchos de carbono grafitizado poroso (PGC). Esto requiere un preacondicionamiento del cartucho con un 80% de acetonitrilo y un 100% de_H2O, una etapa de lavado con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% (v/v) y la elución de los glicanos con 2 mL de acetonitrilo al 25% en TFA al 0,1%, 2 mL de acetonitrilo al 50% en TFA al 0,1% y 2 mL de acetonitrilo al 80% en TFA al 0,1%.

Los espectros resultantes después de la permetilación se analizaron en el rango de m/z 500 a m/z 2.500. Se identificaron un total de 33 estructuras de glicanos en la muestra desalinizada por intercambio iónico y eliminación de borato, mientras que se identificaron 32 estructuras en la muestra desalinizada por extracción de PGC (Figura 2A). No se identificó una estructura de glicano en la muestra desalinizada con PGC (marcada con un asterisco en la Figura 2A). Este análisis comparativo mostró que la recuperación de glicanos más grandes no fue tan eficiente después de la extracción con PGC, en comparación con el intercambio iónico. Esto también se evidencia por la abundancia relativa de glicanos más grandes, que representan el 21% del total de glicanos después de la extracción de PGC, en comparación con el 31% para el intercambio iónico. Además, la desalinización por intercambio iónico y la eliminación de borato dieron lugar a espectros con una mayor relación señal-ruido en comparación con los producidos después de la desalinización por extracción en fase sólida con PGC (Figura 2B).

Para optimizar el tiempo de reacción de permetilación, las alícuotas de la misma reacción de permetilación se apagaron agregando H₂O en diferentes puntos de tiempo (es decir, 5 min, 30 min o 90 min). Los resultados mostraron que se pudieron identificar 33 picos de glicanos en el rango de m/z 500 a m/z 2.500, en las muestras permetiladas durante 30 o 90 min, siendo los espectros resultantes similares. En contraste, solo se pudieron identificar 31 picos de glicanos cuando se llevó a cabo la permetilación durante 5 min (Figura 3). Curiosamente, las dos estructuras que no se identificaron en este tiempo de reacción más corto (marcadas con un asterisco en la Figura 3) son las dos estructuras sialiladas, lo que sugiere que la modificación de los ácidos siálicos no es eficiente en 5 min, en las condiciones probadas.

Se utilizó la fragmentación para cada pico de glicano PGM para confirmar la composición de glicanos y determinar la estructura de glicanos. Aquí se presentan dos ejemplos (Figura 4). En la Figura 4A se presenta el espectro de fragmentación de un pico a 983 m/z. La composición de glicanos se asigna como HexNAc₂Hex₂. Hay dos estructuras potenciales para esta composición de glicanos, ya sea Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (glicano 1) o Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (glicano 2). La fragmentación de este compuesto produjo un espectro de masas con picos que se pueden asignar a diferentes fragmentos del glicano. El pico a m/z 529 y el pico a m/z 708 son característicos de las estructuras 1 y 2, respectivamente, y podemos concluir que tanto los glicanos 1 como los 2 están presentes en la mezcla de glicanos PGM.

En la Figura 4B se presenta el espectro de fragmentación de un pico a m/z 2.026. Glycoworkbench calculó dos posibles composiciones de glicanos para este pico, Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ y Hex₃HexNAc₄dHex₂. La composición sialilada tiene una precisión menor (~160 ppm y 178 ppm, respectivamente), lo que sugiere que la primera debe ser la elección correcta. Sin embargo, el perfil de fragmentación indica la presencia de Fuc, no de Neu5Ac; Por lo tanto, la segunda composición es la correcta. Aquí, se presentan cuatro estructuras de glicanos putativas, y el espectro se ha anotado con los fragmentos calculados de cada estructura de glicanos putativa. En el espectro anotado, podemos ver que los picos característicos solo de los glicanos 4 y 6 están presentes, mientras que no se identificaron picos característicos de los glicanos 3 y 5. A partir de estos datos, podemos concluir que los glicanos 4 y 6 están presentes.

Figura 2: Comparación de los picos de glicanos según la desalinización y la extracción en fase sólida. (A) Comparación del perfil de glicanos PGM después de la desalinización por cromatografía de intercambio catiónico y eliminación de borato o por extracción en fase sólida PGC. (B) Comparación de los dos enfoques de desalinización en la relación señal-ruido resultante para cada pico de glicano identificado. El asterisco especifica el glicano que solo se identificó en las muestras desalinizadas por intercambio catiónico y eliminación de borato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación del perfil de glicanos PGM después de la permetilación durante 5, 30 o 90 min. Los asteriscos indican los glicanos sialilados que solo se identificaron después de 30 o 90 min de permetilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ejemplos de espectros de fragmentación de glicanos PGM. (A) Fragmentación del pico de glicano a m/z 983. (B) Fragmentación del pico de glicano en m/z 2026. Las casillas indican las posibles estructuras de glicanos. Los números sobre los fragmentos indican de qué estructura de glicanos podrían derivarse. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Para estudiar los glicanos, los investigadores emplean una variedad de metodologías, que van desde el uso de lectinas para identificar epítopos específicos hasta la cromatografía líquida más sofisticada, la espectrometría de masas en tándem (LC-MS) y la resonancia magnética nuclear (RMN) para obtener una caracterización detallada de las estructuras de los glicanos. Las principales ventajas de MALDI-TOF MS sobre los enfoques alternativos son la sensibilidad y la naturaleza de alto rendimiento del método¹³. Sin embargo, como no hay capacidad para separar compuestos isobáricos, diferentes estructuras de glicanos con el mismo valor m/z producen una mezcla de fragmentos bajo MS/MS que luego es difícil de deconvoluciar¹³. Si se requiere determinar la estructura exacta de los mucinglicanos, la LC-MS debe ser el método de elección.

Aquí, presentamos un protocolo para el análisis de mucina glicanos por MALDI-TOF MS que incluye todos los pasos críticos del proceso, desde la liberación de glicanos, la desalinización y la permetilación, hasta la adquisición y análisis de datos. Es importante reconocer que cada uno de estos pasos se puede llevar a cabo utilizando diferentes enfoques, y todos tienen sus ventajas y limitaciones asociadas.

En este protocolo, utilizamos la eliminación reductiva β para liberar los glicanos. La reacción tiene lugar en condiciones básicas. Si las muestras de mucina ya están en suspensión y no han sido purificadas previamente, el pH debe controlarse con un papel indicador de pH; si es ácido, debe aumentarse a un pH de ~ 8-9. Una limitación de este enfoque es que las condiciones básicas requeridas para la liberación de los glicanos también conducen a la hidrólisis y, por lo tanto, a la pérdida de los grupos O-acetilo que a menudo se encuentran en los ácidos siálicos, en una reacción conocida como saponificación.

Si bien se han descrito otros métodos en la literatura para la liberación de glicanos 15,16,17,18, algunos de los cuales pueden preservar los grupos O-acetilo lábiles, la eliminación β reductiva sigue siendo el estándar de oro en el campo. Este enfoque requiere una alta concentración de sales. Las sales y otros contaminantes de supresión de iones deben eliminarse antes del análisis MALDI-TOF¹⁹, ya que pueden afectar la eficiencia de ionización y la cuantificación de los glicanos. En este caso, la cromatografía de intercambio catiónico, seguida de la eliminación del borato por evaporación de metanol, demostró ser el enfoque más eficiente para desalinizar los glicanos liberados de la mucina. En este caso, los glicanos no interactúan con la resina y, en cambio, fluyen a través de ella, mientras que los iones de sodio quedan atrapados en la resina. Sin embargo, la preparación de las columnas de intercambio iónico es laboriosa y hace que este enfoque sea ineficiente para experimentos a gran escala con numerosas muestras. En tales casos, se puede preferir la desalinización con PGC, ya que esta resina también está disponible en un formato de placa de 96 pocillos. Sin embargo, como se ha presentado anteriormente, la desalinización por extracción con PGC puede dar lugar a una elución ineficiente, en particular de glicanos más grandes, y esto debe tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados.

Aunque los glicanos nativos también pueden ser analizados por MALDI-TOF, generalmente se emplea la permetilación, ya que esta reacción aumenta significativamente la sensibilidad de detección, ya que los glicanos nativos tienen una baja eficiencia de ionización²⁰. Además, la permetilación hace que los glicanos cargados negativamente, como los glicanos sulfatados o sialilados, sean más fáciles de detectar en modo positivo y conserva los epítopos de glicanos lábiles, como los ácidos siálicos o la fucosa²⁰. Lo más común es que la permetilación se mantenga durante 5-10 min^14,21, con algunos informes que permiten que la reacción continúe hasta 40 min²². Aquí, demostramos que, en las condiciones probadas, los glicanos sialilados no se detectaron de manera eficiente después de 5 min de permetilación, y se requirió una incubación más larga.

Además del tiempo de reacción, otro factor que puede afectar la eficiencia de la permetilación es el contenido de agua en la reacción. La presencia de agua puede conducir a una submetilación o metilación parcial de los glicanos, donde no todos los grupos hidroxilo se han convertido en grupos metilo²³. Esto se puede determinar fácilmente, ya que si se ha producido una submetilación, se pueden observar grupos de picos que difieren en 14 Da (la diferencia de masa entre los grupos hidroxilo y metilo) en los espectros de masas. Este problema se puede solucionar repitiendo la reacción de permetilación y volviendo a analizar los datos.

Un factor limitante en el análisis de glicanos es la interpretación de los espectros. A pesar de los avances recientes, este proceso sigue siendo en gran medida manual y requiere un buen conocimiento y comprensión de las vías biosintéticas de los glicanos para anotar con precisión los espectros. Herramientas como Glycoworkbench²⁴ pueden ayudar proporcionando posibles anotaciones, estructuras de glicanos y composiciones, pero debido a la heterogeneidad inherente de las mezclas de glicanos, los investigadores aún deben tomar la decisión de cuál opción es la correcta. En el ejemplo presentado anteriormente usando PGM, Glycoworkbench ofreció dos composiciones potenciales de glicanos para el pico en mz 2,025.7620, y basándonos en el perfil de fragmentación, concluimos que la estructura fucosilada estaba presente, en lugar de la sialilada. Sin embargo, si no se disponía de un espectro de fragmentación (que suele ser el caso de los glicanos de baja abundancia), los investigadores pueden basar la anotación en el conocimiento de que los glicanos con una composición de Hex3HexNAc1Neu5Ac3 se encuentran en gangliósidos, en lugar de mucinas, y por lo tanto esta opción no debe considerarse en el contexto de la PGM. Por lo tanto, las estructuras o composiciones de glicanos identificadas deben tener referencias cruzadas con publicaciones anteriores y deben estar de acuerdo con los principios de la biosíntesis de o-glicanos. En general, este protocolo sirve como un recurso valioso, especialmente para los investigadores que son nuevos en el campo de la glicobiología y con interés en el estudio de las interacciones que ocurren en la interfaz de la mucosa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipetas pasteur de vidrio de 150 mm	Fisher Scientific	15202699	Consumibles Referencia en el texto (si procede): pipeta de vidrio
Tubos de 5 mL	Eppendorf	30122305	Consumibles
Placa de extracción HLB de 96 pozos	Fisher Scientific	16553290	Consumibles
ácido acético	Sigma-Aldrich	A6283	Reactivo
acetonitrilo	Fisher Scientific	15624520	Reactivo
DMSO anhidro	Sigma-Aldrich	5.89569	Reactivo
Metanol anhidro	Sigma-Aldrich	5.89596	Reactivo
Espectrómetro de masas Autoflex	Bruker		Equipo
DOWEX 50w x8 resina, forma H+, malla 200-400	Sigma-Aldrich	44519	Reactivo Referencia en el texto (si procede): resina de intercambio catiónico
Calefactor de bloque seco	Subvención	QBD2	Equipo
Evaporador/Concentrador para calentadores de bloque	Cole-Palmer	WZ-36610-99	Equipo
flexAnalysis	Bruker		Software, propietario
flexControl	Bruker		Software, propietario
Genevac EZ-2	Biofarmacéutica	EZ-2	Equipamiento Referencia en el texto (si procede): evaporador centrífugo
viales de vidrio con tapas de PTFE a juego (4 mL)	Wheaton	DWKW224582-144EA	Consumibles
viales de vidrio con tapas de PTFE a juego (8 mL)	Fisher Scientific	11587413	Consumibles
lana de vidrio	Supelco	1.04086	Consumibles
Banco de trabajo de glucosa	NA		Software; descargable desde https://glycoworkbench.software.informer.com/
Cartuchos HLB SPE	Supelco	57493-U	Consumible, como alternativa a la placa de extracción HLB de 96 pozos
Iodometano	Sigma-Aldrich	289566	Reactivo
Placa objetivo MALDI	Bruker		Equipo
Liofilizador ModulyoD	Thermo Fisher	ModulyoD-230	Equipamiento Referencia en el texto (si procede): liofilizadora
NaBH4	Sigma-Aldrich	452882	Reactivo
Pellets NaOH	Sigma-Aldrich	567530	Reactivo
Solución NaOH 50%	Sigma-Aldrich	415413	Reactivo
Procesador de presión positiva-96	Aguas	186006961	Equipo
super DHB	Sigma-Aldrich	50862	Reactivo
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508	Reactivo